專利名稱：一種含有vegfa基因3′utr和報告基因的重組質粒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組質粒，具體地，涉及一種含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒。
背景技術：
VEGFA 的全稱為 vascular endothelial growth factor A,其中文名為血管內皮生長因子A。血管生成刺激因素包括有一類稱為“血管生成因子(antigenic growthfactors) ”的細胞因子，起著刺激新血管形成的作用。目前已經發現了一些血管生成刺激因子，如血小板源性生長因子(TOGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)、轉換生長因子(TGF)、血管內皮細胞生長因子A(VEGFA)等，其中在腫瘤血管生成中起關鍵作用的是VEGFA。VEGFA蛋白由腫瘤細胞、巨噬細胞及纖維母細胞等分泌，廣泛分布于人體許多組織，如腺體、肺、肝、腎、心肌等，但表達水平極低，其作用僅維持正常血管密度和基本滲透功能，維持營養物質。當出現腫瘤細胞之后，其表達水平一般會大大上升。有研究表明，VEGFA與腫瘤侵染性相關，與腫瘤易感性亦相關。VEGFA的主要功能包括(I)選擇性增強血管內皮細胞有絲分裂,刺激內皮細胞增殖并促進血管形成。(2 )升高血管尤其是微小血管的滲透性，使血漿大分子外滲沉積在血管外基質中，為腫瘤細胞的生長和新生毛細血管網的建立提供營養。隨著人類基因組計劃的完成和模式生物基因組計劃的進行，人們對于占人類基因組95%以上的非編碼序列的研究日益加強，研究發現它們中很多是具有生物學功能和意義的片段，在這些研究之中，對于大小約21-23個堿基的單鏈小分子RNA的microRNA的研究則是最為熱點之一。在近幾年中的腫瘤的研究中，有關于microRNA對于腫瘤的功能與調控的研究一直是腫瘤治療領域的熱點之一，同時也取得了很大的突破與進展。目前研究表明，microRNA主要是通過結合到靶標基因的3' UTR區域，進而抑制靶標基因的轉錄，因此基因的3' UTR的抑制程度能夠指示該基因受到miCToRNA抑制的水平。然而，現階段對于血管生成與microRNA的相關研究報道并不多見,而對于VEGFA蛋白與microRNA的研究就更為少見了，同時目前也沒有一種簡便，快捷的方法來篩選能夠抑制多藥耐藥蛋白的microRNAο

發明內容
本發明的目的是提供一種含有血管內皮成長因子A (VEGFA)基因3' UTR序列和報告基因的重組質粒，可以用于血管生成相關的miCToRNA的篩選。為了達到上述目的，本發明提供了一種含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒，其中，所述的報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。上述的含有VEGFA基因3丨UTR和報告基因的重組質粒，其中，所述的重組質粒的制備方法包含步驟I，對載體質粒進行擴增和抽提；步驟2，對VEGFA基因的3' UTR序列進行克隆、酶切及純化；步驟3，進行所述的VEGFA基因的3' UTR序列與所述的載體質粒的連接；步驟4，篩選重組子。上述的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒，其中，所述的步驟I包含用所述的載體質粒轉化大腸桿菌感受態細胞，進行擴增；然后采用堿裂解法抽提制備所述的載體質粒，電泳檢測所述載體質粒的純度和含量；再用NcoI和HindIII對所述載體質粒進行酶切，試劑盒凝膠回收大片段的酶切產物。堿裂解法是提取質粒的最常用也最有效的方法，是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異達到分離目的。其原理是高PH使質粒DNA和染色體DNA變性，同時沉淀蛋白質。再將pH值調至中性，質粒DNA較小，很容易復性成雙鏈。而染色體DNA較大，不會復性，纏結成網狀不溶物質，從而可以通過離心除去。具體方法為依次加入下面三種溶液，然后進行離心:溶液I :葡萄糖50 mmol/L,EDTA 100 mmol/L,Tris-Cl 25 mmol/L,溶菌酶 5mg/ml，調整 pH 為 8· O ;溶液 2 NaOH O. 2 mol/L, SDS 1% ;溶液 3 5 mol/L KAc 60 ml,冰乙酸11.5 ml，重蒸水28.5 ml。其中溶液I作用主要是懸浮菌體，溶液2作用是裂解菌體，釋放胞內物質，溶液3是沉淀染色體DNA。上述的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒，其中，所述的步驟2包含步驟2.1，根據人的VEGFA基因的3' UTR區序列設計兩端引物引物I為上游5'端引物，其中包含19個VEGFA基因的3' UTR互補堿基，一個HindIII識別位點，3個保護堿基；弓丨物2為下游3'端引物，其中包含19個VEGFA基因3' UTR互補堿基，一個NcoI識別位點，4個保護堿基。