專(zhuān)利名稱(chēng)：基于3d打印平臺(tái)的數(shù)字pcr芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PCR生物芯片研究領(lǐng)域，特別涉及一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法。
背景技術(shù)：
在進(jìn)行生物研究和實(shí)際檢測(cè)時(shí)，有時(shí)待測(cè)DNA樣品的量較少或者從樣品中提取的待測(cè)DNA分子濃度較低時(shí)，為了得到較好的結(jié)果，通常需要先對(duì)樣品分子的量進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)。雖然常規(guī)的PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究及相關(guān)領(lǐng)域，并且在應(yīng)用過(guò)程中不斷得到改進(jìn)，但目前仍然存在著耗時(shí)太長(zhǎng)，操作繁瑣，試劑消耗量大，擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此人們一直在尋求更快速更簡(jiǎn)便的PCR方 法。數(shù)字PCR是最新的DNA定量技術(shù)，其基于單分子PCR并采用計(jì)數(shù)的方法對(duì)DNA進(jìn)行定量，因此是一種絕對(duì)定量的工具。將大量的稀釋后的DNA溶液分散至芯片的微量反應(yīng)體系中，每個(gè)反應(yīng)體系的DNA模板數(shù)至多I個(gè)。在PCR循環(huán)反應(yīng)之后，可根據(jù)發(fā)出熒光信號(hào)的微量反應(yīng)體系所占有的比例來(lái)判定原始DNA濃度。微量點(diǎn)噴(Inkjet)技術(shù)具有精確數(shù)字可控的優(yōu)越性，基于壓電效應(yīng)在微小噴孔(20-80um直徑)里產(chǎn)生皮升(pi)級(jí)的液滴，配以微米級(jí)(Ium)精度的運(yùn)動(dòng)平臺(tái)，可以實(shí)現(xiàn)點(diǎn)、線、面的精細(xì)噴涂和打印。廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥，醫(yī)療器械噴涂、微分配、0LED、鍍膜、功能材料打印，納米材料沉積，印刷電子等工藝制程和科研領(lǐng)域。噴墨法與數(shù)字PCR兩者的結(jié)合，利用了數(shù)字PCR的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了在微量體系中低濃度待測(cè)DNA的定量檢測(cè)，同時(shí)亦可通過(guò)噴墨的方法將將稀釋后的DNA溶液定量定點(diǎn)地噴在在蓋片表面，效率極高，成本極低。不需要任何芯片結(jié)構(gòu)和任何液路就可以快速高效的完成dPCR功能，避免了繁雜的芯片制作和微流控液路的集成工藝。這將成為目前存在的最為理想的dPCR實(shí)現(xiàn)方法，具有無(wú)可估量的科研價(jià)值和市場(chǎng)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，具有制備迅速、精確控制油包液滴的體積，和成本制備低廉的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所提供一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟步驟1:取一帶有微孔陣列結(jié)構(gòu)的基片；步驟2 :將基片進(jìn)行表面處理；步驟3 :將基片置于3D打印平臺(tái)平臺(tái)；步驟4 :利用3D打印平臺(tái)上的多個(gè)噴頭，對(duì)基片進(jìn)行油滴和液滴交替的定量噴射打印，使基片表面的微孔中形成油包液滴陣列結(jié)構(gòu)；步驟5 :在基片上的微孔陣列結(jié)構(gòu)中注滿過(guò)量的油；步驟6 :取一透明蓋片；
