專利名稱：多角體基因前180bp片段及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及多角體基因前ISObp片段及其應用。
背景技術：
家香(Bombyx mori)多角體蛋白(Polyhedrin, Polh)基因共有738個核苷酸,編碼由245個氨基酸組成的大小為29 kD的多肽，是多角體的主要結構成份。多角體蛋白構成的蛋白質晶體對包埋在其中的病毒體具有保護作用，它使病毒體在自然環境中保持穩定和侵染能力。多角體蛋白基因是一個超表達極晚期基因。在病毒感染的晚期，當其它病毒基因和宿主基因關閉后，此基因能持續高水平表達，在受感染細胞內產生的多角體蛋 白的量可達細胞蛋白質總量的25% 50%。近20年來，人們都致力于研究多角體蛋白基因的高效表達機制，并且利用它的這種特性使許多外源基因得到了高效表達，尤其是一些難以表達的蛋白例如膜蛋白。家蠶核型多角體病毒的多角體蛋白具有它獨特的性質，在大腸桿菌中表達的多角體蛋白在中性PH值條件下以包涵體的形式存在，只有在堿性條件(pH值10. 8及以上)下可溶，并且這種多角體蛋白具有與天然多角體蛋白晶體相同的性質。因此，可將目的蛋白基因與其融合表達，一方面能提高目的蛋白的表達量，另一方面，通過簡單的PH梯度洗脫和差速離心的方法就可以獲得較純的融合蛋白，再經過特異性蛋白酶酶切消化，回收得到較純的目的蛋白。但是，目前采用多角體融合外源蛋白表達時，由于多角體只有在堿性條件下才可溶，而在用蛋白酶進行酶切融合蛋白而獲得單獨的目的蛋白的過程中，蛋白酶反應的最適合PH值一般是中性(pH值疒9)條件下，這樣就造成了無法簡單地在酶最適的條件下通過酶切獲得單純的目的蛋白，而堿性條件下進行酶切時，蛋白酶就會喪失活性或者無法達到最大活性，所得到的目的蛋白的量也受到限制。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了家蠶多角體蛋白基因片段，該片段與目的基因融合表達后，除了能夠滿足大量表達的要求外，其溶解性質也發生改變，在蛋白酶適宜的PH值范圍內即可溶解，大大簡化了酶切及純化步驟。本發明的多角體蛋白基因前180bp片段，核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。上述多角體蛋白基因前180bp片段在蛋白融合表達中的應用。—種表達載體，是由出發載體的多克隆位點依次插入所述多角體蛋白基因前ISObp片段和蛋白酶酶切位點片段構建而成。融合蛋白表達后用相應的蛋白酶進行酶切，獲得目的蛋白。優選地，所述出發載體為pET系列載體、pcDNA3系列載體、pFastBac 系列載體、PKK系列載體或pBAD系列載體。其中pET系列載體的pET_28a為最佳。優選地，所述的蛋白酶酶切位點片段為凝血酶酶切位點片段。所述凝血酶酶切位點片段核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一種融合蛋白表達載體，是在出發載體的多克隆位點依次插入上述多角體蛋白基因前ISObp片段、蛋白酶酶切位點片段和目的基因片段構建而成。優選地，所述目的基因為EGFP (增強型綠色熒光蛋白，Enhanced GreenFluorescent Protein)基因、LZM (溶菌酶，lysozyme)基因或MMgT (家蠶膜鎂轉運蛋白，membrane magnesium transporter protein) _因等。一種基因工程菌，包括上述融合蛋白表達載體。優選地，該基因工程菌為大腸桿菌。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
本發明在多角體基因polh的基礎上發現其部分序列比其全長序列具有更優異的性質，可以與其他目的基因共同表達融合蛋白，不但能夠實現提高表達量的效果，還可以增加 融合蛋白在中性PH值條件下的溶解性，使其適用于蛋白酶酶切功能的最佳pH值，大大方便了目的蛋白的獲取。


圖I 是 pET-28a-polhl80_EGFP 質粒圖譜。圖2是多角體基因前180pb片段的PCR產物電泳圖；其中，M:核酸分子量標準；1 目的基因PCR產物。圖3 是 EGFP 的 PCR 擴增圖，M marker ； I EGFP 擴增產物。圖4是重組表達載體鑒定圖，其中，M:核酸分子量標準；1 :EGFP基因PCR產物；2 :重組表達載體pET-28a-polhl80-EGFP經AcoR I和通o I酶切后產物條帶。圖5是pET-28a-polhl80_EGFP蛋白表達結果，M :蛋白分子量標準；I :pET-28a-polhl80-EGFP未誘導；2: pET-28a-polhl80_EGFP誘導；3 :pET_28a-poIh-EGFP誘導；4 pET-28a-EGFP 誘導。圖6是poIh 180-EGFP融合蛋白溶解性分析圖；其中，I、3、5、7、9、11、13是溶液pH為 8. 0,8. 4,9. 2,9. 6,10. 0,10. 4,10. 8 時的上清；2、4、6、8、10、12、14 是溶液 pH 為 8. 0,8. 4、9. 2,9. 6、10. O、10. 4、10. 8 時的沉淀。圖7是polhl80_EGFP蛋白溶液使用Gly回調pH值的電泳圖；其中，M:蛋白分子量標準；5 polhl80-EGFP 上清(pH10. 8) ；6 :polhl80_EGFP 上清(pH9. 0) ；7 :polhl80_EGFP上清(pH8.0) ;8 :polhl80-EGFP 沉淀(pH8. 0) ;9 :polh_EGFP 上清(pH10. 8) ；10 poIh-EGFP 沉淀(pH10. 8)。圖8是polhl80_EGFP融合蛋白經過凝血酶酶切后的電泳結果圖，其中M :蛋白分子量標準；1 pH7. 6時的上清原樣；2 pH7. 6時凝血酶酶切后的樣品。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好地理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。以下實施例中使用的生物材料如家蠶核型多角體病毒、載體pET_28a、質粒PGEX-4T-1-EGFP和E. coli TGl均購自特菲(天津)生物醫藥科技有限公司。實施例I :構建表達載體pET28a-/ o7A180(I )/7o7A基因序列已知，可以使用任何含有該基因片段的質粒或例如病毒等其他生物材料作為模版，本實施例以家蠶核型多角體病毒(BmNPV)基因組為模板擴增多角體基因前ISObp的片段。引物設計如下:
