使用具有降低的ispa活性的宿主細胞提高異戊二烯的產量的制作方法

文檔序號：511889閱讀：818來源：國知局

使用具有降低的ispa活性的宿主細胞提高異戊二烯的產量的制作方法
【專利摘要】本發明涉及能夠產生異戊二烯的重組微生物以及利用這種重組微生物以好的效率產生異戊二烯。在本發明中，變更ispA基因的功能活性以在發酵過程中減少工程改造為產生異戊二烯的重組細胞中或由于別的原因易于發生類異戊二烯積聚的細胞中的類異戊二烯分子的產生。該降低的ispA基因功能活性使得宿主微生物中異戊二烯合成增強。
【專利說明】使用具有降低的ISPA活性的宿主細胞提高異戊二烯的產量
[0001] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求于2011年12月23日提交的美國臨時專利申請No. 61/580, 163 和于2012年4月27日提交的美國臨時專利申請No. 61/639,855的優先權，將這兩篇專利申請每一者的公開內容以引用的方式全文并入本文。
[0003] 以引用方式并入本f
[0004] 將如下ASCII文本文件的提交內容以引用的方式全文并入本文：序列表的計算機可讀形式（CRF)(文件名稱：643842004240. txt，記錄日期：2012年12月21日，大小： 65, 536 字節）。

【技術領域】
[0005] 本發明總體涉及用于從培養細胞產生異戊二烯的方法以及包括這些培養細胞的組合物。

【背景技術】
[0006] 異戊二烯（2-甲基-1，3- 丁二烯）是多種合成聚合物（最值得注意的是合成橡膠）的關鍵原料。異戊二烯由多種微生物、植物和動物物種自然產生。具體地講，已經鑒別了兩條進行異戊二烯生物合成的途徑：甲羥戊酸（MVA)途徑和非甲羥戊酸（DXP)途徑。然而，天然存在的生物體的異戊二烯產率沒有商業吸引力。還可以通過分餾石油獲得異戊二烯，但該材料的純化昂貴而且耗時。C5烴流的石油裂解僅生成約15%的異戊二烯。每年大約有800, 000噸順式聚異戊二烯由異戊二烯的聚合反應產生；這種聚異戊二烯大部分用于輪胎和橡膠工業。異戊二烯還被共聚以用作其他產品中的合成彈性體，這些產品例如為鞋類、機械產品、醫療產品、體育用品和乳膠。
[0007] 在微生物中的代謝過程中，甲羥戊酸依賴的生物合成途徑將乙酰輔酶A轉化為異戊烯二磷酸（IPP)和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)。IPP和DMAPP是異戊二烯的前體以及是一類稱為類異戊二烯的高分子量分子的前體。類異戊二烯對大多數活生物體和細胞是至關重要的，為維持細胞膜流動性和電子傳遞提供了手段。
[0008] 關于產生異戊二烯的最新進展公開了以可足以滿足穩定商業過程的速率、滴度和純度產生異戊二烯的方法（參見例如國際專利申請公布此.102009/07667642);然而，仍然需要提高其產量和產率的可供選擇的途徑。
[0009] 本文提供的是培養的重組細胞、這些細胞的組合物以及使用這些細胞來增加異戊二烯的產量的方法。
[0010] 在整篇本說明書中，參考了多個專利、專利申請以及其他類型的出版物（如雜志文章）。特此將本文引用的所有專利、專利申請和出版物以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

