懸滴板的制作方法
【專利摘要】包含預定數量的小滴區室（10）的懸滴板（1），每一小滴區室（10）都能接收一滴液體。各個小滴區室（10）都包含圍繞各個空腔（100）排列的環狀微流潤濕屏障（102），其防止小滴延伸到微流潤濕屏障（102）外。此外，各個區室（10）包含封閉的底部（101）和至少一個額外的環狀微流潤濕屏障（104），每一額外的環狀微流潤濕屏障（104）都圍繞前面的環狀微流潤濕屏障（102）排列。在兩個鄰近排列的微流潤濕屏障之間排列了可潤濕區域（103）。
【專利說明】懸滴板
[0001]本發明涉及根據獨立權利要求的懸滴板。
[0002]普遍認同的是在許多應用和測定中，例如在藥物研發中或者在毒性測定中，在三維構型中培養的細胞比在經典的二維(單層)培養中的細胞在生理學上更相關。建議將懸滴板用于形成此類三維細胞團聚體。將具有懸浮細胞的細胞培養基的液滴放置在此種平板的培養區室或者孔中，然后倒轉該平板。由于不存在細胞粘附可以使用的基質，所以細胞在懸滴的頂點積累，并形成三維細胞團聚體。在使用胚胎干細胞的情況下，這些干細胞下沉到小滴的頂點，在此處它們會合形成三維細胞團聚體，稱為擬胚體(embryoid body)。
[0003]WO 2010/031194中顯示了不必倒轉平板的懸滴板。在該參考文獻中顯示的平板包含平板主體、第一和第二共面表面，以及穿過整個主體(垂直地從第一(上)表面到第二(較低的)表面)的多個導管。導管包含與第一(上)表面鄰近的漏斗形入口區室、與第二(較低的)表面鄰近的倒轉的漏斗形培養區室，以及在入口區室和培養區室之間排列的毛細管部分。提供了這樣的浮雕結構，其具有各個邊緣從主體的第二(較低的)表面伸出并圍繞每一培養區室的形式。這些邊緣防止液滴延伸到邊緣外。
[0004]通過入口區室和毛細管部分將含有細胞的液體引入到培養區室中。例如，可以以這種方式將含有干細胞的液體培養基引入到培養區室中，然后將具有懸滴的平板培養預定的時間間隔，以使細胞團聚體形成三維擬胚體。在一段時間后必須供應新鮮液體培養基的情況下，這通過以下進行:經由入口區室和毛細管部分(例如借助于移液管)吸出“舊”液體培養基，然后以上述方式供應“新鮮”液體培養基。
[0005]盡管WO 2010/031194所述的平板通常適合于培養細胞以形成 三維細胞團聚體，所述平板仍有改進的空間。例如，為了經由入口區室和毛細管部分吸出舊的液體培養基，需要吸出裝置(例如，移液管)，且必須將所述吸出裝置緊密地貼合到入口區室壁上，以實現完全吸出。同樣這也適用于隨后供應新鮮液體培養基。然而，更重要地，各個培養區室中懸滴的穩定性是唯一受限制的。另一缺點是液體可以以不受控制的速率經打開的入口區室蒸發。
[0006]因此，本發明的目的是提出懸滴板，其克服了與懸滴的穩定性和液體的蒸發相關的前述問題。此外，應當容易地進行液體培養基的額外的供應和替換。
[0007]為了實現前述目的，本發明提出了懸滴板，通過涉及此種懸滴板的獨立權利要求的特征詳細說明了所述懸滴板。根據本發明的懸滴板的其他實施方案是從屬權利要求的主題。
[0008]特別地，本發明提出了包含預定數量的小滴區室的懸滴板，每一小滴區室均能接收一滴液體。各個小滴區室均包含圍繞各個空腔排列的環狀微流潤濕屏障，其防止小滴延伸到微流潤濕屏障外。此外，各個區室包含封閉的底部和至少一個額外的環狀微流潤濕屏障，每一額外的環狀微流潤濕屏障均圍繞前面的環狀微流潤濕屏障排列，在兩個鄰近排列的微流潤濕屏障之間排列了可潤濕區域。
[0009]特別地，當與WO 2010/031194所示的懸滴板相比時，培養區室的封閉底部構型，以及環狀潤濕屏障起著提高從各個培養區室中落下的懸滴的穩定性的作用，并且與WO2010/031194的懸滴板(其中在入口區室存在空氣的入口)相比，認為這歸因于本發明的懸滴板不存在空氣的入口。此外，由于不存在空氣入口，所以極大地減少了液體的蒸發。
