專利名稱：一種基于群感效應(yīng)機(jī)制增加微生物洛伐他汀產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥原料發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域，具體涉及一種增加微生物洛伐他汀產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
洛伐他汀是一種能抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成的化合物，具有降低膽固醇和甘油三酯的作用，是一種常用的降脂藥物，也是其他他汀類藥物的前體。洛伐他汀作為藥物或藥物原料，主要由土曲霉液體深層發(fā)酵生產(chǎn)，而作為保健食品功能成分是將紅曲霉接種在蒸煮后的大米中，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵而獲得。現(xiàn)有提高洛伐他汀產(chǎn)量的方法主要有菌株選育、培養(yǎng)基組分優(yōu)化、發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化調(diào)整等，經(jīng)過長期廣泛的實(shí)驗(yàn)研究及生產(chǎn)實(shí)踐探索，以上方法近年來在提高洛伐他汀產(chǎn)量方面已沒有明顯成效。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中微生物發(fā)酵過程中洛伐他汀產(chǎn)量增加不顯著的問題，本發(fā)明所要解決的首要技術(shù)問題在于提供一種在微生物發(fā)酵過程中提高洛伐他汀產(chǎn)量的方法。本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
一種增加微生物洛伐他汀產(chǎn)量的方法，其方法為在用于發(fā)酵的培養(yǎng)基中添加不飽和脂肪酸；其中所述的微生物為土曲霉(Aspergi Ilus terreus)或紅曲霉iMonascuspurpureus, Monascus rubber， Monascus fuliginoscus)。作為一種優(yōu)選方案，在用于發(fā)酵的培養(yǎng)基中添加植物油或植物油脂肪酶酶解產(chǎn)物或二者的混合。作為一種優(yōu)選方案，所述的植物油脂肪酶酶解產(chǎn)物是通過如下方法制備得到在植物油中加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl緩沖液)和適量的脂肪酶，280C 35°C攪拌反應(yīng)O. 5 2. O小時(shí)。作為一種優(yōu)選方案，所述的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的用量是植物油體積的4倍，所述三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的PH為7. 5^8. O。作為一種優(yōu)選方案，所述的植物油為花生油、菜籽油、大豆油、葵瓜子油、玉米胚芽油、橄欖油、棉籽油和棕櫚油中的一種或二種以上的混合。作為一種優(yōu)選方案，所述的微生物發(fā)酵其發(fā)酵方式為液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵。作為一種優(yōu)選方案，所述的不飽和脂肪酸的添加量為培養(yǎng)基總重量的O. 3^5. 0%。作為一種最優(yōu)選方案，所述的不飽和脂肪酸的添加量為培養(yǎng)基總重量的
O.4^4. 0%。作為一種優(yōu)選方案，所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產(chǎn)物的添加量為培養(yǎng)基體積或重量的O. 5% 5· 0%。
作為一種優(yōu)選方案，所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產(chǎn)物添加的時(shí)間為發(fā)酵開始至發(fā)酵結(jié)束前2天的任何時(shí)間。作為一種優(yōu)選方案，所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產(chǎn)物為一次性添加或分多次添加。植物油及其脂肪酶酶解產(chǎn)物中的不飽和脂肪酸經(jīng)微生物代謝產(chǎn)生氧脂素，氧脂素作為真菌(如土曲霉、紅曲霉)群感效應(yīng)的信號(hào)分子，調(diào)控洛伐他汀生物合成。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果為利用本發(fā)明所述的方法，可以使微生物在發(fā)酵過程中的洛伐他汀產(chǎn)量顯著提高；其中土曲霉液體深層發(fā)酵洛伐他汀產(chǎn)量可增加15°/Γ20%，紅曲霉固態(tài)發(fā)酵洛伐他汀產(chǎn)量可增加18 25%。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例對(duì)發(fā)明不做任何形式的限定。以下對(duì)比例及實(shí)施例中使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件為