步驟2. 2，以基因組DNA為模板，利用常規PCR反應進行擴增；步驟2. 3，反應結束后，取5μ I反應產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測；步驟2. 4，取反應產物，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，用凝膠回收試劑盒回收；步驟2. 5，將回收的PCR產物用NcoI和HindIII雙酶切，再次回收以備連接使用。上述的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒，其中，所述的引物I為5’ - CCCAAGCTTCTCACCAGGAAAGACTGAT-3’，其中 AAGCTT 為 HindIII 識別位點。上述的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒，其中，所述的引物2為5’ - CATGCCATGGAACTCAAGTCCACAGCAGT -3’，其中 CCATGG 為 NcoI 識別位點。上述的含有VEGFA基因:V UTR和報告基因的重組質粒，其中，所述的PCR反應，采用ExTaq DNA聚合酶，反應條件為在95°C預變性3min，再在95°C變性30s，然后在55°C退火45s，再在72°C延伸Imin ;進行40個循環，最后在72°C最終延伸5min，擴增完后于4°C長期保溫。上述的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒，其中，所述的步驟3的連接是所述的步驟3的連接采用DNA連接試劑盒，進行連接反應，16°C過夜。上述的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒，其中，所述的步驟4包含取連接產物直接轉化感受態大腸桿菌；經過含有氨芐青霉素的LB培養基中選擇培養；從培養平板上隨機挑取菌落，擴增培養后用堿裂解法提取質粒備用；最后經過酶切、PCR、測序鑒定。上述的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒，其中，所述的重組質粒可以用于檢測microRNA抑制VEGFA基因表達的作用影響。本發明提供的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒具有以下優點
(I)本發明在后續應用中，具有靈敏度高、檢測速度快、費用低、不需使用放射性同位素等優點。(2)本發明同時具有靶向性的特點，能夠用來特異性檢測microRNA抑制基因3'UTR的活性。(3)本發明還能夠克服轉染效率對結果的影響。


圖I為本發明的VEGFA基因3' UTR序列克隆產物的電泳示意圖。圖2為本發明的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒NcoI和HindIII 雙酶切檢測的電泳示意圖。圖3為本發明的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒的測序結果與基因庫所查序列的比對圖。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步地說明。實施例一
一.菌株、質粒以及試劑等的準備。菌株大腸桿菌E. coli感受態細胞DH5a由實驗室凍存。質粒pGL3_promoter為實驗室保存。試劑
ExTaq DNA聚合酶，限制性內切酶Hindlll、NcoI和DNA連接試劑盒(DNA LigationKit)購自TaKaRa公司。DL2000 分子標記(DL2000 marker )和 λ DNA/Hind III 分子標記(λ DNA/Hind IIImarker)購自上海MajorBio公司。質粒回收試劑盒和DNA片段回收試劑盒購自北京TIANGEN公司。其余試劑購自上海MajorBio公司。LB培養基的配制
配制1000 ml LB培養基稱取細菌培養用胰蛋白胨10 g，細菌培養用酵母提取物5 g，NaCl 10 g并溶解于950 ml去離子水中。用5 M NaOH調節pH值至7. O。高壓蒸汽滅菌20min。鋪制平板的培養基應先按照上面方法配置液體LB培養基，滅菌前加入瓊脂15 g/L。在超凈工作臺中將未凝固的培養基倒入培養皿中。含氨芐LB培養基即在上述培養基高溫高壓滅菌后，冷卻至60°C左右。每1000mlLB 培養基加入 Iml Ampicillin (100mg/ml),4°C保存。二 ·重組質粒的構建。步驟一 pGL3_promoter質粒的轉化、大量擴增、抽提。I.用pGL3_promoter質粒轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。(I)事先將恒溫水浴鍋的溫度調到42 V .
