專利名稱：一種多克隆位點的人工設計與合成方法
技術領域：
本發明涉及多克隆位點的人工設計與合成方法，具體涉及適用于多種表達載體的多克隆位點(MCS)的合成、克隆與驗證。
背景技術：
多克隆位點(Multiple cloning sites, MCS)是包含多個限制性內切酶酶切位點的長度為幾十個堿基的DNA序列，也稱為多位點接頭，是基因工程中常用到的載體質粒的標準配置序列。MCS序列中，每個限制性酶切位點通常是唯一的，即它們在一個特定的載體質粒中只出現一次，在不破壞質粒基本組成結構的基礎上，用一種或兩種內切酶進行酶切反應，在MCS特定的識別位點形成缺口，以此將外源基因或者序列克隆至表達載體中，對于研究和分析基因功能是必需的。MCS廣泛應用于分子克隆和亞克隆工程中，是應用分子生物學、生物工程、分子遺傳學等研究的重要實驗工具。常用的克隆載體、表達載體等質粒中均含有MCS序列。然而，由于基因結構的復雜性和多樣性，在將外源基因插入含有MCS的載體中時，MCS序列包含的酶切位點的種類有時難以滿足特定研究需求，導致特定基因功能分析無法順利進行，形成分子生物學研究領域的瓶頸。因此，迫切需要一種簡單有效的MCS序列的人工設計與合成方法，以此滿足不同的科研工作需求。
本發明的目的是人工設計并合成一段符合特定需求的MCS序列，將其克隆至表達載體驗證其有效性，以此解決大多數外源目的基因編碼序列無法插入到一些商業化載體中進行基因功能驗證的不足。發明內容
本發明是要解決MCS序列包含的酶切位點的種類有時難以滿足特定研究需求，導致特定基因功能分析無法順利進行的難題，由此提供了一種多克隆位點的人工設計與合成方法。
本發明的一種多克隆位點的人工設計與合成方法按以下步驟實現
一、選擇在表達載體及特定目的基因插入序列中都不存在的酶切位點；
_■、將兩兩酶切位點之間以ATAT喊基結構串聯，在串聯后的喊基序列兩端各添加與表達載體克隆區相同的兩個酶切位點后得到序列；
三、在步驟二中的序列兩末端再隨機添加2飛個GC或AT堿基，然后送至測序公司合成，即完成了多克隆位點的人工設計與合成。
本發明有益效果
本發明設計并合成的多克隆位點序列中的兩兩酶切位點是由ATAT結構串聯，并且在序列兩末端添加與表達載體克隆區相同的兩個酶切位點后得到滿足特定研究需求的序列，并且GC或AT序列為隨機添加，以此平衡上下游PCR擴增引物之間的退火溫度和GC 含量，便于后續的PCR擴增，基因功能分析順利進行。
以表達載體Tol2及報告基因EGFP插入序列為例，兩端分別添加HinaIII和SalI酶切位點，SalI端再增加6個堿基(GGAACC)形成一段含有HindIII和SalI酶切位點，長度為115bp便于進行PCR擴增的MCS序列。合成的MCS序列中添加的ATAT結構能夠防止各不同內切酶對酶切位點的識別錯誤，同時也防止了較多GC堿基所引起的甲基化作用。GGAACC 序列為隨機添加，能夠平衡上下游PCR擴增引物之間的退火溫度和GC含量，利于后續擴增。 經分子生物學軟件Primer premier5. O驗證,新引入的序列對序列酶切位點的識別沒有影響。圖I是試驗I中MCS序列的人工合成結果；圖2是試驗I中表達載體pTol2-EFl a -MCS-EGFP的構建過程；圖3是試驗I中未注射pTol2-EFl a -MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內12h后熒光觀


察結果；
圖4是試驗I中注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內12h后報告基因 EGFP的瞬時表達熒光觀察結果；
圖5是試驗I中未注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內12h后普通可見光觀察結果；
圖6是試驗I中注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內12h后報告基因 EGFP的瞬時表達普通可見光觀察結果；
圖7是試驗I中未注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內7此后熒光觀察結果；