[0010]此外，盡管必須再次倒轉懸滴板，以給已經包含在培養區室中的小滴供應另外的液體培養基的小滴，從而形成較大的小滴，然而這可以以容易且方便的方式進行。這首先歸因于良好的小滴穩定性，其次歸因于額外的環狀微流潤濕屏障，以及額外的環狀微流潤濕屏障和前面環狀微流潤濕屏障之間的可潤濕區域，所述可潤濕區域允許容易地供應另外的液體培養基的小滴。通過所述額外的微流屏障防止了如此形成的較大小滴的鋪展，以使平板再次倒轉后，較大小滴維持了懸滴構型的良好穩定性。通常，并不限制額外的微流潤濕屏障的數量，然而，在實踐性實施方案中，可以存在僅一個或者兩個額外的微流潤濕屏障。
[0011]在根據本發明懸滴板的一個實施方案中，各個小滴區室是孔,而在另一個實施方案中，小滴區室可以由平面(分別由微流潤濕屏障圍繞)形成。
[0012]在根據本發明懸滴板的進一步的實施方案中，環狀微流潤濕屏障包含環狀邊緣，并且至少一個額外的環狀微流潤濕屏障包含至少一個額外的環狀邊緣。每一額外的環狀邊緣圍繞前面的環狀邊緣排列，可潤濕區域排列在兩個鄰近排列的環狀邊緣之間。在該實施方案的其他變型中，兩個鄰近的環狀邊緣以階梯方式(stepped manner)排列。
[0013]在進一步的實施方案中，根據本發明的懸滴板由其中具有預定數量的洞的單獨制造的平板和相應的預定數量的單獨制造的孔(形成小滴區室)構成，其中將每一單獨制造的孔壓入到單獨制造的平板的各個洞中。這允許容易地制造平板和孔，所述平板和孔可以由聚苯乙烯或者任何其他合適的物質制成?？梢酝ㄟ^將孔壓入到空洞中來容易地組合單獨制造的平板和孔。盡管將孔超聲波焊接到平板的內表面是一般的選擇(在這種情況下，平板可以不包含洞)，但將孔壓入到洞中是優選的，因為超聲波焊接使得孔中含有的內含物的顯微鏡分析更加困難。
[0014]在根據本發明懸滴板的進一步的實施方案中，從形成平板外表面的平板側面將單獨制造的孔壓入到洞中 。這允許容易地進行平板和孔的裝配，其可以自動化地進行。在優選的實施方案中，根據本發明的懸滴板可以包含24個孔、96個孔或者384個孔。
[0015]在根據本發明的懸滴板的另一個實施方案中，環狀微流潤濕屏障包含環狀邊緣，并且至少一個額外的微流潤濕屏障包含額外的環狀邊緣，每一額外的環狀邊緣圍繞前面的環狀邊緣，并且可潤濕區域排列在兩個鄰近排列的環狀邊緣之間。在該實施方案的一個變型中，鄰近的環狀邊緣以階梯方式排列，而在該實施方案的另一個變型中，環狀邊緣排列在一個平面上。
[0016]本發明的另一方面涉及組裝的懸滴板，其包含根據本發明的如上所述的懸滴板和接收板。懸滴板具有預定數量的小滴區室或孔，以及接收板，所述接收板具有的孔的數量和懸滴板的小滴區室或孔的預定數量相對應。以這樣的方式裝配懸滴板和接收板:在這種裝配狀態下，接收板的孔與懸滴板的小滴區室或孔以對齊的方式排列。這種裝配允許通過離心該裝置將三維細胞團聚體從懸滴板容易地轉移到接收板的孔中。
[0017]本發明的另一方面涉及測試物質對細胞的毒性的方法。該方法包括步驟:
[0018]a)將預定數量的液滴引入到相應數量的懸滴板的培養區室中，每一小滴含有預定體積的待測試物質和預定體積的液體培養基，以及多個細胞；
[0019]b)在懸滴板攜帶小滴的情況下，將懸滴板倒轉并以這樣的方式培養預定的時間間隔，所述方式使得小滴可以從各個培養區室中垂下，以允許細胞在各個小滴中形成三維細胞團聚體，
[0020]c)在培養區室中將額外的液體培養基供應給培養區室中的小滴，以促進三維細胞團聚體額外地生長；和
[0021]d)分析三維細胞團聚體，以評估待測試的物質是否對三維細胞團聚體有毒。
[0022]在根據本發明的方法中，如上所述使用根據本發明的懸滴板，并且步驟c)通過以下進行:再次倒轉懸滴板，將一滴額外的液體培養基加入到含有三維細胞團聚體的各個小滴中，以在各個培養區室中形成各個較大的小滴。然后，再次倒轉懸滴板，以允許三維細胞團聚體在從所述小滴區室中垂下的各個較大的小滴中生長。
[0023]當討論根據本發明的懸滴板的優點時，上文已經提及了這些優點。此外，所述懸滴板允許至少一些處理步驟的自動化，例如，供應額外的液體培養基的自動化。
[0024]根據本發明的方法的一個實施方案進一步地包括以下步驟:
[0025]e)將生長的三維細胞團聚體從懸滴板的培養區室轉移到相應數量的接收板的孔中；
[0026]f)將接收板培養另外的預定時間間隔，所述接收板具有含三維細胞團聚體的孔；和
[0027]g)培養后，分析三維細胞團聚體，以評估待測試物質是否對三維細胞團聚體有毒。在根據本發明的方法的該實施方案的優選變型中，步驟e)通過以下進行:以接收板的各個孔與懸滴板的各個培養區室相對排列的方式來裝配懸滴板和接收板，隨后進行裝配平板的離心。這允許將三維細胞團聚體從懸滴板方便地且自動地轉移到接收板的各個孔中。
[0028]在根據本發明的方法的另外的實施方案中，細胞是胚胎干細胞，并且三維細胞團聚體是擬胚體。通過分析擬胚體是否含有心肌細胞來進行分析三維細胞團聚體以評估待測試物質是否對三維細胞團聚體有毒的步驟。該實施方案是方便的，因為心肌細胞是跳動的，所以可以容易地檢測心肌細胞在三維細胞團聚體中的存在。
[0029]借助于附圖，從實施方案的以下詳細描述中可看出本發明的其他有利方面是顯而易見的，其中:
[0030]圖1顯示根據本發明的懸滴板的第一個實施方案的透視圖，其中一個孔含有小滴，并且其中另一個孔含有已經加入了額外的小滴的小滴；
[0031]圖2顯示圖1的懸滴板的實施方案的俯視圖；
[0032]圖3顯示在懸滴板再次倒轉的情況下，沿圖2中的線II1-1II的剖視圖；
[0033]圖4顯示在懸滴板倒轉的情況下，沿圖2中的線II1-1II的剖視圖；
[0034]圖5顯示圖4的細節V的放大圖；
[0035]圖6顯示圖1的懸滴板的實施方案的一個孔的放大圖；
[0036]圖7顯示根據本發明的懸滴板的第二個實施方案的孔的剖視圖，該孔含有小滴；
[0037]圖8顯示在已經加入了額外的小滴的情況下，懸滴板的第二個實施方案的孔；
[0038]圖9顯示在已經加入另一個額外小滴的情況下，懸滴板的第二個實施方案的孔；
[0039]圖10顯示根據本發明的懸滴板的第三個實施方案的剖視圖，該小滴區室含有小滴；
[0040]圖11顯示在已經加入了額外的小滴的情況下，根據本發明的懸滴板的第三個實施方案；
[0041]圖12顯示在已經加入了另一額外的小滴的情況下，根據本發明的懸滴板的第三個實施方案；
[0042]圖13顯示在又加入了另一額外的小滴的情況下，根據本發明的懸滴板的第三個實施方案；
[0043]圖14顯示在又加入了另一額外的小滴的情況下，根據本發明的懸滴板的第四個實施方案；
[0044]圖15顯示胚胎干細胞測定的實施方案，其中使用根據本發明的懸滴板；
[0045]圖16以透視圖顯示根據本發明的24孔懸滴板的實施方案的單獨制造的孔；
[0046]圖17以剖視圖顯示圖16的孔；
[0047]圖18顯示根據本發明的24孔懸滴板的實施方案的單獨制造的平板的俯視圖，可以將圖16的單獨制造的孔插入到所述平板的洞中；
[0048]圖19顯示圖18的平板的仰視圖；
[0049]圖20顯示圖18和圖19的平板的細節的放大圖，所述平板包括待插入孔中的一個洞；
[0050]圖21顯示24孔懸滴板的俯視圖，其中將圖16的孔插入到圖18的平板的洞中；
[0051]圖22顯示圖21的24孔懸滴板的剖視圖；
.[0052]圖23顯示圖21的24孔懸滴板的仰視圖；
[0053]圖24顯示圖22的剖視圖的細節，所述剖視圖包括插入到一個洞中的一個孔；
[0054]圖25顯示其他的24孔板的實施方案的透視圖，可以將圖21的24孔懸滴板安裝(與圖15所示的裝配相似)到所述24孔板上；
[0055]圖26顯示圖25的其他24孔板的實施方案的剖視圖；
[0056]圖27顯示圖21的24孔懸滴板的透視圖，將所述懸滴板安裝到圖25中所示的其他的24孔板上；
[0057]圖28顯示圖27中所示的平板裝配的剖視圖；
[0058]圖29以放大的透視圖顯示根據本發明的96孔懸滴板的實施方案的單獨制造的孑L ；
[0059]圖30以剖視圖顯示圖29的孔；
[0060]圖31顯示圖29的孔的細節，所述孔包括形成微流潤濕屏障的階梯狀環狀邊緣；