(2)從-80°C超低溫冰柜中取出一管(200 μ L)感受態菌，冰浴融化。 (3)加入
5μ I質粒(DNA含量不超過IOOng)，輕輕混勻后放置冰上30min。
(4)從冰中取出，放入42°C恒溫水浴鍋中水浴中進行熱激I. 5min,然后迅速放回冰中，靜置5min。(5)在超凈工作臺中向上述管中加入Iml LB培養基(不含抗菌素)輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37°C震蕩lh。(6)在超凈工作臺中取上述轉化混合液200 μ L，滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻(注意玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂)。(7)在涂好的培養皿上做上標記，先放置在37°C恒溫培養箱中30_60min直到表面的液體都滲透到培養基里后，再倒置過來放入37°C恒溫培養箱過夜。(8)觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。
2.挑取單個飽滿菌落進行大量擴增。在上述平板上挑取單個菌落于7ml LB培養基(含Ampicillin)中，然后固定到搖床的彈簧架上37°C震蕩過夜。3. pGL3_promoter質粒的抽提,具體步驟見下。(I)將以上過夜培養的I. 5mlDH5a細菌IOOOOrpm離心15秒，徹底去除上清。(2)加入IOOml溶液I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌，冰浴2分鐘。(3)加200 ml溶液II，立即溫和混勻，使細菌裂解，室溫放置I min。(4)加入350ml溶液III，立即上下顛倒數次，使之充分中和，室溫放置I分鐘。(5) 12000rpm，離心 5 分鐘。(6)將上清轉移到套放于2. Oml收集管內的EZ-10柱中，放置兩分鐘，8000rpm室溫離心I分鐘。(7)棄收集管中的廢液，將離心柱放入同一支收集管中，吸取500ml漂洗液到離心柱中，8，OOOrpm室溫離心I分鐘。(8)重復上一步驟。(9)棄收集管中的廢液，將離心柱放入同一支收集管中，IOOOOrpm室溫離心30秒以徹底去除漂洗液。(10)將離心柱放入新的潔凈1.5ml離心管中，加50ml洗脫緩沖液(ElutionBuffer),室溫放置2分鐘后，IOOOOrpm室溫離心I分鐘。離心管中的溶液即為所抽提的質粒 DNA。4 . 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒的純度和含量。(I)準確稱取瓊脂糖O. 5g和雙蒸水49ml倒入錐形瓶中，加入Iml 50 X TAE配制成1%的溶液。(2)于微波爐中加熱至液體沸騰，取出錐形瓶搖晃趕出底部及側壁氣泡，重新放回微波爐中加熱，如此三次，至瓊脂糖完全溶解。(3)將錐形瓶中溶液室溫冷卻至溫熱，滴入一滴EB，搖晃混勻，溶液呈淡紅色。(4)將合適大小的梳子插入清洗晾干的膠模中，以上配置好的溶液緩緩倒入該膠模中。凝膠厚度約為3至5 mm之間,梳子距離板底O. 5-1. O mm。(5)在凝膠完全凝固后(約30min),小心地移去梳子。(6)將凝膠放入電泳槽中，加入恰好沒過膠面約I _的IXTAE電泳緩沖液。
(7)樣品與所需加樣緩沖液混合后，用微量移液器，將其加至樣品槽中。(8)通電，110 V穩定電壓。電泳染料溴酚藍在凝膠中遷移出適當距離。( 9 )切斷電源，取出凝膠。( 10)在紫外燈下檢查凝膠，并用凝膠成像系統記錄結果。5.用NcoI和HindIII對質粒進行雙酶切，體系如下
質粒3μ1
NcoI (IOU/ μ ): μHind III (IOU/ μ ): μIOXk Buffer:2μ1 BSA μ
ddH20:12μ1