步驟7 :將透明蓋片固定蓋合于基片上，完成制備。本發(fā)明還提供一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟步驟1:取一平板基片；步驟2 :將平板基片進(jìn)行表面處理；步驟3 :將平板基片置于3D打印平臺(tái)；步驟4 :利用3D打印平臺(tái)上的多個(gè)噴頭，對(duì)平板基片進(jìn)行油滴和液滴交替的定量噴射打印，使平板基片表面上形成油包液滴陣列 結(jié)構(gòu)；步驟5 :在平板基片的四周固定擋墻，使平板基片形成一凹槽；步驟6 :在平板基片上的凹槽中加滿過(guò)量的油；步驟7 :取一透明蓋片；步驟8 :將透明蓋片固定蓋合于平板基片上，完成制備。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將較為成熟的噴墨平臺(tái)與數(shù)字PCR反應(yīng)巧妙結(jié)合，芯片制作步驟快速簡(jiǎn)便，無(wú)需任何復(fù)雜芯片結(jié)構(gòu)和微流控液路，極大的降低了成本。既綜合了噴墨打印法的高效率、定點(diǎn)定量噴滴的優(yōu)勢(shì)又同時(shí)兼具數(shù)字PCR低濃度定量檢測(cè)的特點(diǎn)，為低濃度、稀有樣品DNA定量檢測(cè)及其后續(xù)全基因組測(cè)序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、多重基因表達(dá)分析等提供良好的操作平臺(tái)。本發(fā)明基于噴墨平臺(tái)可以精確控制液滴體積的特點(diǎn)，動(dòng)態(tài)范圍很大，可完成幾皮升至幾微升的精確噴點(diǎn)。


為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容和特點(diǎn)，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做一詳細(xì)描述，其中圖1為本發(fā)明第一實(shí)施例的制作方法流程圖；圖2為本發(fā)明第一實(shí)施例的制作方法的制備原理圖示意圖；圖3為本發(fā)明第一實(shí)施例蓋合蓋片后的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為本發(fā)明第二實(shí)施例的制作方法流程圖；圖5為本發(fā)明第二實(shí)施例的制作方法的制備原理圖示意圖；圖6為本發(fā)明第二實(shí)施例蓋合蓋片后的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的噴墨式數(shù)字PCR芯片的制作方法是首先準(zhǔn)備一潔凈的基片；然后利用3D打印平臺(tái)控制噴頭在基片表面上定點(diǎn)定量地分別進(jìn)行PCR反應(yīng)試劑和密封用油的陣列式打印，形成陣列式油包液滴結(jié)構(gòu)；最后密封并固定，形成封裝好的數(shù)字PCR反應(yīng)芯片。請(qǐng)參閱圖1、圖2和圖3所示，本發(fā)明提供一種利用帶有微孔陣列的基片并基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法(第一實(shí)施例)。具體步驟如下步驟1:取一帶有微孔陣列結(jié)構(gòu)11的基片10，該基片10的材料為石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纖面板或有機(jī)薄片的材料等任何無(wú)生物毒性的材料。其中微孔陣列的具體制備方法為首先要對(duì)基片10進(jìn)行清洗，以去除表面有機(jī)及無(wú)機(jī)雜質(zhì)。采用的清洗步驟具體為取一基片10，去除表面有機(jī)及無(wú)機(jī)雜質(zhì)，并進(jìn)行真空干燥，所述基片10材料為硅片、石英片、光纖面板或有機(jī)薄片，清洗是依次使用超聲波在分析純?nèi)纫蚁⒈o(wú)水乙醇、去離子水中清洗，去除基片10表面的有機(jī)雜質(zhì)，隨后使用氨水和雙氧水的混合液，鹽酸和雙氧水的混合液，硫酸和雙氧水的混合液加熱煮沸基片10,并使用去離子水沖洗,去除基片10表面的無(wú)機(jī)雜質(zhì)，此種清洗方式可除去基片10表面的有機(jī)附著物和無(wú)機(jī)顆粒物，將清洗后的基片10用氮?dú)獯蹈珊笱b入培養(yǎng)皿中，之后放入真空干燥箱內(nèi)前烘，前烘的溫度一般高于100攝氏度，前烘操作目的是去除基片10本身附帶的水蒸氣；然后在基片10正面生長(zhǎng)犧牲層，所述犧牲層材料和生長(zhǎng)厚度依據(jù)后續(xù)刻蝕工藝以及刻蝕的深度而定；通過(guò)光刻工藝和刻蝕工藝將掩模板上的圖形轉(zhuǎn)移到犧牲層上；所述光刻工藝包括勻膠、前烘、曝光、顯影等步驟，刻蝕工藝包括干法刻蝕和濕法刻蝕兩種；最后以犧牲層為掩膜，通過(guò)刻蝕工藝，在基片10上形成陣列微孔11 ;根據(jù)需要選擇物理干法刻蝕或化學(xué)濕法腐蝕的方式來(lái)制作陣列微孔11，其作用機(jī)理是利用氣體等離子或化學(xué)試劑對(duì)基片10的腐蝕作用，在基片10無(wú)犧牲層覆蓋區(qū)域形成陣列微孔11。