[0061]圖32顯示根據本發明的96孔懸滴板的實施方案的單獨制造的平板的俯視圖，可以將圖29的單獨制造的孔插入到所述平板的洞中；
[0062]圖33顯示圖32的平板的剖視圖，所述平板包括圖29的孔可以插入的洞；
[0063]圖34顯示圖32的平板的仰視圖；
[0064]圖35顯示96孔懸滴板的俯視圖，其中將圖29的孔插入到圖32的平板的洞中；
[0065]圖36顯示圖35的96孔懸滴板的剖視圖；
[0066]圖37顯示圖35的96孔懸滴板的仰視圖；
[0067]圖38顯示圖36的剖視圖的細節，所述剖視圖包括插入到一個洞的一個孔；
[0068]圖39顯示其他96孔平板的實施方案的俯視圖，可以將圖35的96孔懸滴板安裝(與圖15所示的裝配相似)到所述96孔板上；[0069]圖40顯示圖39的另外的96孔平板的實施方案的剖視圖；和
[0070]圖41顯示圖35的96孔懸滴板的透視圖，其中將所述懸滴板安裝到圖39中所示的其他的96孔板上；；
[0071]圖1至圖6以多種視圖(見上文)顯示了根據本發明的懸滴板I的第一個實施方案或其細節。平板I以孔10的形式包含預定數量的小滴區室。所示的實施方案為24孔板，然而，任何其他數量的孔也是可能的。優選地是根據標準微孔板排列的具有標準化數量的孔的平板，例如96孔板或384孔板。
[0072]通常，盡管孔的不同實施方案是可能的，但懸滴板I的實施方案的孔10具體地如在圖6中的放大圖中所示。孔10以尖銳的環狀邊緣102圍繞具有封閉底部101的第一空腔的形式包含第一環狀潤濕屏障。第二尖銳的環狀邊緣104圍繞第一環狀邊緣102，其中可潤濕區域103排列在第一環狀邊緣102和第二環狀邊緣之間。如在圖6中可見，環狀邊緣以階梯狀方式排列，盡管這并不是強制的。以圍繞第二環狀邊緣104的方式提供環狀斷流器 105。
[0073]當觀察圖3、圖4和圖5時，孔10的幾何學構型的原因變得更加明確，所述圖3、圖4和圖5顯示了將小滴供應給孔10并使得它們從孔10垂下的方法。在圖3中，懸滴板I以再次倒轉的位置顯示，即孔10朝上。在最外層左邊位置排列的孔10中，可以識別出小液滴20。在左邊第二個孔10中，可以識別出較大的小滴21，其通過給小滴20供應另一個液滴獲得，從而形成較大的小滴21?？梢钥闯?，可以例如借助移液管將小滴供應給孔10。特別地，可以借助移液機器人，但也可以手動地將小滴放置于孔10中。此外，在從孔中吸出一些液體的情況下(例如，在預期用“新鮮”液體培養基替換“舊”液體培養基的情況下)，因為小滴是容易接近的，所以可以容易地進行該操作。
[0074]圖4顯示了懸滴板1，在所述懸滴板I的位置上較小的小滴20和較大小滴21從各個孔10中垂下，并且這可以在圖5中最佳觀察，圖5顯示了圖4的細節V。較小小滴20從最外層的左孔10中垂下，而較大小滴21從左邊第二孔10中垂下。
[0075]在圖5和圖6中，更加明確了第一和第二環狀邊緣102和104作為微流屏障防止小滴20和較大小滴21延伸到邊緣外的功能。因此，第一和第二環狀邊緣102和104有助于從各個孔10中垂下的小滴的穩定。對于第二環狀邊緣104，該作用通過環狀斷流器105增強。在第一和第二環狀邊緣102和104之間排列的可潤濕區域103 (見圖6)允許容易地給小滴20添加額外的液滴，以形成較大的小滴21 (見圖4和圖5)?？?0的封閉底部防止液體經由洞或通道穿過底部蒸發，并且由于防止了空氣“從后面”推動小滴，所以還用于穩定從孔中垂下的小滴。
[0076]根據本發明的懸滴板的第二個實施方案分別顯示于圖7至圖9中，其中僅顯示了懸滴板3的單個孔30。該實施方案也包含防止小滴延伸到各個微流屏障外的微流屏障的階梯狀構型，所以一定程度上與上文詳述的第一個實施方案相關外。然而，第二個實施方案與第一個實施方案的不同之處在于，孔30不包含尖銳的邊緣而包含具有封閉底部300的空腔301，圍繞空腔301并朝孔30的開口端伸出到空腔外的第一環狀邊緣302圍繞所述封閉底部300。圖7顯示了從孔30中垂下的小液滴40。通過形成微流屏障的第一環狀邊緣302將小滴40保留在空腔301中。