共 20μ1。按以上雙酶切體系配制并離心混勻，37°C酶切過夜。6.試劑盒凝膠回收酶切產物。( I)酶切產物中加入5倍體積的結合液BD，充分混勻。(2)將吸附柱放入收集管中，用移液器將上一步所得溶液轉移至吸附柱中，12000rpm室溫離心30秒,倒掉濾液。(3)將吸附柱中加入600 μ I漂洗液WB，12000rpm室溫離心I分鐘，倒掉濾液。(4)將吸附柱于12000rpm室溫離心2分鐘，除去殘留的漂洗液WB，將吸附柱室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液。漂洗液WB的殘留會影響DNA的純化得率。(5)取出吸附柱，放入一個新的I. 5ml離心管中，向吸附柱中間部分滴加7. 5 μ I洗脫液ΕΒ，室溫靜置I分鐘。12000rpm室溫離心I分鐘洗脫DNA，重復本操作一次，收集管中溶液。步驟二 =VEGFA基因的Y UTR序列的克隆、酶切及純化。根據人的VEGFA基因的3' UTR區序列設計兩端引物
引物I為上游Y端引物，其中包含19個VEGFA基因的Y UTR互補堿基，一個HindIII識別位點，3個保護堿基。引物2為下游Y端引物，其中包含19個VEGFA基因:V UTR互補堿基，一個NcoI識別位點，4個保護堿基。引物I: 5’ - CCCAAGCTTCTCACCAGGAAAGACTGAT-3’。引物2: 5’ - CATGCCATGGAACTCAAGTCCACAGCAGT-3’。以基因組DNA為模板，利用常規PCR反應進行擴增。反應條件為在95°C預變性3min，再在95°C變性30s，然后在55°C退火45s，再在72°C延伸Imin ;進行40個循環，最后在72°C最終延伸5min，擴增完后于4°C長期保溫。反應結束后，取5 μ I反應產物用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測；取100 μ I PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳。結果如圖I所示，圖中的標記條帶(Marker)為DL5000，1-5為VEGFA基因 3' UTR 片段(279bp)。切膠，用凝膠回收試劑盒回收；將回收的PCR產物用NcoI和HindIII雙酶切。
酶切體系如下
回收的PCR產物15μ1 NcoI (IOU/ μ ): μ Hind III (IOU/ μ ): μ IOXk Buffer:2μ1
BSA μ
共 20μ1。
按以上雙酶切體系配制并離心混勻，37°C酶切過夜。再次回收以備連接使用。步驟三連接反應。將經過雙酶切的pGL3-promoter載體和VEGFA基因3' UTR片段在O. 2ml的離心管中進行連接反應，16°C過夜。反應體系如下
VEGFA基因V UTR酶切回收產物 15μ1 pGL3-promoter酶切回收產物2μ1
IOXbuffer:2 M-I
T4 DNA ligase (5u/M-l, Fermentas) :IM-I
共 20μ1。步驟四篩選重組子。取10 μ I連接產物直接轉化100 μ L感受態大腸桿菌。經過含有氨芐青霉素的LB培養基中選擇培養。從轉化子的平板上隨即挑取10個菌落，擴增培養后用堿裂解法少量提取質粒備用；經過酶切、PCR、測序鑒定。其中酶切參見圖2，圖中的標記條帶(Marker)為DL5000，1_5 為PGL3-VEGFA-3' UTR-promoter/HindIII + NcoI0 結果顯示，重組載體中含有插入的 VEGFA基因3' UTR片段并且測序結果與基因庫(GENEBANK)所查的序列比對，參見圖3所示，發現除引物處不一致外，僅有一處堿基突變，為合理突變。本發明提供的含有VEGFA基因3' UTR和報告基因的重組質粒，是通過克隆血管內皮成長因子A (VEGFA)基因的3'非轉錄區(3' UTR)的特異性序列并重組到螢火蟲熒光素酶報告基因載體啟動序列中，從而構建VEGFA基因的3' UTR報告基因載體。該重組質粒在篩選血管生成相關的microRNA、研究血管生成與microRNA之間的作用機理以及研究腫瘤細胞血管生成的機制等方面就有極佳的應用前景。盡管本發明的內容已經通過上述優選實施例作了詳細介紹，但應當認識到上述的描述不應被認為是對本發明的限制。在本領域技術人員閱讀了上述內容后，對于本發明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發明的保護范圍應由所附的權利要求來限定。
權利要求