其中每 個(gè)微孔形成一個(gè)獨(dú)立反應(yīng)池，用于數(shù)字化PCR反應(yīng)，陣列微孔以矩形、環(huán)形、鏡像或密排等形式陣列排布。微孔的體積可從幾個(gè)皮升至微升量級(jí)變化。微孔個(gè)數(shù)取決于反應(yīng)體系的濃度，一般大于5000個(gè)。步驟2 :將基片10進(jìn)行表面處理，所述的表面處理是采用親水處理。對(duì)基片10表面進(jìn)行親水處理，具體處理方法為生長(zhǎng)二氧化硅層、硅烷化處理或氧等離子體處理。步驟3 :將基片10置于3D打印平臺(tái)平臺(tái)，此3D打印平臺(tái)包括噴墨式打印平臺(tái)、接觸式打印平臺(tái)或針式打印平臺(tái)。步驟4 :利用3D打印平臺(tái)上的多個(gè)噴頭40，將PCR反應(yīng)試劑20和密封用油30分別定點(diǎn)定量噴點(diǎn)到微孔內(nèi)，然后在水平面內(nèi)移動(dòng)基片或噴頭至另一微孔，重復(fù)進(jìn)行滴液操作，最終得到油包液滴陣列結(jié)構(gòu)，其中孔內(nèi)油層在孔內(nèi)反應(yīng)試劑層的上方，并且液滴20是PCR反應(yīng)試劑。油滴和液滴的噴射體積可以精確控制，并在液滴或油滴在到達(dá)基片之前進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。通過(guò)軟件分析液滴20和油滴30，得到液滴20和油滴30的直徑、體積、出射速度和出射偏角等相關(guān)參數(shù)。通過(guò)軟件調(diào)節(jié)噴射的各個(gè)參數(shù)，從而獲得符合體積和速度要求的液滴20和油滴30。液滴的體積可以從幾個(gè)皮升至微升量級(jí)精確控制。油滴或液滴體積無(wú)上限，可以通過(guò)在同一位置多次重復(fù)噴射得到大體積的油滴或液滴。通過(guò)軟件設(shè)定需要打印的圖形，利用3D打印平臺(tái)即可打印出任何形狀的圖形，及任意排布的陣列結(jié)構(gòu)。與其他油包液滴結(jié)構(gòu)的制備方法相比，本制備方法產(chǎn)生的油包液滴結(jié)構(gòu)可以有序排列，而非混合無(wú)序狀態(tài)。步驟5 :在基片10上的微孔陣列結(jié)構(gòu)11中注滿過(guò)量的油。對(duì)步驟4中所得油包液滴陣列基片，進(jìn)行封裝，以避免液滴在熱循環(huán)過(guò)程中揮發(fā)采用厚油層密封法，將密封用油注入到基片上的點(diǎn)樣區(qū)，形成厚油層，全部覆蓋油包液滴陣列；密封方法除了厚油層密封法，還有凝膠覆蓋法或夾具密封法。步驟6 :取一透明蓋片50 ;采用步驟I中的清洗方法將透明蓋片50清洗干凈并烘干后，步驟7 :將透明蓋片50水平覆蓋在基片10上，壓住油層，蓋合并固定后形成數(shù)字PCR反應(yīng)芯片。完成制備。請(qǐng)參閱圖4、圖5和圖6所示，本發(fā)明還提供利用無(wú)任何結(jié)構(gòu)的平板基片并基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法(第二實(shí)施例)。具體步驟如下步驟1:取一平板基片11，該基片11的材料為石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纖面板或有機(jī)薄片的材料。首先要對(duì)基片11進(jìn)行清洗，以去除表面有機(jī)及無(wú)機(jī)雜質(zhì)。采用的清洗步驟具體為取一基片11，去除表面有機(jī)及無(wú)機(jī)雜質(zhì)，并進(jìn)行真空干燥，所述基片11材料為硅片、石英片、光纖面板或有機(jī)薄片，清洗是依次使用超聲波在分析純?nèi)纫蚁⒈o(wú)水乙醇、去離子水中清洗，去除基片11表面的有機(jī)雜質(zhì)，隨后使用氨水和雙氧水的混合液，鹽酸和雙氧水的混合液，硫酸和雙氧水的混合液加熱煮沸基片11，并使用去離子水沖洗，去除基片11表面的無(wú)機(jī)雜質(zhì)，此種清洗方式可除去基片10表面的有機(jī)附著物和無(wú)機(jī)顆粒物，將清洗后的基片11用氮?dú)獯蹈珊笱b入培養(yǎng)皿中，之后放入真空干燥箱內(nèi)前烘，前烘的溫度一般高于100攝氏度，前烘操作目的是去除基 片11本身附帶的水蒸氣；步驟2 :將平板基片11進(jìn)行表面處理，所述的表面處理是采用親水處理。