專利名稱：人工豬表皮生長因子真核表達載體及其制備方法和其釀酒酵母工程菌的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種人工豬表皮生長因子真核表達載體及其制備方法和其釀酒酵母工程菌。
背景技術：
豬表皮生長因子(Porcine epidermal growth factor, pEGF)是豬初乳中相對含量較高的一種生長因子，是一種強有力的細胞有絲分裂原，具有刺激細胞分裂、增殖與分·化、促進離子交換和細胞外基質合成等生物學特性，它對斷奶仔豬胃腸道的發育有非常重要的影響。由于斷奶使得乳源性表皮生長因子突然中斷，仔豬的消化系統還未發育完全，抵抗力較弱，斷奶仔豬的胃腸黏膜難以適應飼料，而引發斷奶應激，采食量、日增重及飼料轉化率大幅度降低，導致仔豬容易腹瀉、免疫力下降、多病、生長緩慢、死亡率高。據相關文獻報道豬表皮生長因子PEGF有利于豬早期胚胎發育、能提高母豬的窩產仔數、提高仔豬成活率以及促進斷奶仔豬的生長。基于豬表皮生長因子所具有的多種功能和重要作用，Pascall等(1991)在釀酒酵母中表達了少量的PEGF融合蛋白；2001年，美國專利報道了在大腸桿菌中融合表達pEGF ；楊桂香等(2006)做過豬表皮生長因子在大腸桿菌中的GST-pEGF融合表達；汪洋等(2007)在畢赤酵母中表達了 6His-pEGF融合蛋白。以上研究都需要將表達產物進行純化，然后才能利用，因而成本高。2005年，中國臺灣有人做過豬表皮生長因子在畢赤酵母(Pichiapastoris)中的表達,用發酵上清液做飼喂動物實驗,但其中含甲醇,作飼料前需要去除對動物有害的甲醇。中國專利200610114038. 7公開的豬表皮生長因子在畢赤酵母中表達也要用甲醇誘導，所以這樣表達產物中盡管有豬表皮生長因子，但不能直接用于作飼料，需要提純后才能利用。由于去除甲醇和提純的成本高，所以用畢赤酵母表達豬表皮生長因子較難用作飼料推廣。

發明內容
本發明的第一個目的是提供一種適于釀酒酵母表達的人工豬表皮生長因子基因。本發明根據豬表皮生長因子的氨基酸序列以及釀酒酵母對密碼子的偏好性，設計編碼與豬表皮生長因子氨基酸序列相同的人工豬表皮生長因子(S)pEGF基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。本發明的第二個目的提供一種人工豬表皮生長因子真核表達載體pYES2_MFa -(S)pEGF，其特征在于，在釀酒酵母信號肽Mf α核苷酸序列的3’端接上人工豬表皮生長因子(S)pEGF基因，然后將其插入釀酒酵母表達質粒pYES2. O中，所述的釀酒酵母信號肽Mf a核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。優選插入釀酒酵母表達質粒pYES2. O的酶切位點Kpn I和Xba I之間，用插入片段替換酶切位點Kpn I和Xba I之間的核苷酸序列。
本發明的第三個目的是提供一種含有上述人工豬表皮生長因子真核表達載體PYES2-MF a - (S) pEGF的釀酒酵母營養缺陷型菌株INVSc I。本發明的第四個目的是提供人工豬表皮生長因子真核表達載體pYES2-MF Q-(S)pEGF的構建方法，其特征在于，首先在釀酒酵母信號肽Mf α的核苷酸序列的3’端接上人工豬表皮生長因子(S)pEGF基因，然后將其插入釀酒酵母表達質粒pYES2. O中，所述的釀酒酵母信號肽Mfa的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。優選插入釀酒酵母表達質粒pYES2. O的酶切位點Kpn I和Xba I之間，用插入片段替換酶切位點Kpn I和Xba I之間的核苷酸序列。具體構建方法為a.將如SEQ ID NO.1所示的人工豬表皮生長因子(S) pEGF基因的核苷酸序列插入 PMD18-T Simple Vector的BamH I酶切位點和Xba I酶切位點之間，其5’端接BamHI酶切位點，3’端接Xba I酶切位點，由此得到質粒pMD18-T-(S)pEGF ；b.將如SEQ ID NO. 2所示的釀酒酵母信號肽MFa的核苷酸序列連接到質粒pMD18-TSimple Vector 上，構建成重組質粒 pMD18_T_MF α ；c.將重組質粒pMD18-T_Mf α和釀酒酵母表達質粒PYES2. O用內切酶Kpn I和內切酶BamH I分別對其進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶將釀酒酵母信號肽MF α的核苷酸序列與釀酒酵母表達質粒PYES2. O連接構建成重組質粒pYES2-Mf α ；d.