1.一種含有VEGFA基因V UTR和報告基因的重組質粒，其特征在于，所述的報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。
2.如權利要求I所述的含有VEGFA基因:VUTR和報告基因的重組質粒，其特征在于，所述的重組質粒的制備方法包含 步驟I，對載體質粒進行擴增和抽提； 步驟2，對VEGFA基因的3' UTR序列進行克隆、酶切及純化； 步驟3，進行所述的VEGFA基因的3' UTR序列與所述的載體質粒的連接； 步驟4，篩選重組子。
3.如權利要求2所述的含有VEGFA基因:VUTR和報告基因的重組質粒，其特征在于，所述的步驟I包含 用所述的載體質粒轉化大腸桿菌感受態細胞，進行擴增；然后采用堿裂解法抽提制備所述的載體質粒，電泳檢測所述載體質粒的純度和含量；再用NcoI和HindIII對所述載體質粒進行酶切，試劑盒凝膠回收大片段的酶切產物。
4.如權利要求2所述的含有VEGFA基因:VUTR和報告基因的重組質粒，其特征在于，所述的步驟2包含 步驟2. 1，根據人的VEGFA基因的3' UTR區序列設計兩端引物引物I為上游5'端引物，其中包含19個VEGFA基因的3' UTR互補堿基，一個HindIII識別位點，3個保護堿基；引物2為下游3'端引物，其中包含19個VEGFA基因3' UTR互補堿基，一個NcoI識別位點，4個保護堿基； 步驟2. 2，以基因組DNA為模板，利用PCR反應進行擴增； 步驟2. 3，反應結束后，取5μ I反應產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測； 步驟2. 4，取反應產物，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，用凝膠回收試劑盒回收； 步驟2. 5，將回收的PCR產物用NcoI和HindIII雙酶切，再次回收以備連接使用。
5.如權利要求4所述的含有VEGFA基因:VUTR和報告基因的重組質粒，其特征在于，所述的引物I為5， - CCCAAGCTTCTCACCAGGAAAGACTGAT-3，。
6.如權利要求4所述的含有VEGFA基因:VUTR和報告基因的重組質粒，其特征在于，所述的引物2為5， - CATGCCATGGAACTCAAGTCCACAGCAGT -3'
7.如權利要求4所述的含有VEGFA基因:VUTR和報告基因的重組質粒，其特征在于，所述的PCR反應的反應條件為在95°C預變性3min，再在95°C變性30s，然后在55°C退火45s，再在72°C延伸Imin ;進行40個循環，最后在72°C最終延伸5min，之后于4°C保溫。
8.如權利要求2所述的含有VEGFA基因:VUTR和報告基因的重組質粒，其特征在于，所述的步驟3的連接采用DNA連接試劑盒，進行連接反應。
9.如權利要求2所述的含有VEGFA基因:VUTR和報告基因的重組質粒，其特征在于，所述的步驟4包含 取連接產物直接轉化感受態大腸桿菌；經過含有氨芐青霉素的LB培養基中選擇培養；從培養平板上隨機挑取菌落，擴增培養后用堿裂解法提取質粒備用；最后經過酶切、PCR、測序鑒定。
全文摘要
本發明公開了一種含有VEGFA基因3′UTR和報告基因的重組質粒，其中，該報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。該重組質粒的制備方法包含步驟1，對載體質粒進行擴增和抽提；步驟2，對VEGFA基因的3′UTR序列進行克隆、酶切及純化；步驟3，進行所述的VEGFA基因的3′UTR序列與所述的載體質粒的連接；步驟4，篩選重組子。本發明提供的含有VEGFA基因3′UTR和報告基因的重組質粒，在篩選血管生成相關的microRNA、研究血管生成與microRNA之間的作用機理以及研究腫瘤細胞血管生成的機制等方面就有極佳的應用前景。
文檔編號C12N15/63GK102899344SQ20121046111
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者李琦, 殷佩浩, 邱艷艷, 劉宣, 周利紅, 王炎, 侯黎莉, 秦建民, 靳寶輝, 陳星竹, 王一斐, 葉乃菁, 胡送嬌, 梁波, 鄭媛紅 申請人:上海中醫藥大學附屬普陀醫院