圖8是試驗I中注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內72h后報告基因 EGFP的瞬時表達熒光觀察結果；
圖9是試驗I中未注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內72h后普通可見光觀察結果；
圖10是試驗I中注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內72h后報告基因 EGFP的瞬時表達普通可見光觀察結果。
具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式中的一種多克隆位點的人工設計與合成方法按以下步驟實現
一、選擇在表達載體及特定目的基因插入序列中都不存在的酶切位點；
_■、將兩兩酶切位點之間以ATAT喊基結構串聯，在串聯后的喊基序列兩端各添加與表達載體克隆區相同的兩個酶切位點后得到序列；
三、在步驟二中的序列兩末端再隨機添加2飛個GC或AT堿基，然后送至測序公司合成，即完成了多克隆位點的人工設計與合成。
本實施方式中合成的MCS序列稀釋至濃度為IOOuM備用。
本實施方式效果
本實施方式設計并合成的多克隆位點序列中的兩兩酶切位點是由ATAT結構串聯，并且在序列兩末端添加與表達載體克隆區相同的兩個酶切位點后得到滿足特定研究需4求的序列，并且GC或AT序列為隨機添加，以此平衡上下游PCR擴增引物之間的退火溫度和 GC含量，便于后續的PCR擴增，基因功能分析順利進行。
以攜帶報告基因EGFP的表達載體Tol2為例進行重組載體的構建。新合成的MCS 序列兩端分別添加HindIII和SalI酶切位點，SalI端再增加6個堿基(GGAACC)，形成一段含有HindIII和SalI酶切位點、長度為115bp便于進行PCR擴增的MCS序列。合成的MCS 序列中添加的ATAT結構能夠防止各不同內切酶對酶切位點的識別錯誤，同時也防止了較多GC堿基所引起的甲基化作用。GGAACC序列為隨機添加，能夠平衡上下游PCR擴增弓I物之間的退火溫度和GC含量,利于后續擴增。經分子生物學軟件Primer premier5. O驗證,新弓丨入的序列對序列酶切位點的識別沒有影響。
通過以下試驗驗證本發明有益效果
試驗I
以表達載體Tol2及報告基因EGFP插入序列為例，進行MCS的人工合成同時進行驗證
一、MCS的人工設計與合成
I.利用Primer premier 5. O軟件設計多克隆位點序列，同時設計正向引物Pl與反向引物P2，從酶切位點表中選擇在表達載體Tol2及報告基因EGFP插入序列中都不存在的 11 個酶切位點，分別為 HindIII, StuI, Bell、BspEI, PmeI, AscI, Smal/Xmal、PacI、 Haelll、Seal、Sail ；
2.將步驟一中的兩兩酶切位點之間以ATAT喊基結構串聯,在串聯后的喊基序列兩端各添加與表達載體克隆區相同的兩個酶切位點HindIII和SalI ;其中，所述表達載體中存在的酶切位點位于表達載體啟動子與終止子之間；
3.在步驟二中的序列兩末端隨機添加GGAACC堿基，然后送至測序公司合成，由此完成了多克隆位點的人工設計與合成；
其中，所述多克隆位點序列為CCCAAGCTTAT GCATGC ATAT TGATCA ATATTCCGGA ATAT GTTTAAAC ATAT GGCGCGCC ATAT CCCGGG ATAT TTAATTAAATAT GGCC ATAT AGTACT ATAT GTCGACGCGT GGAACC，其序列如Seq ID No: I所示，所述引物序列中正向引物Pl : 5’ -CCCAAGCTTATGCATGCATATTG-3'，反向引物 P2 :5’ -GGTTCCACGCGTCGACATATAGTAC-3'；
二、表達載體pTol2_EFl a -MCS-EGFP (多克隆位點表達載體)的構建