[0077]圖8不同于圖7，因為已經將另一液滴加入到液滴40中，以形成較大的小滴41。通過圍繞第一環狀邊緣302的第二環狀邊緣304，以及在第一環狀邊緣302和第二環狀邊緣304之間排列的可潤濕區域303保留較大的小滴41。此外，第二環狀邊緣304起著防止較大小滴41延伸到邊緣304外的微流屏障的作用。
[0078]圖9不同于圖8，因為又將另一液滴加入到較大的小滴41中，以形成更大的小滴42。通過圍繞第二環狀邊緣304的第三環狀邊緣306，以及在第二環狀邊緣304和第三環狀邊緣306之間排列的可潤濕區域305保留小滴42。此外，第三環狀邊緣306起著防止更大的小滴42延伸到邊緣306外的微流屏障的作用。
[0079]圖10-圖14顯示了根據本發明的懸滴板5的第三個實施方案的單個小滴區室50。懸滴板5的實施方案與上文詳述的第一個和第二個實施方案的不同之處在于:區室50并不包含階梯狀構型的微流屏障，而包含環狀邊緣形式的微流屏障，所述環狀邊緣排列在低于平板5的表面的平面上的。區室50也包含封閉底部500，同時空腔501與圍繞空腔501的第一環狀邊緣502結合，并從平板5的較低表面伸出。圖10顯示了從區室50中垂下的小液滴64。通過形成微流屏障的第一環狀邊緣502將小滴64保留在空腔501中。
[0080]圖11不同于圖10，因為將又一液滴加入到液滴64中，以形成較大的小滴65 (此夕卜，作為第一個步驟，可以將較大的小滴41引入到小滴區室50中)。通過圍繞第一環狀邊緣302的第二環狀邊緣504，以及在第一環狀邊緣502和第二環狀邊緣504之間排列的可潤濕區域503保留較大的小滴65。此外，第二環狀邊緣504起著防止較大小滴65延伸到邊緣504外的微流屏障的作用。
[0081]圖12顯示了更大的小滴66，通過圍繞第二環狀邊緣504的第三環狀邊緣506，以及在第二環狀邊緣604和第三環狀邊緣506之間排列的另外的可潤濕區域505保留小滴66。第三環狀邊緣506也起著防止小滴66延伸到邊緣506外的微流屏障的作用。
[0082]圖13顯示了更大的小滴67，通過圍繞第三環狀邊緣506的第四環狀邊緣508，以及在第三環狀邊緣506和第四環狀邊緣508之間排列的又一可潤濕區域507保留小滴67。第四環狀邊緣508起著防止更大的小滴67延伸到邊緣508外的微流屏障的作用。
[0083]最后，圖14顯示了更大的小滴68，通過圍繞第四環狀邊緣508的第五環狀邊緣510，以及在第四環狀邊緣508和第五環狀邊緣510之間排列的另一可潤濕區域509保留小滴68。第五環狀邊緣510以如上所述的相同方式，起著防止更大的小滴68延伸到邊緣510外的微流屏障的作用。
[0084]在圖15中，顯示了代表根據本發明的方法的實施方案的胚胎干細胞測定的實施方案，其中可以使用根據本發明的懸滴板的任一上述實施方案。對于測定法的以下描述，假定使用根據本發明的懸滴板I的第一個實施方案。在測定法的這個實施方案中，測試了物質對擬胚體的毒性。為此，將預定數量的液滴引入到相應數量的小滴區室或孔中。每一小滴含有預定體積的待測試物質和液體培養基，以及多個干細胞82。在懸滴板I的第一個實施方案的情況下，當平板I處于再次倒轉的位置(見圖4)，可以將24滴小滴20引入到相應的孔10中。在已經將小滴20引入到孔10中后，倒轉平板1，并將其與具有相應數量的孔70的另一個平板7 (孔70與懸滴板I的孔10相對排列)裝配，以形成封閉的裝置?？?0也可以含有培養基。如在上文所詳細說明的，如此形成的裝置可以使小滴20從孔10中垂下。將如此形成的裝置(見圖15，左上)培養預定的時間間隔，例如3天。在培養期間，在各個小滴中含有的干細胞82在各個小滴20中，在小滴的頂部，即在小滴20的最低點沉降并形成三維擬胚體83 (更通常地，三維細胞團聚體)(見圖15，右上)。
