用于增加植物的碳、氮、生物量和產量的表達構建體和方法
【專利摘要】同化的C和N很大程度地影響植物生長和農作物產量。之前的嘗試企圖用一個或兩個基因改變植物的碳和氮狀態。本發明涉及三個基因的同時共同過表達，其中一個基因(PECPase)有效地捕獲CO2，而另外兩個編碼參與氮同化的酶(Asp?AT和GS)。組合的效果為植物的碳和氮狀態以及生產力的增加。
【專利說明】用于增加植物的碳、氮、生物量和產量的表達構建體和方法
[0001]以下的說明書說具體地描述了本發明及其實施方式。
【技術領域】
[0002]本發明涉及用于增強植物的碳(C)、氮(N)、生物量和產量的表達構建體。
[0003]另外，本發明提供了通過使用前述的表達構建體增強C和N水平并隨之改進植物的生物量和產量的方法，所述構建體利用源自酶(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下稱為“PEPCase”)，谷氨酰胺合成酶(以下稱為“GS”)和天冬氨酸氨基轉移酶(以下稱為“AspAT”))之基因的共同過表達(co-overexpression)。特別地,本發明涉及編碼所述蛋白的核酸序列在植物細胞中表達的轉基因植物。
[0004]更特別地，本發明涉及用實現在組成型啟動子控制下的三個基因的共同過表達的遺傳構建體轉化植物，所述三個基因中一個基因PEPCase編碼負責捕獲CO2的酶，而另外兩個編碼參與N同化的酶(AspAT和GS)，其中N同化所需要的C骨架由PEPCase滿足，其包括用AspAT+GS+PEPCase基因轉化的植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)和此基因在植物中的表達，從而提高植物的C和N狀態以及生物量和產量。
[0005]發明背景和現有技術
[0006]本發明涉及具有三個基因(即AspAT、GS和PEPCase)的共同過表達從而導致C、N含量、生物量和產量組分提高的經轉化植物。PEPC酶(EC.4.1.1.31)是在植物中普遍存在的酶，在HC03_和Mg2+的存在下催化磷酸烯醇丙酮酸(以下稱為“PEP”)的β-羧化，得到草酰乙酸(oxaloacetate)(以下稱為“0ΑΑ”)和無機磷酸鹽(inorganic phosphate)(以下稱為“Pi”)，它主要具有為三羧酸循環補充中間體的回補作用。在高等植物中，有具有不同器官特異性的幾個PEPC酶同種型，他們參與多種功能，包括氣孔開放、果實成熟和種子成熟。C4和CAM植物的葉含有高水平的PEPC酶，其催化光合作用的初始CO2固定。在C3植物的葉中觀察到低得多的PEPC酶水平，其有助于回補功能并在細胞pH調節中發揮作用。
[0007]GS(EC6.3.1.2)催化氨(以下稱為“NH3”)與谷氨酸(以下成為“Glu”)的ATP依賴性縮合產生谷氨酰胺(以下成為“Gin”)。隨后，谷氨酸合酶(GOGAT)轉移Gln的酰胺基到α-酮戊二酸以產生兩個分子的Glu。Gln和Glu 二者是蛋白質、核酸和葉綠素的有機N的主要來源。
[0008]AspAT (EC2.6.1.1)催化天冬氨酸(以下稱為“Asp”)的氨基到α -酮戊二酸以形成OAA和Glu的可逆轉移。在植物中，已提出AspAT發揮幾種代謝作用，包括:在根部同化NH3+的過程中回收C骨架，提供酰胺前體用于主要的氮轉運分子(例如天冬酰胺(以下稱為“Asn”)和酰基脲)的生物合成，在種子填充(filling)期間募集Asn氮以及參與C4植物中的細胞內C穿梭，提供用于Asp家族氨基酸的生物合成的前體。
[0009]在生物量產生、產量或收獲指數方面，植物的表現依賴于多個內部和環境因素。在這些因素中，植物的C和 N水平是控制植物生產力的重要因子之一。越來越多的C和N同化的細節表明，調控系統響應于代謝和環境這兩種因素來協調這些營養物質的攝取和分布。植物感受到其C和N狀態的變化并傳遞該信息給細胞核，在細胞核帶來中基因表達的改變。由于植物生長和農作物產量很大程度地受C和N同化的影響，過去已經進行了很多嘗試來改造有效的C和N同化。然而還沒有報告顯示出植物中C、N狀態、生物量及產量的顯著改進。
[0010]表1舉例說明對于在不同植物中提高C和/或N及生物量的多種策略方面可獲得的信息狀態
[0011]表1
[0012]
【權利要求】
1.SEQ ID N0.7所示的用于AspAT、GS和PEPCase基因之共表達的表達構建體，其包含與至少一個控制序列和轉錄終止子序列相連的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，其中SEQ ID NO:1示出AspAT基因，SEQ ID NO:2示出GS基因以及SEQID NO:3示出PEPCase基因，所述表達構建體可用于使植物相對于野生型或未轉化植物具有提高的碳、氮、生物量和產量。