對步驟一中合成的MCS寡核苷酸鏈利用正反向引物進行PCR擴增，反應體系見表I;PCR 擴增條件為95°C 5min，95°C 30s,55°C 30s,72°C 30s，共 35 個循環，72°C 7min ； 反應結束后，產物進行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用凝膠回收試劑盒(TAKARA)切膠回收MCS條帶，回收條帶與PMD18-T載體連接，反應體系見表2 :16°C水浴連接30min，然后轉化至大腸桿菌DH5a感受態細胞中(TAKARA)，涂平板，37°C倒置培養過夜。選擇經藍白斑篩選后的陽性克隆進行菌斑PCR反應，反應體系如表3 :PCR擴增條件為95°C 5min，95°C 30s,55°C 30s,72°C 30s，共35個循環，72°C 7min ;反應結束后，I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選陽性克隆搖菌過夜，質粒小量提取試劑盒(TIANGEN)提取質粒，然后送測序公司進行測序，將經測序驗證的PMD-18T/MCS質粒與pTol2-EFl a -EGFP質粒利用HindIII和SalI (TAKARA)限制性內切酶分別進行雙酶切，反應體系如表4 ;37°C酶切3h，I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化MCS片段，然后將回收的MCS片段與Tol2質粒大片段進行連接反應，反應體系如表5 :16°C水浴連接過夜，次日轉化至大腸桿菌DH5a感受態細胞中(TAKARA)，涂 平板，37°C倒置培養過夜，挑取陽性克隆進行菌斑PCR反應，反應體系如表6 PCR擴增條件 為95°C 5min,95°C 30s、55°C 30s、72°C 30s，共 35 個循環，72°C 7min ;反應結束后，1. 5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后挑取陽性克隆搖菌過夜，質粒小量提取試劑盒(TIANGEN)提取質 粒，送測序公司進行測序。測序結果正確即獲得重組的表達載體pTol2-EFl a -MCS-EGFP。表1PCR擴增MCS序列反應體系
成分用量
MCS模板lpL
Jli向引物PIl^iL
反向引物P2l^L
2 X PCR Master Mix12.5卜山
H2O9.5,u L表2PMD-18T/MCS連接反應體系
成分用量
PMD-18T 載體lpL
Ligation Solution I5jxL
回收產物4pL表3PMD-18T/MCS菌液PCR反應體系
成分用量
Master Mix12.5uL
AVM通用引物luL
M13-47通用引物l^iL
H 010.5uL表4PMD-18T/MCS與Tol2雙酶切反應體系
rOx八rn曰-
成分用莖
PMD18-MCS 質粒或 Tol2 質粒3pL
Hind XW‘uL
Sail1 uL
10 X K buffer3liL
H2012uL
表5MCS片段與Tol2連接反應體系
權利要求
1.一種多克隆位點的人工設計與合成方法，其特征在于多克隆位點的人工設計與合成方法按以下步驟實現 一、選擇在表達載體及特定目的基因插入序列中都不存在的酶切位點； ~■、將兩兩酶切位點之間以ATAT喊基結構串聯，在串聯后的喊基序列兩端各添加與表達載體克隆區相同的兩個酶切位點后得到序列； 三、在步驟ニ中的序列兩末端再隨機添加2 6個GC或AT堿基，然后送至測序公司合成，即完成了多克隆位點的人工設計與合成。
全文摘要
一種多克隆位點的人工設計與合成方法，本發明涉及多克隆位點的人工設計與合成方法，具體涉及適用于多種表達載體的多克隆位點的合成、克隆與驗證。本發明是要解決表達載體含有的MCS序列包含的酶切位點種類有時難以滿足特定研究需求，導致特定基因功能分析無法順利進行的難題。一、選擇在表達載體及特定目的基因插入序列中都不存在的酶切位點；二、將兩兩酶切位點之間以ATAT堿基結構串聯，在串聯后的堿基序列兩端各添加與表達載體克隆區相同的兩個酶切位點后得到序列；三、在步驟二中的序列兩末端再隨機添加2～6個GC或AT堿基，然后送至測序公司合成，即完成了多克隆位點的人工設計與合成。本發明應用于多克隆位點的人工合成領域。
文檔編號C12N15/10GK102978197SQ20121049920
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者常玉梅, 李世國, 梁利群, 唐然, 陶然 申請人:中國水產科學研究院黑龍江水產研究所