[0085]第一個培養期后，需要給小滴20供應額外的液體培養基，以促進擬胚體83的額外生長。為此，重新打開該裝置，并再次倒轉平板I。在這種再次倒轉的位置下，將額外的液體培養基供應給各個孔10中的各個小滴20，以形成更大的小滴21。一旦已經供應了額外的液體培養基(用于形成更大的小滴21)，就再次將平板I倒轉，并將平板I與其他平板7 (平板7的孔70也可以含有新鮮的液體培養基)重新裝配。將如此形成的裝置培養另外的預定時間間隔，例如2天，以允許擬胚體的進一步生長。
[0086]在另一個培養期后，可以通過離心，將擬胚體83轉移到平板7 (接收板)的孔70中，這可以用本領域熟知的離心裝置進行。在將擬胚體83離心到含有液體培養基的平板7的孔70中后，可以將裝置培養另一預定的時間間隔，例如5-7天。擬胚體83沉降到平板7的各個孔70的平板底部。
[0087]這這個培養期之后，可以重新打開所述裝置，并檢查細胞團聚體，測定待測試物質是否對細胞有毒。當考慮多種類型的分析時，一種類型的分析是借助于顯微鏡分析細胞團聚體。因為細胞團聚體靜止在平板7的孔的底部上，所以顯微鏡分析是可能的。例如，可以檢查細胞團聚體，以確定它們是否含有心肌細胞，這是因為心肌細胞收縮和擴張(它們跳動)，所以在顯微鏡下，可以容易地鑒定這種類型的細胞。
[0088]任選地是通過離心進行擬胚體或三維細胞團聚體至另外的平板7的孔70的前述轉移。備選地，可以重新打開所述裝置，并可以以基于離心，使擬胚體或細胞三維細胞團聚體從小滴的頂部朝孔10的底部101移動的方式，將平板I安裝到離心機上(見圖6)。隨后，由于擬胚體排列在孔10的底部101上，所以可以借助于顯微鏡分析平板的孔10中的擬胚體，所述孔10的底部101形成了用于顯微鏡分析的穩定背景。
[0089]圖16-圖24顯示了根據本發明的懸滴板6的另一個實施方案(圖21-圖23)。該實施方案包括單獨制造的孔60 (見圖16和圖17)，可以將其壓入到單獨制造的平板61的洞610中(見圖18-圖20)。從圖 17所示的單獨制造的孔60的剖視圖中可以看出，孔60包含第一環狀邊緣602、第二環狀邊緣604和第三環狀邊緣606。借助于圖7、圖8和圖9已經詳細描述了孔和第一、第二以及第三環狀邊緣的結構和功能，因此參考上述的這些部分。在所示的實施方案中，從形成平板61的外表面611的平板61側，將孔60壓入到平板61的洞610中。一旦將全部孔60均壓入到洞610中，孔60與平板61固定連接，并完成了懸滴板6的形成(圖21-圖24)。
[0090]備選地，可能的是單獨制造的孔60與平板61的內表面612連接(例如通過超聲波焊接或者通過粘合)。在這種情況下，平板61可以不包含洞。然而，將孔60超聲波焊接和粘合到平板61的內表面612的位置可能是可見的，并可能使得孔內含物的顯微鏡分析更加困難。因此，優選的是將孔60壓入到平板61的洞610中。
[0091]圖25和圖26顯示了另一個平板8的實施方案，其包含的孔80的數量相應于懸滴板6的孔60的數量。此外，另一個平板8的孔80以相應于懸滴板6的孔60的排列方式排列。
[0092]在圖27和圖28中可以看出，可以以堆疊的方式將懸滴板6安裝在另一個平板8上，以使懸滴板6的每一孔60均排列在另一個平板8的相應孔80之上。對于圖15，已經詳述了此種裝配的一個目的，因此參考上述的這些部分。[0093]借助于圖16-圖28，僅描述了 24孔板或者24孔板的裝置，然而，可以將相似的考慮應用于96孔板，這在下文中是明確的。
[0094]圖29-圖38顯不了表現為96孔懸滴板的根據本發明的懸滴板9的又一實施方案(圖35-圖37)。與24孔實施方案相似，96孔實施方案包括單獨制造的孔90 (見圖29和圖31)，可以將其壓入到單獨制造的平板61的洞910中(見圖32-圖34)。從圖30和圖31所示的單獨制造的孔90的剖視圖中可以看出，孔90包含第一環狀邊緣902、第二環狀邊緣904和第三環狀邊緣906。借助于圖7、圖8和圖9已經詳細描述了孔和第一、第二以及第三環狀邊緣的結構和功能，因此參考上述的這些部分。在所示的實施方案中，從形成平板91的外表面911的平板91側，將孔90壓入到平板91的洞910中。一旦將全部孔90均壓入到洞910中，孔90將與平板91固定連接，并完成懸滴板9的形成(圖35-圖38)。