用內切酶BamH I和內切酶Xba I分別對重組質粒pYES2_Mf α和質粒pMD18-T-(S)pEGF進行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶將人工豬表皮生長因子(S)pEGF基因插入重組質粒pYES2_Mf α中構建成人工豬表皮生長因子真核表達載體pYES2-MFa-(S)pEGFo將構建好的人工豬表皮生長因子真核表達載體pYES2-MF a -(S)pEGF按照常規的轉化方法，如醋酸鋰法轉化到釀酒酵母營養缺陷型菌株INVSc I中，即得到人工豬表皮生長因子釀酒酵母工程菌。本發明通過構建釀酒酵母偏愛型的人工豬表皮生長因子基因，再在其前端加上釀酒酵母信號肽Mf α的核苷酸序列，以利于作為飼料在胃腸中吸收利用，再插入釀酒酵母表達質粒pYES2. O中，然后轉化進入釀酒酵母營養缺陷型菌株INVSc I，而得到含人工豬表皮生長因子基因的釀酒酵母工程菌，該工程菌在表達豬表皮生長因子過程中不用甲醇誘導，只需用可作為飼料的棉子糖誘導即可，半乳糖不能誘導，從而使工程菌和表迖產物能不需脫毒、純化，而直接作為飼料，大大降低了工程菌和表迖產物作為飼料的成本和生產周期，還減少了脫毒設備的投資，為本發明人工豬表皮生長因子基因在飼料工作中應用提供了優選技術方案。本發明還具有重組菌株易培養，豬表皮生長因子表達量高，用作飼料無需純化,生產成本低等特點。


圖1是釀酒酵母分泌信號肽基因Mf α的PCR產物電泳圖，圖中I是釀酒酵母分泌信號肽基因PCR產物，M是DNA分子量標準；圖2是重組質粒pYES2_MFa -(S)pEGF的雙酶切鑒定圖，圖中I是經Kpn I和XbaI雙酶切的pYES2-MF α -(S)pEGF，圖中M是DNA分子量標準；
圖3是釀酒酵母分泌表達載體pYES2-Mfa- (S) pEGF構建的流程圖；圖4是誘導表達的人工豬表皮生長因子基因的上清液Tricine-SDS-PAGE電泳圖，圖中M是DNA分子標記，I是經棉籽糖誘導96h的pYES2. 0/INVScl的濃縮上清液，2是經棉籽糖誘導96h的pYES2-MFa -(S)pEGF/INVScl的濃縮上清液。
具體實施例方式下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不能用來限制本發明的范圍。實施例1 :釀酒酵母分泌表達載體pYES2-Mfa_ (S) pEGF的構建( I)豬表皮生長因子基因的人工合成根據豬表皮生長因子的氨基酸序列以及釀酒酵母對密碼子的偏愛性，人工設計了釀酒酵母偏愛型人工豬表皮生長因子(S) pEGF基因，其核苷酸序列如下AAT TCT TAT TCT GAA TGT CCA CCA TCT CAT GAT GGT TAT TGT TTG CAT GGTGGTGTT TGT ATG TAT ATT GAA GCT GTT GAT TCT TAT GCT TGT AAT TGT GTT TTTGGT TAT GTTGGT GAA AGA TGT CAA CAT AGA GAT TTG AAA TGG TGG GAA TTG AGATAA (如 SEQ ID NO.1所示)。人工豬表皮生長因子基因密碼子與天然豬表皮生長因子基因的密碼子相比，有37處堿基發生改變，其氨基酸序列與原基因氨基酸序列同源性為100%。將這段序列插入pMD18_T Simple Vector的BamH I酶切位點和Xba I酶切位點之間，其5’端接BamH I酶切位點，3’端接Xba I酶切位點，由此得到質粒pMD18_T_(S)pEGF，質粒pMD18-T-(S)pEGF的合成由上海英駿生物技術有限公司負責合成。(2)釀酒酵母信號肽重組質粒pYES2_Mf α的構建根據已登錄的釀酒酵母信號肽MF α的基因組序列(Ζ73543，具體核苷酸序列如SEQ IDN0. 2所示)設計引物上游引物Ρ3 :5' GG AAGCTTATGAGATTTCCTTCTATTTTTACTGC3'(其中 AAGCTT 為酶切位點Kpn I);下游引物P4:5' CG GGATCCTCTTTTATCCAAAGAAACACCT 3'(其中 GGATCC 為酶切位點 BamH I)。 Ρ3和Ρ4引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。用煮沸法裂解釀酒酵母INVScl菌體，以其上清液為模板，應用Ρ3、Ρ4引物，進行PCR擴增，擴增反應體系為