2.權利要求1所述的表達構建體，其中所述控制序列如SEQID N0.4所示，所述轉錄終止子序列如SEQ ID N0.5所示。
3.權利要求1所述的表達構建體，其中所述控制序列是選自以下的組成型啟動子:CaMV35S啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子。
4.權利要求1所述的表達構建體，其中所使用的終止子優選選自Nos終止子和CaMV3' UTR。
5.權利要求1所述的表達構建體，其中具有所述SEQID N0.7的多核苷酸在植物中過表達。
6.用于制備權利要求1所述的表達構建體的方法，其中所述方法包括以下步驟: i)使用SEQID NO:10和SEQ ID NO:11所示引物擴增編碼SEQ ID NO:1所示基因的cDNA序列，使用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示引物擴增編碼SEQ ID NO:2所示基因的cDNA序列，以及使用SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13所示引物擴增編碼SEQ ID N0:3所示基因的cDNA序列； ii)將在步驟Q)中獲得的SEQID NO:1、2和3的擴增產物獨立地克隆入pGEM_T easy載體中；· iii)將來自步驟(ii)中獲得之陽性克隆的質粒獨立地與PCAMBIA1302—起消化，以及進一步將消化的基因產物與PCAMBIA1302連接并轉化入大腸桿菌(E.coli)DH5a細胞中； iv)對來自步驟(iii)中獲得之陽性菌落的質粒進行測序，確認AspAT::pCAMBIA1302 ；GS::pCAMBIA1302 和 PEPCase::pCAMBIA1302 的框內克隆；
V)使用 SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO:16 ；SEQ ID NO:14 和 SEQ ID NO: 15 以及 SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18所示引物擴增步驟(iv)中獲得的產物； vi)對擴增的GS編碼序列再次獨立地進行克隆、消化、連接和測序以形成GS+pCAMBIA1302，將其進一步被消化并與擴增的AspAT編碼序列之陽性克隆的質粒連接以形成 AspAT+GS+pCAMBIA1302 表達盒； vii)將擴增的PEPCase編碼序列之陽性克隆的經消化質粒與目的pCAMBIA1302連接，所述目的PCAMBIA1302預先克隆有步驟(vi)中獲得的所述AspAT+GS+表達盒，以使得AspA, GS和PEPCase基因被獨立的CaMV35S啟動子和Nos轉錄終止子控制，以形成SEQ IDNO:7所示的單個植物表達構建體AspAT+GS+PECPase。
7.使用權利要求1中所述的表達構建體提高植物的碳、氮、生物量和產量的方法，其中所述方法包括以下步驟: a)用權利要求1所述的表達構建體轉化根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefacians)菌株; b)用步驟(a)中獲得的重組根瘤農桿菌菌株轉化外植體；c)選擇步驟(b)的經轉化外植體以獲得期望的經轉化植物，其相對于野生型植物具有提高的植物碳、氮、生物量和產量水平。
8.權利要求7所述的方法，其中所述經轉化植物選自擬南芥、番茄、馬鈴薯、煙草、玉米、小麥、稻、棉花、芥菜、木豆、豇豆、豌豆、甘蔗、大豆和高粱。
9.權利要求7所述的方法，其中所述經轉化植物相對于野生型表現出約45%至50%的PEPC酶活性增加，至少55%的GS活性增加和55%至60%的AspAT活性增加，從而使得所述植物中碳和氮水平增加。
10.權利要求7所述的方法，其中所述經轉化植物相對于野生型表現出由種子產量和/或莢果產量增加所表明的產量和/或生物量增加。
11.權利要求7所述的方法，其中所述經轉化植物表現出提高的生長特性，所述提高的生長特性的特征在于與野生型或未轉化植物相比嫩枝鮮重、嫩枝干重、根鮮重和根干重增加。
【文檔編號】C12N15/82GK103597081SQ201280027891
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年4月19日 優先權日:2011年4月19日
【發明者】阿尼什·卡奇拉, 蘇倫德·庫馬爾·瓦茨, 帕拉姆維爾·辛格·阿胡賈, 桑賈伊·庫馬爾 申請人:科學與工業研究會