(1)土曲霉斜面培養(yǎng)基(8/1):蔗糖 30g，NaNO3 3g，K2HP04 lg，MgSO4 · 7H20 O. 5g, KCl
0.5g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. Olg，瓊脂 15g。(2) 土曲霉種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50g,酵母膏IOg,蛋白胨20g, NaCl lg, pH7.2-7. 5。28°C培養(yǎng) 50 小時(shí)。(3) 土曲霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80g,大豆粉25g,蛋白胨15g,NaCl lg,pH自然。土曲霉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)使用500mL三角瓶，接種量10%，裝液量10%，搖床轉(zhuǎn)速 180rpm，28°C培養(yǎng) 12 天。(4)紅曲霉斜面培養(yǎng)基(g/L) :20%馬鈴薯濾液，葡萄糖20g，瓊脂粉15g。(5)紅曲霉種子培養(yǎng)基(g/L) :20%馬鈴薯濾液，葡萄糖50g。28°C培養(yǎng)50小時(shí)
(6)紅曲霉米飯培養(yǎng)基大米50g，水50ml，滅菌，冷卻。紅曲霉固態(tài)發(fā)酵紅曲霉接種
到米飯培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)12天。培養(yǎng)基變干時(shí)適量補(bǔ)水。對(duì)比例I
(1)菌種活化將土曲霉(CICC2453)接種到土曲霉斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)3天，活化菌
種；
(2)種子液制備將活化好的菌種接種到土曲霉種子培養(yǎng)基28°C、180rpm培養(yǎng)50小時(shí)，獲得種子液；
(3)液體深層發(fā)酵500mL三角瓶裝土曲霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，接種5mL，28°C、180rpm培養(yǎng)12天；
(4)高效液相色譜法測定發(fā)酵液中洛伐他汀含量Waters2695 /2996液相色譜儀，Dikma Diamonsil C18 色譜柱(4. 6 mmX 250mm, 5 μ m),柱溫 30°C,檢測波長 238 nm,進(jìn)樣體積20yL，甲醇-18 mmol/L磷酸水溶液(體積比80 20)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min。取發(fā)酵液5mL,加入5mL甲醇,25°C、150rpm振蕩3h, IOOOOrpm離心IOmin,上清液用高效液相色譜法(外標(biāo)法)測定洛伐他汀含量；
(5)本對(duì)比例發(fā)酵液中洛伐他汀含量為685mg/L。實(shí)施例I(O菌種活化同對(duì)比例I中的步驟(I);種子液制備同對(duì)比例I中的步驟(2)；
(2)液體深層發(fā)酵500mL三角瓶裝土曲霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，添加花生油I.5 mL,接種 5mL, 28 °C、180rpm 培養(yǎng) 12 天；
(3)高效液相色譜法測定發(fā)酵液中洛伐他汀含量同對(duì)比例I中的步驟(4)；
(4)本實(shí)施例發(fā)酵液中洛伐他汀含量為795mg/L。實(shí)施例2
Cl)菌種活化同對(duì)比例I中的步驟(I);種子液制備同對(duì)比例I中的步驟(2)；
(2)液體深層發(fā)酵500mL三角瓶裝土曲霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，接種5mL，28V、ISOrpm培養(yǎng)12天；并于發(fā)酵的第3天、第6天和第9天，在培養(yǎng)液中添加玉米胚芽油各O. 8mL ；
(3)高效液相色譜法測定發(fā)酵液中洛伐他汀含量同對(duì)比例I中的步驟(4)；
(4)本實(shí)施例發(fā)酵液中洛伐他汀含量為820mg/L。對(duì)比例2
(1)菌種活化將紅曲霉(CICC5031)接種到紅曲霉斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)3天，活化菌
種；
(2)種子液制備將活化好的菌種接種到紅曲霉種子培養(yǎng)基28°C、180rpm培養(yǎng)50小時(shí)，獲得種子液；
(3)紅曲霉固態(tài)發(fā)酵紅曲霉種子液IOmL接種到100克米飯培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)12天，發(fā)酵結(jié)束，60°C真空干燥得紅曲米；
(4)高效液相色譜法測定洛伐他汀含量Waters2695 /2996液相色譜儀，DikmaDiamonsil C18 色譜柱(4. 6 _X 250mm, 5 μ m),柱溫 3CTC,檢測波長 238 nm,進(jìn)樣體積20 μ L，甲醇-18 mmol/L磷酸水溶液(體積比80 20)為流動(dòng)相，流速為I. O mL/min。紅曲米研磨粉碎，取O. 5g,加甲醇5. OmL,浸泡3h,然后于IOOOOrpm離心IOmin,上清液用高效液相色譜法(外標(biāo)法)測定洛伐他汀含量；
