用于檢測多種腫瘤相關基因mRNA的核酸檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了用于檢測腫瘤相關基因mRNA表達的核酸檢測試劑盒，本發明屬于生命科學和生物【技術領域】，特別是一種基因檢測試劑盒。本發明檢測試劑盒包括以下各組分：組織裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品；本發明采用探針實時熒光定量PCR技術，能夠在同一個反應管中對腫瘤組織中ERCC1、TUBB3、RRM1等基因表達水平進行檢測，不僅操作簡便、可重復性強，還可有效節約時間，提高檢測精度。
【專利說明】用于檢測多種腫瘤相關基因mRNA的核酸檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于生命科學和生物【技術領域】，特別是一種基因檢測試劑盒，采用探針實時熒光定量PCR技術，能夠在同一個反應管中對腫瘤組織中ERCCl、TUBB3、RRMl等基因表達水平進行檢測，可有效節約時間，提高檢測精度。
【背景技術】
[0002]腫瘤是全球疾病致死的重要元兇之一。據統計，全球新腫瘤患者每10萬人中就有173人，在中國每10萬人中有110人。相對于其他疾病，腫瘤臨床治療的有效率目前仍然偏低。隨著人類基因組學、藥物基因組學及腫瘤分子生物學研究的不斷深入和發展，人們對腫瘤多成因、異質性的特點有了更加全面的認識。個體化治療已經成為腫瘤臨床治療的發展方向和最有效的手段。但是，如何識別具有相同腫瘤發生部位、相同病理類型及病期的不同患者之間存在的差異成為實施個體化治療的主要障礙。大量的臨床研究和試驗結果表明:特異腫瘤分子標志物是識別患者個體差異的重要依據，實現對這些靶標的檢測是實施腫瘤個體化治療的前提和基礎。越來越多的證據顯示，腫瘤藥物作用路徑的相關靶標如ERCCl基因mRNA表達水平是識別患者個體差異的最主要靶標。通過針對不同癌種的系統靶標檢測，篩選適合患者個體的藥物，提高治療的針對性和有效率。[0003]ERCCl參與鉬類藥物造成的DNA損傷修復，DNA修復能力與鉬類藥物的多藥耐藥有密切關系。Lord等曾報道NSCLC患者應用吉西他濱/順鉬方案，ERCCl mRNA低表達的中位生存期明顯高于ERCCl mRNA高表達的。結果提示了 ERCCl表達水平與順鉬療效呈負相關。因此，ERCCl高表達可能意味著對順鉬耐藥，ERCCl表達陰性的患者能夠從含順鉬的輔助化療中明顯受益。在人體細胞中存在7種β微管蛋白同型，目前紫杉醇類藥物耐藥涉及各個微管蛋白同型。其中β微管蛋白III表達與作用微管類化療藥物的敏感性顯著相關。所以，國內外的研究結果顯示β微管蛋白III高表達可能提示對紫杉醇類藥物有耐藥，而低表達則對紫杉醇類藥物敏感，β微管蛋白III可以作為是否選擇紫杉醇類藥物輔助化療的分子標志物。RRMl是核苷酸還原酶的亞結構，核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸是DNA合成的重要步驟，吉西他濱則是通過競爭，影響DNA的合成而起到殺傷腫瘤的目的。RRMl過表達時則會影響吉西他濱的療效。因而RRMl是判斷是否選用吉西他濱化療的分子標志物，臨床上對于RRMl低表達患者可選擇吉西他濱進行化療，高表達者不適宜用吉西他濱。
[0004]腫瘤治療能否真正實現“個體化”，最終還要依賴于靶標相關基因mRNA表達水平和蛋白表達水平的檢測的結果是否準確可靠。如何確保靶標檢測結果的準確可靠是目前實施腫瘤個體化治療面臨的最大挑戰。在實際應用中，用于檢測ERCC1、TUBB3、RRMl等基因表達的方法主要是免疫組化，盡管該法原理簡單，但是實驗過程過于繁瑣，需要實際種類繁多，且實驗結果需要經驗豐富的專家來判讀，純在較大的主觀性。這促使我們尋找新的方法來檢測腫瘤相關基因mRNA表達水平。