權利要求
1.一種人工豬表皮生長因子(S) PEGF基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.—種人工豬表皮生長因子真核表達載體pYES2-MFa -(S)pEGF，其特征在于，在釀酒酵母信號肽Mf a核苷酸序列的3’端接上權利要求1所述的人工豬表皮生長因子(S)pEGF基因，然后將其插入釀酒酵母表達質粒PYES2. O中，所述的釀酒酵母信號肽Mf a核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.根據權利要求2所述的人工豬表皮生長因子真核表達載體pYES2-MFa-(S)pEGF，其特征在于，所述的將其插入釀酒酵母表達質粒PYES2. O中是將其插入釀酒酵母表達質粒PYES2.0的酶切位點Kpn I和Xba I之間，用插入片段替換酶切位點Kpn I和Xba I之間的核苷酸序列。
4.一種含有權利要求2或3所述的人工豬表皮生長因子真核表達載體PYES2-MF α - (S) pEGF的釀酒酵母營養缺陷型菌株INVSc I。
5.一種權利要求2所述的人工豬表皮生長因子真核表達載體pYES2-MF a -(S)pEGF的構建方法，其特征在于，首先在釀酒酵母信號肽Mfa的核苷酸序列的3’端接上權利要求1所述的人工豬表皮生長因子(S)pEGF基因，然后將其插入釀酒酵母表達質粒pYES2. O中，所述的釀酒酵母信號肽Mfa的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述的將其插入釀酒酵母表達質粒PYES2. O中是將其插入釀酒酵母表達質粒pYES2. O的酶切位點Kpn I和Xba I之間，用插入片段替換酶切位點Kpn I和Xba I之間的核苷酸序列。
7.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，其具體構建方法為 a.將如SEQID NO.1所示的人工豬表皮生長因子(S)pEGF基因的核苷酸序列插入PMD18-T Simple Vector的BamH I酶切位點和Xba I酶切位點之間，其5’端接BamHI酶切位點，3’端接Xba I酶切位點，由此得到質粒pMD18-T-(S)pEGF ； b.將如SEQID N0.2所示的釀酒酵母信號肽MFa的核苷酸序列連接到質粒pMD18-TSimple Vector 上，構建成重組質粒 pMD18_T_MF a ； c.將重組質粒pMD18-T-Mfa和釀酒酵母表達質粒pYES2. O用內切酶Kpn I和內切酶BamH I分別對其進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶將釀酒酵母信號肽MF α的核苷酸序列與釀酒酵母表達質粒PYES2. O連接構建成重組質粒pYES2-Mf α ； d.用內切酶BamHI和內切酶Xba I分別對重組質粒pYES2_Mf α和質粒pMD18-T-(S)pEGF進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶將人工豬表皮生長因子(S)pEGF基因插入重組質粒pYES2_Mf α中構建成人工豬表皮生長因子真核表達載體pYES2-MFa-(S)pEGFo
全文摘要
本發明公開了一種人工豬表皮生長因子真核表達載體及其制備方法和其釀酒酵母工程菌。根據釀酒酵母對豬表皮生長因子密碼子的偏好性人工合成了豬表皮生長因子基因，其基因如序列表SEQ ID NO.1所示。本發明還提供了含有該基因的釀酒酵母表達載體及其具有分泌表達的工程菌，并提供了獲得該工程菌的方法。本發明人工豬表皮生長因子基因具有釀酒酵母偏愛型特點，其工程菌含有釀酒酵母信號肽以利于豬表皮生長因子的分泌表達，該工程菌在表達豬表皮生長因子過程中不用甲醇誘導而用可作為飼料的棉子糖，不需純化提取，可將工程菌和表迖產物直接作為飼料，大大降低了豬表皮生長因子作為飼料的成本和生產周期，為豬表皮生長因子在飼料工業中的應用提供了可能。
文檔編號C12N15/81GK103014010SQ201210531700
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日
發明者郭春華, 張興友, 陳友慷, 周琳 申請人:深圳比利美英偉營養飼料有限公司, 郭春華