[0095]圖39-圖41顯示了另一個平板92的實施方案，所述平板92包括的孔920的數量相應于懸滴板9的孔90的數量。此外，另一個平板92的孔920以相應于懸滴板9的孔90的排列方式排列。
[0096]在圖41中可以看出，可以以堆疊的方式將懸滴板9安裝在另一個平板92上，以使懸滴板9的每一孔90均排列在另一個平板92的相應孔920之上。
[0097]不言而喻 ，前述實施方案僅是根據本發明的方法、懸滴板和懸滴板的多種應用的一個實例，因此它們并不意在限制本發明。相反，預期通過所附權利要求來限定所保護的范圍。
【權利要求】
1.懸滴板(I；3 ；5 ；6 ;9)，其包含預定數量的小滴區室(10 ；30 ；50 ；60 ;90)，每一小滴區室均能接收液體的小滴(20、21 ;40、41、42 ;60、61、52、63、64)，所述各個小滴區室(10 ；30 ；50 ；60 ；90)包含圍繞各個空腔(100 ；500)排列并防止小滴延伸到微流潤濕屏障外的環狀微流潤濕屏障(102 ；302 ；502 ；702 ;902)， 其中所述各個小滴區室(10 ；30 ；50 ；60 ;90)包含封閉底部(101 ;501)和至少一個額外的環狀微流潤濕屏障(104 ;304、306 ;504、506、508、510 ;604、606 ;904、906)，所述每一額外的環狀微流潤濕屏障(104 ;304、306 ;504、506、508、510 ;604、606 ;904、906)均圍繞前面的環狀微流潤濕屏障(102 ;302、304 ;502、504、506、508 ;604、606 ;904、906)排列，在兩個鄰近排列的微流潤濕屏障之間排列著可潤濕區域(103 ;303、305 ;503、505、507、509)。
2.根據權利要求1的懸滴板，其中所述各個小滴區室是孔(10；30 ；60 ;90)。
3.根據權利要求1或2中任一項的懸滴板，其中所述環狀微流潤濕屏障包含環狀邊緣(102)，并且其中所述至少一個額外的環狀微流潤濕屏障包含至少一個額外的環狀邊緣(104)，所述每一額外的環狀邊緣(104)均圍繞前面的環狀邊緣(102)排列，在兩個鄰近排列的環狀邊緣(102、104)之間排列著所述可潤濕區域(103)。
4.根據權利 要求3的懸滴板，其中所述兩個鄰近的環狀邊緣(102、104)以階梯方式排列。
5.根據權利要求1或權利要求2的懸滴板，其中所述環狀微流潤濕屏障包含環狀邊緣(302 ；502 ；602 ;902)，并且其中所述至少一個額外的微流潤濕屏障包含額外的環狀邊緣，所述每一額外的環狀邊緣(304、306 ;504、506、508、510 ;604、606 ;904、906)均圍繞前面的環狀邊緣(302、304 ;502、504、506、508 ;602、604 ;902、904)，在所述兩個鄰近排列的環狀邊緣之間排列著可潤濕區域(303、305 ;503、505、507、509)。
6.根據權利要求5的懸滴板，其中所述鄰近排列的環狀邊緣(302、304、306;602、604、606 ;902、904、906)以階梯方式排列。
7.根據權利要求2-6中任一項的懸滴板(6;9)，其中所述懸滴板由其中具有預定數量的洞(610 ;910)的單獨制造的平板(61 ;91)和相應的預定數量的單獨制造的孔(60 ;90)構成，所述孔形成小滴區室，將所述每一單獨制造的孔(60 ；90)壓入到所述單獨制造的平板(61 ；91)的各個洞(610 ；910)中。
8.根據權利要求7的懸滴板(6;9),其中從形成所述平板(6 ;9)的外表面(611、911)的平板(6 ;9)側面，將所述單獨制造的孔(60 ;90)壓入到所述洞(610 ；910)中。
9.根據權利要求7或權利要求8的懸滴板，其包含24孔懸滴板、96孔懸滴板或384孔懸滴板。