[0005]實時熒光定量PCR法具有較高的靈敏度和特異性，而且能對PCR進行實時在線檢測，反應化療相關基因在組織中的初始含量，實驗節約了大量的檢測時間，還避免了遺留污染的發生。常見的方法有SYBR Green染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBRGreen由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針雜交法成本有比較昂貴。因此本研究采用實時熒光PCR技術結合Taqman探針法應用于腫瘤相關基因檢測。

【發明內容】

[0006]鑒于現有技術中檢測ERCC1、TUBB3、RRMl基因表達量的不足，本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術檢測相關基因。通過調整兩個基因的引物探針濃度及比例，優化PCR的反應體系和反應條件，開發一種在同一個反應管中檢測ERCCl、TUBB3、RRMl三個基因mRNA表達的核酸檢測試劑盒。
[0007]用于檢測ERCCl、TUBB3、RRMl三個基因mRNA的核酸檢測試劑盒，包含組織裂解液、RNA提取液、PCR反應液、檢測反應液、內參反應液、陽性對照品和陰性對照品；其特征在于:
[0008]PCR反應液包含PCR緩沖液、dNTP、Mg2+ ;檢測反應液包含檢測用上下游引物和相對應探針、內參反應液包含參照用上下游引物Actin-F/Actin-R探針Actin-Probe ;其中進一步的，檢測用上下游引物和探針的比例優化為SEQ-F =SEQ-R =SEQ-Probe的摩爾比為2:2:
1。參照用上下游引物和探針的比例優選為:HPRT1-F =HPRTl-R =HPRTl-Probe的摩爾比為2:
2:1。所述陽性對照品是已構建包含ERCC1、TUBB3、RRM1基因的質粒；所述陰性對照品為無質粒的溶液。RNA提取液可以用商業產品OMEGA FFPE RNA Kit石蠟抽提試劑盒代替。
[0009]使用本發明的試劑盒，將熒光實時PCR技術結合采用Taqman探針，可以對ERCCl、TUBB3.RRM1三種基因mRNA進行檢測，檢測精確度高，而且操作簡單，可以降低檢測成本，節約檢測時間。利用閥值比較法，將檢測結果與正常人的表達水平相比，能衡量受檢者體內三種基因表達是否正常，該方法是一種新型的用于評價患者化療基因表達的方法，有助于相應化療藥物的選擇與治療方案的確定。由于引入了正常人基因，不但能夠對受檢者體內相關基因表達量進行檢測，還能與正常人相比，指導后期用藥，提高患者生存率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是陽性對照示意圖
[0011]圖2是陰性對照示意圖
[0012]圖3是基因檢測結果不意圖
【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0014]試驗例1 本發明試劑盒臨床樣本的檢測試驗
[0015]1、抽提石蠟組織RNA
[0016]1.1轉移3-8石臘切片至1.5離心管,加入1 mL 二甲苯,振蕩10秒混合均勻。室溫下1000OXg離心2分鐘，小心吸棄上層液體。[0017]1.2加入ImL無水乙醇沖洗沉淀，以消除殘留的二甲苯。室溫下1000OXg離心2
分鐘,棄去液體。
[0018]1.3打開離心管，371:干燥15分鐘，直到所有殘留乙醇蒸發。
[0019]1.4 加入 200 uL Buffer FTL 和 20 uL OB Protease，震蕩混勻。
[0020]1.555°C靜置15 min，然后80°C靜置15分鐘。10000Xg離心5分鐘，轉移上清液
到一個新的離心管。
[0021]1.6加入220uLBuffer GTC,震蕩混勻。加入660uL無水乙醇，震蕩混勻。
[0022]1.7把RNA微洗脫柱放入提供的2 ml收集管中。從第10步轉移700ul至洗脫柱中，包括任何可能形成的沉淀。10000 Xg離心I分鐘，丟棄通過的液體，在第12步中重復使