(5)本對(duì)比例紅曲米洛伐他汀含量為9.lmg/g。實(shí)施例3
(1)菌種活化同對(duì)比例2中的步驟(I);種子液制備同對(duì)比例2中的步驟(2)；
(2)大豆油酶解10mL大豆油加入 40mL Tris-HCl (60mmol/L CaCl2,ρΗ7· 5_8· O)緩沖液和1000U脂肪酶，35°C攪拌反應(yīng)I小時(shí)，獲得大豆油酶解液；
(3)紅曲霉固態(tài)發(fā)酵100克米飯培養(yǎng)基接種紅曲霉種子液IOmL，在發(fā)酵第8天加5mL大豆油酶解液，28°C恒溫培養(yǎng)12天；發(fā)酵結(jié)束，60°C真空干燥得紅曲米；
(4)高效液相色譜法測定紅曲米洛伐他汀含量同對(duì)比例2中的步驟(4)；
(5)本實(shí)施例紅曲米洛伐他汀含量為11.4mg/g。實(shí)施例4
Cl)菌種活化同對(duì)比例2中的步驟(I);種子液制備同對(duì)比例2中的步驟(2)；
(2)菜籽油酶解10mL大豆油加入 40mL Tris-HCl (60mmol/L CaCl2, ρΗ7· 5_8· O)緩沖液和1000U脂肪酶，35°C攪拌反應(yīng)I小時(shí)，獲得菜籽油酶解液；
(3)紅曲霉固態(tài)發(fā)酵100克米飯培養(yǎng)基接種紅曲霉種子液10mL，28°C恒溫培養(yǎng)12天，在發(fā)酵第4天、第7天和第10天各加ImL菜籽油酶解液；發(fā)酵結(jié)束，60°C真空干燥得紅曲米；
(4)高效液相色譜法測定紅曲米洛伐他汀含量同對(duì)比例2中的步驟(4)；本實(shí)施例紅曲米洛伐他汀含量為10. 9mg/g。
權(quán)利要求
1.一種增加微生物洛伐他汀產(chǎn)量的方法，其特征在于，在用于發(fā)酵的培養(yǎng)基中添加不飽和脂肪酸；其中所述的微生物為土曲霉或紅曲霉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在用于發(fā)酵的培養(yǎng)基中添加植物油或植物油脂肪酶酶解產(chǎn)物或二者的混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的植物油脂肪酶酶解產(chǎn)物是通過如下方法制備得到在植物油中加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液和脂肪酶，28°C 35°C攪拌反應(yīng)O. 5 2. O小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的用量是植物油體積的4倍，所述三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的PH為7. 5^8. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求2 4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的植物油為花生油、菜籽油、大豆油、葵瓜子油、玉米胚芽油、橄欖油、棉籽油和棕櫚油中的一種或二種以上的混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的微生物發(fā)酵其發(fā)酵方式為液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的不飽和脂肪酸的添加量為培養(yǎng)基總重量的O. 3 5. 0%。
8.根據(jù)權(quán)利要求2 4或6所述的方法，其特征在于所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產(chǎn)物的添加量為培養(yǎng)基體積或重量的O. 59Γ5. 0%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產(chǎn)物添加的時(shí)間為發(fā)酵開始至發(fā)酵結(jié)束前2天的任何時(shí)間。
10.根據(jù)權(quán)利要求2或9所述的方法，其特征在于所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產(chǎn)物為一次性添加或分多次添加。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于群感效應(yīng)機(jī)制增加微生物洛伐他汀產(chǎn)量的方法。其方法為在用于發(fā)酵的培養(yǎng)基中添加不飽和脂肪酸；其中所述的微生物為土曲霉或紅曲霉。利用本發(fā)明所述的方法，可以使微生物在發(fā)酵過程中的洛伐他汀產(chǎn)量顯著提高；其中土曲霉液體深層發(fā)酵洛伐他汀產(chǎn)量可增加15%~20%，紅曲霉固態(tài)發(fā)酵洛伐他汀產(chǎn)量可增加18~25%。
文檔編號(hào)C12R1/66GK102925509SQ20121045620
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者李浩明 申請(qǐng)人:廣東藥學(xué)院