上游引物 F :5’-CGCGGATCCATGCCGAATTAITCATACAC-3’ (SEQ ID NO: 3，方框內為 I酶切位點)；
下游引物R :
5’_ GGCGAATTCCTCGTTCCTCGTGGTTCTAAAGG GATCTTCGGCAA-3’ (SEQ ID NO:4，方框內為 I酶切位點，下劃線部分為凝血酶酶切位點)。(2)多角體蛋白基因前180bp片段擴增
以病毒基因組為模板，步驟(I)的F和R序列為引物，進行PCR擴增。PCR反應體系在IOOu L的離心管中，加入下列組分
10 .■+: Taq Buffer I5 uL
2.5mM dKTPsSuL
Taq DKA p eras e1.5 uL
FI uL
RI uL
模板I吣
無菌取蒸水—
總體枳50成
各組分混勻后，放入PCR儀中，反應參數設計為94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C復性延伸20s，30個循環，72°C延伸3min。按上述反應參數設計30個循環。待反應結束后，電泳鑒定擴增片段(見圖2)，同時切膠回收目的片段。擴增產物大小為180bp，經測序，與GenBank登錄號JQ291703. I序列中前180bp —致。(3)上述得到的PCR產物經及I和及雙酶切后的基因片段克隆至經及
I和及雙酶切的載體pET-28a中，使PCR擴增的基因連接到載體pET_28a上，構建成重組載體pET-28a-polhl80，經酶切分析鑒定基因序列完全正確。實例2 :融合表達EGFP
(I)擴增EGFP基因序列
EGFP基因序列參見GenBank登錄號JQ969017. 1，為已知序列，可以使用任何含有該基因片段的生物材料作為擴增模版，為方便操作，本實施例以質粒PGEX-4T-1-EGFP為模板，設計引物擴增EGFP基因片段。用Primer5. 0設計的EGFP基因ORF序列引物如下
上游引物 F’:5’ - GCCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA -3' (SEQ ID NO: 5，方框內為EcoRI酶切位點)；
下游引物 R’5’-CCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’ (SEQ ID N0:6，方框內為ZAo
I酶切位點)。PCR反應體系在100 u L的離心管中，加入下列組分
權利要求
1.多角體蛋白基因前180bp片段，其特征在于，核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.權利要求1所述的多角體蛋白基因前180bp片段在蛋白融合表達中的應用。
3.—種表達載體，其特征在于，由出發載體的多克隆位點依次插入權利要求1所述的多角體蛋白基因前180bp片段和蛋白酶酶切位點片段構建而成。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在干，所述出發載體為pET系列載體、pcDNA3系列載體、pFastBac 系列載體、pKK系列載體或pBAD系列載體。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述出發載體為pET-28a。
6.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于，所述的蛋白酶酶切位點片段為凝血酶酶切位點片段，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
7.ー種融合蛋白表達載體，其特征在于，在出發載體的多克隆位點依次插入權利要求1所述的多角體蛋白基因前180bp片段、蛋白酶酶切位點片段和目的基因片段構建而成。
8.根據權利要求7所述的融合蛋白表達載體，其特征在于，所述目的基因為EGFP基因、LZM基因、ORAI基因或MMgT基因。
9.ー種基因工程菌，其特征在于，包括權利要求7所述的融合蛋白表達載體。
10.根據權利要求9所述的基因工程菌，其特征在干，該基因工程菌為大腸桿菌。
全文摘要
本發明公開了多角體基因前180bp片段及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明的多角體基因前180bp片段核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。該片段可以應用于融合蛋白的表達。本發明還公開了一種表達載體，由出發載體的多克隆位點依次插入上述片段和蛋白酶酶切位點片段構建而成。本發明的多角體基因前180bp序列比其全長序列具有更優異的性質，可以與其他目的基因連接表達融合蛋白，不但能夠實現提高表達量的效果，還可以增加融合蛋白在中性pH值條件下的溶解性，使其適用于蛋白酶酶切功能的最佳pH值，大大方便了目的蛋白的獲取。
文檔編號C12N15/12GK102952807SQ20121045334
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者張耀洲, 耿文杰, 畢臻樂, 舒特俊, 陳劍清 申請人:天津耀宇生物技術有限公司