用收集管。
[0023]1.8重復步驟11，直到所有液體通過RNA微洗脫柱，丟棄通過液體和收集管。
[0024]1.9把洗脫柱放入新的2ml收集管，加入500uL乙醇稀釋的RWB WashBuffer洗滌。10000Xg離心I分鐘，丟棄液體。重復上述步驟,10000Xg離心2分鐘干燥洗脫柱。
[0025]1.10把洗脫柱放入無菌1.5ml離心管，加入15_50uLDEPC水，室溫靜置3分鐘。1000OXg離心I分鐘以洗脫柱里RNA。
[0026]2、冰凍組織RNA提取
[0027]1
[0028]2
[0029]2.1樣品處理50_100mg組織中加入1ml TRIzol試劑。
[0030]2.2將上述樣品于15_30°C靜置5min，使核蛋白充分解離。
[0031]2.3加入0.2ml氯仿，蓋緊蓋子，充分劇烈振蕩15s并于15_30°C靜置2_3min。
[0032]2.4于2-8°C 12000g離心15min。離心后樣品分層，上層水相中含RNA，下層有機相中含蛋白和DNA。
[0033]2.5取上清，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，于15-30°C靜置IOmin后，在管底會出現膠狀沉淀，即為RNA。
[0034]2.6 于 2_8°C 12000g 離心 IOmin 后棄去上清。
[0035]2.7向沉淀中加入1ml 75%乙醇，輕輕混勻。
[0036]2.8 于 2_8°C 7500g 離心 5min 后棄上清
[0037]2.9將RNA樣品涼干(不要徹底干燥)，加入適量DEPC水溶解(可于55_60°C促溶IOmin)。
[0038]3、參照TAKARA反轉錄試劑將RNA反轉錄為cDNA。
[0039]4、試劑準備
[0040]表1反應體系
【權利要求】
1.一種檢測腫瘤相關基因HiRNA的核酸檢測試劑盒，其特征在于，包括以下各組分:組織裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、檢測用上下游引和探針、陽性對照品和陰性對照品。
2.按照權利要求1所述的腫瘤相關基因mRNA的核酸檢測試劑盒，其特征在于，檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、dNTP、Mg2+、檢測用上下游引物和探針。
3.如權利要求1所述的核酸檢測試劑盒，其特征在于，所述引物與探針為DNA，其中 (1)檢測ERCCl基因的SEQID NO:1~SEQ ID NO: 3所示序列； (2)檢測TUBB3基因的SEQID NO:4~SEQ ID NO:6所示序列； (3)檢測RRMl基因的SEQID NO:7~SEQ ID NO:9所示序列； (4)參照基因HPRTl基因的SEQID NO: 10~SEQ ID NO: 12所示序列。
4.按照權利要求1所述的腫瘤相關基因mRNA的核酸檢測試劑盒，其特征在于:所述的熒光報告基團包括FAM、HEX、ROX熒光報告基團；所述的熒光淬滅基團包括BHQl熒光淬滅基團。
5.如權利要求1所述的核酸試劑盒，其特征在于各引物及探針的配比如下=SEQ-F:SEQ-R =SEQ-Probe 摩爾比為 2:2:1。
6.如權利要求1所述的核酸試劑盒，其特征在于HPRTl-F=HPRTl-R =HPRTl-Probe的摩爾比為2:2:1。
7.如權利要求1所述的核酸試劑盒，其特征在于所述陽性對照品是已構建包含相關基因的質粒；所述陰性對照品為無質粒的溶液。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898196SQ201210570149
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優先權日:2012年12月25日
【發明者】郜恒駿, 姚健, 張可浩, 盛海輝 申請人:泰州醫藥城博奧邦科生物科技有限公司