為了增大液滴在基片表面的吸附性，防止液滴移動(dòng)，打亂陣列，對(duì)基片11表面進(jìn)行親水處理，具體處理方法為生長(zhǎng)二氧化硅層、硅烷化處理或氧等離子體處理。步驟3 :將平板基片11置于3D打印平臺(tái)，此3D打印平臺(tái)包括噴墨式打印平臺(tái)、接觸式打印平臺(tái)或針式打印平臺(tái)。步驟4 :利用3D打印平臺(tái)上的多個(gè)噴頭41，對(duì)平板基片11進(jìn)行液滴21和油滴31交替的進(jìn)行定量噴射打印，使平板基片11表面上形成油包液滴陣列結(jié)構(gòu)；其中液滴21是PCR反應(yīng)試劑。油滴和液滴的噴射體積可以精確控制，并在液滴或油滴在到達(dá)基片之前進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。通過(guò)軟件分析液滴21和油滴31，得到油滴21和液滴31的直徑、體積、出射速度和出射偏角等相關(guān)參數(shù)。通過(guò)軟件調(diào)節(jié)噴射的各個(gè)參數(shù)，從而獲得符合體積和速度要求的液滴21和油滴31。液滴的體積可以從幾個(gè)皮升至微升量級(jí)精確控制。油滴或液滴體積無(wú)上限，可以通過(guò)在同一位置多次重復(fù)噴射得到大體積的油滴或液滴。通過(guò)軟件設(shè)定需要打印的圖形，利用3D打印平臺(tái)即可打印出任何形狀的圖形，及任意排布的陣列結(jié)構(gòu)。與其他油包液滴結(jié)構(gòu)的制備方法相比，本制備方法產(chǎn)生的油包液滴結(jié)構(gòu)可以有序排列，而非混合無(wú)序狀態(tài)。步驟5 :在平板基片11的四周固定擋墻，使平板基片11形成一凹槽51 ；步驟6 :在平板基片11上的凹槽51中加滿過(guò)量的油。為避免液滴在熱循環(huán)過(guò)程中揮發(fā)，對(duì)步驟4中所得油包液滴陣列基片，進(jìn)行封裝。采用厚油層密封法，將密封用油注入到基片上的點(diǎn)樣區(qū)，形成厚油層，全部覆蓋油包液滴陣列。密封方法除了厚油層密封法，還有凝膠覆蓋法或夾具密封法。步驟7 :取一透明蓋片61 ;同樣采用步驟I中的清洗方法將透明蓋片61清洗干凈并烘干。步驟8 :將透明蓋片61水平覆蓋在基片11上，壓住油層，蓋合并固定后形成數(shù)字PCR反應(yīng)芯片。完成制備。此種方法不需要任何復(fù)雜的微結(jié)構(gòu)，即可制備數(shù)字PCR反應(yīng)芯片。綜上所述，一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法至少具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，提出了一種結(jié)合3D打印平臺(tái)和數(shù)字PCR的陣列式油包液滴芯片結(jié)構(gòu)的制備方法。2.本發(fā)明一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，將較為成熟的3D打印平臺(tái)與數(shù)字PCR反應(yīng)巧妙結(jié)合，芯片制作步驟快速簡(jiǎn)便，基于3D打印技術(shù)的高速打印功能，大規(guī)模陣列式反應(yīng)體系可以在很短時(shí)間內(nèi)得到，非常高效。3.本發(fā)明一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，可以無(wú)需任何復(fù)雜芯片結(jié)構(gòu)，省去了繁瑣的微加工工藝，大大簡(jiǎn)化了制作工藝，并降低了芯片制作成本。4.本發(fā)明一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，是通過(guò)3D打印平臺(tái)定點(diǎn)定量打印的功能完成陣列式反應(yīng)體系的形成，因此無(wú)需復(fù)雜的微流控液路，極大地降低了數(shù)字PCR反應(yīng)芯片的制作難度，而且降低了制作成本。5.本發(fā)明一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法借助3D打印技術(shù)，可以精確控制噴射液滴的體積，動(dòng)態(tài)范圍很大，可完成從幾個(gè)皮升至幾百個(gè)皮升的精確噴點(diǎn)。6.本發(fā)明一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，制備簡(jiǎn)便，耗材少、成 本低，極具產(chǎn)品化潛力。