10.根據權利要求5的懸滴板，其中所述環狀邊緣(503、504、506、508、510)排列在一個平面上。
11.懸滴板裝置，其包含根據權利要求1-10中任一項的懸滴板(I；3 ；5 ；6 ;9),所述懸滴板具有預定數量的小滴區室(10 ；30 ；50 ；60 ；90)或孔，以及接收板(7)，所述接收板(7)具有的孔(70)的數量相應于所述懸滴板的小滴區室(10 ；30 ；50 ；60 ；90)或孔的預定數量，所述懸滴板(I ；3 ；5 ；6 ;9)和所述接收板(7)以這樣的方式裝配:在這種裝配狀態下，所述接收板的孔(70)與所述懸滴板的小滴區室(10 ；30 ；50 ；60 ；90)或孔以對齊的方式排列。
12.測試物質對細胞的毒性的方法，其包括步驟:a)將預定數量的液滴(20;40;64)引入到相應數量的懸滴板(1;3;5;6;9)的小滴區室(10; 30; 50; 60; 90)中，每一小滴含有預定體積的待測試物質和預定體積的液體培養基，以及多個細胞(82)； b)在所述懸滴板攜帶所述小滴(20;40; 64)的情況下，將所述懸滴板(I; 3; 5; 6; 9)倒轉并以這樣的方式培養預定的時間間隔，所述方式使得所述小滴(20;40;64)從各個小滴區室(10 ；30 ；50 ；60 ；90)垂下，以允許所述細胞(82)在所述各個小滴(20;40;64)中形成三維細胞團聚體(83)， c)在所述各個小滴區室(10;30; 50; 60; 90)中將額外的液體培養基供應給所述小滴(20; 40; 64)，以促進所述三維細胞團聚體(83)額外地生長；和 d)分析所述三維細胞團聚體(83)，以評估待測試的物質是否對所述三維細胞團聚體(83)有毒。 其中，使用根據前述權利要求任一項的懸滴板(1;3;5;6;9)，并且其中步驟c)通過以下進行:再次倒轉所述懸滴板(1;3;5;6;9)，將所述一滴額外的液體培養基加入到含有所述三維細胞團聚體的所述各個小滴中，以在所述各個小滴區室(10;30;50;60;90)中形成各個較大的小滴(21; 41，42; 65，66，67，68)，然后，再次倒轉所述懸滴板(I; 3; 5; 6; 9)，以允許所述三維細胞團聚體(83)在從所述小滴區室(10; 30; 50; 60; 90)中垂下的所述各個較大的小滴(21; 41，42; 65，66，67，68)中生長。
13.根據權利要求12的方法，其進一步包括步驟: e)將所述生長的三維細胞團聚體(83)從所述懸滴板(1;3;5;6;9)的小滴區室(10; 30; 50; 60; 90)轉移到相應數量的接收板(7)的孔(70)中； f)將接收板(7)培養另外的預定時間間隔，所述接收板(7)具有含三維細胞團聚體`(83)的孔(70);和 g)培養后，分析所述三維細胞團聚體，以評估待測試物質是否對三維細胞團聚體有毒。
14.根據權利要求13的方法，其中所述步驟e)通過以下進行:以所述接收板(7)的各個孔(70)與所述懸滴板(I ；3 ；5 ；6 ;9)的各個小滴區室(10; 30; 50; 60; 90)相對排列的方式裝配所述懸滴板(I ；3 ；5 ；6 ;9)和所述接收板(7)，隨后離心所裝配的平板。
15.根據權利要求13或14中任一項的方法，其中所述細胞(82)是胚胎干細胞，并且所述三維細胞團聚體(82)是擬胚體，并且其中通過分析所述擬胚體是否含有心肌細胞，來進行分析所述三維細胞團聚體(83)以評估所述待測試物質是否對所述三維細胞團聚體有毒的步驟。
【文檔編號】C12M3/00GK103429729SQ201280011537
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2012年3月2日 優先權日:2011年3月3日
【發明者】C·法廷格, P·亞薩, T·基斯林, D·沃格林, T·楚姆斯泰因, C·麥金尼斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司