以上所述，僅是本發(fā)明的實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟 步驟1:取一帶有微孔陣列結(jié)構(gòu)的基片； 步驟2 :將基片進(jìn)行表面處理； 步驟3 :將基片置于3D打印平臺(tái)平臺(tái)； 步驟4 :利用3D打印平臺(tái)上的多個(gè)噴頭，對(duì)基片進(jìn)行油滴和液滴交替的定量噴射打印，使基片表面的微孔中形成油包液滴陣列結(jié)構(gòu)； 步驟5 :在基片上的微孔陣列結(jié)構(gòu)中注滿過(guò)量的油； 步驟6:取一透明蓋片； 步驟7 :將透明蓋片固定蓋合于基片上，完成制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中該基片的材料為石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纖面板或有機(jī)薄片的材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中3D打印平臺(tái)包括噴墨式打印平臺(tái)、接觸式打印平臺(tái)或針式打印平臺(tái)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中3D打印平臺(tái)打印的圖形為任何形狀的圖形，及任意排布的陣列結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述的液滴為數(shù)字PCR反應(yīng)試劑。
6.一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟 步驟1:取一平板基片； 步驟2 :將平板基片進(jìn)行表面處理； 步驟3 :將平板基片置于3D打印平臺(tái)； 步驟4 :利用3D打印平臺(tái)上的多個(gè)噴頭，對(duì)平板基片進(jìn)行油滴和液滴交替的定量噴射打印，使平板基片表面上形成油包液滴陣列結(jié)構(gòu)； 步驟5 :在平板基片的四周固定擋墻，使平板基片形成一凹槽； 步驟6 :在平板基片上的凹槽中加滿過(guò)量的油； 步驟7 :取一透明蓋片； 步驟8 :將透明蓋片固定蓋合于平板基片上，完成制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中該基片的材料為石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纖面板或有機(jī)薄片的材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中3D打印平臺(tái)包括噴墨式打印平臺(tái)、接觸式打印平臺(tái)或針式打印平臺(tái)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中3D打印平臺(tái)打印的圖形為任何形狀的圖形，及任意排布的陣列結(jié)構(gòu)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述的液滴為數(shù)字PCR反應(yīng)試劑。
全文摘要
一種基于3D打印平臺(tái)的數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟步驟1取一帶有微孔陣列結(jié)構(gòu)的基片；步驟2將基片進(jìn)行表面處理；步驟3將基片置于3D打印平臺(tái)平臺(tái)；步驟4利用3D打印平臺(tái)上的多個(gè)噴頭，對(duì)基片進(jìn)行油滴和液滴交替的定量噴射打印，使基片表面的微孔中形成油包液滴陣列結(jié)構(gòu)；步驟5在基片上的微孔陣列結(jié)構(gòu)中注滿過(guò)量的油；步驟6取一透明蓋片；步驟7將透明蓋片固定蓋合于基片上，完成制備。本發(fā)明使用3D打印技術(shù)構(gòu)建皮升量級(jí)的反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)體系內(nèi)的擴(kuò)增反應(yīng)。不僅效率高，而且成本低，為數(shù)字PCR的產(chǎn)品化提供了最大的可能性。
文檔編號(hào)C12M1/00GK103013813SQ20121055184
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者孫英男, 魏清泉, 俞育德, 周曉光, 韓偉靜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院半導(dǎo)體研究所