【發明內容】
toon] 本文提供的發明特別是公開了包含重組細胞的物質的組合物以及制備和使用這些重組細胞來產生異戊二烯的方法。在一些方面，重組微生物包含具有降低的功能活性的 ispA基因和一種或多種編碼一種或多種異戊二烯合酶和/或MVA途徑酶的核酸。
[0012] 因此，在一些方面，本文提供的是能夠產生異戊二烯的重組細胞，其中所述細胞包含具有降低的功能活性的ispA基因和一種或多種編碼以下物質的核酸：(a)異戊二烯合酶多肽，其中所述異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和（b) -種或多種甲羥戊酸（MVA)途徑多肽，其中在合適的培養基中培養所述重組細胞提供所述多肽的產生和異戊二烯的合成。在其他方面，ispA基因的功能活性通過如下來降低：缺失ispA基因；降低ispA基因表達；降低ispA蛋白活性；降低ispA蛋白表達；或時序調節ispA表達。在另一個方面，ispA基因表達通過將ispA基因設置于弱啟動子的控制下來降低。在一些方面，ispA基因表達通過將ispA基因設置于自動調節啟動子的控制下來降低。在另外其他的方面，ispA蛋白活性通過ispA蛋白與蛋白水解標簽的翻譯融合來降低。在其他方面,ispA蛋白表達通過使用反義 RNA來降低。在一些方面，ispA蛋白表達通過將一個或多個突變引入位于ispA mRNA分子中的核糖體結合位點來降低。在其他方面，ispA基因表達通過HrcA轉錄阻遏蛋白來降低。在另一個方面，ispA蛋白活性通過將內源ispA基因替換為編碼多肽的基因來降低，所述多肽包含的針對DMAPP的Km與由內源ispA基因編碼的多肽的Km相比是增加的。在另一個方面，ispA蛋白活性通過將內源ispA基因替換為包含不同最適溫度的另一基因來降低。
[0013] 在任何本文所述細胞的其他方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬（Pueraria)或楊屬 (Populus)或雜種銀白楊X歐洲山楊（Populus alba X Populus tremula)的多肽或其變體。在另一個方面，所述異戊二烯合酶多肽選自山葛（Pueraria montana)或野葛（Pueraria lobata)、美洲山楊（Populus tremuloides)、銀白楊、黑楊（Populus nigra)、毛果楊 (Populus trichocarpa)或其變體。在其他的方面，所述植物異戊二烯合酶多肽為葛異戊二烯合酶多肽或其變體。在其他的方面，所述植物異戊二烯合酶多肽為桉樹（Eucalyptus)異戊二烯合酶多肽或其變體。在任何本文所述細胞的一些方面，所述編碼（b)的一種或多種 MVA途徑多肽的一種或多種核酸是異源核酸。在一些方面，所述細胞包含一種或多種編碼來自MVA上游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA上游途徑核酸選自AA-輔酶A硫解酶或乙酰乙酰輔酶A合酶、HMG-輔酶A合酶和HMG-輔酶A還原酶核酸。在一些方面，所述細胞包含一種或多種編碼來自MVA下游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA下游途徑核酸選自MVK、PMK和MVD核酸。在一些方面，所述細胞包含一種或多種編碼完整MVA 途徑的MVA途徑多肽的核酸。在一些方面，所述細胞還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸異構酶（IDI)多肽的核酸。在任何本文所述細胞的其他方面，所述細胞還包含1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。在另一個方面，所述（b)的一種或多種編碼DXS多肽的核酸為編碼DXS多肽的異源核酸。在又一個方面，所述（b)的一種或多種編碼DXS多肽的核酸為編碼DXS多肽的內源核酸的拷貝。在任何本文所述細胞的其他方面，將所述一種或多種異源核酸設置于誘導型啟動子或組成型啟動子之下。在另一個方面，將所述一種或多種異源核酸克隆進多拷貝質粒中。在其他方面，將所述一種或多種異源核酸整合進所述細胞的染色體中。
[0014] 在另外其他的方面，該細胞是細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞或酵母細胞。在一個方面，該細胞為細菌細胞。在另一方面，該細菌細胞為革蘭氏陽性菌細胞或革蘭氏陰性菌細胞。在一些方面，該細菌細胞選自大腸桿菌細胞、檸檬泛菌（p.citrea)細胞、枯草芽孢桿菌（B. subtilis)細胞、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis)細胞、遲緩芽胞桿菌（B. lentus) 細胞、短芽孢桿菌（B. brevis)細胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearothermophilus)細胞、嗜堿芽孢桿菌（B.alkalophilus)細胞、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens)細胞、克勞氏芽孢桿菌（B. clausii)細胞、耐鹽芽孢桿菌（B.halodurans)細胞、巨大芽孢桿菌 (B.megaterium)細胞、凝結芽孢桿菌（B.coagulans)細胞、環狀芽孢桿菌（B.circulans) 細胞、燦爛類芽孢桿菌（B. lautus)細胞、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis)細胞、白色鏈霉菌（S. albus)細胞、變鉛青鏈霉菌（S. lividans)細胞、天藍色鏈霉菌（S. coelicolor) 細胞、灰色鏈霉菌（S.griseus)細胞、假單胞菌屬物種（Pseudomonas sp.)細胞和產堿假單胞菌（P. alcaligenes)細胞。在一個方面，該細胞是大腸桿菌。在另一個方面，該細胞是藻類細胞。在又一另外的方面，藻類細胞選自綠藻、紅藻、灰藻（glaucophyte)、綠蝴藻 (chlorarachniophyte)、眼蟲、色藻（chromista)或腰鞭毛蟲類（dinoflagellates)。在另一個方面，該細胞是真菌細胞。在一些方面，真菌細胞是絲狀真菌。在另一個方面，該細胞是酵母細胞。在一個方面，酵母細胞選自酵母屬物種（Saccharomyces sp.)、裂殖酵母屬物種 (Schizosaccharomyces sp·)、畢赤酵母屬物種（Pichia sp.)或假絲酵母屬物種（Candida sp.)。在另一個方面，酵母細胞是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0015] 本文提供的是包含任何本文所公開的細胞的組合物。
[0016] 本文還提供的是產生異戊二烯的方法，包括：(a)在適于合成異戊二烯的條件下培養任何本文所述的重組細胞；以及（b)產生異戊二烯。在一些方面，該方法還包括回收由所述重組細胞產生的異戊二烯。
[0017] 本文提供的是產生異戊二烯的方法，包括（a)培養能夠產生異戊二烯的重組細胞，其中所述細胞包含具有降低的功能活性的ispA基因和一種或多種編碼以下物質的核酸：（i)異戊二烯合酶多肽，其中所述異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和（ii) 一種或多種甲羥戊酸（MVA)途徑多肽，其中在合適的培養基中培養所述重組細胞可提供所述多肽的產生和異戊二烯的合成；以及（b)產生異戊二烯。在一些方面，該方法還包括回收由所述重組細胞產生的異戊二烯。在本文所述方法的其他方面中，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬或楊屬或雜種銀白楊X歐洲山楊的多肽或其變體。在另一個方面，所述異戊二烯合酶多肽選自山葛或野葛、美洲山楊、銀白楊、黑楊、毛果楊或其變體。在其他的方面，所述植物異戊二烯合酶多肽為葛異戊二烯合酶多肽或其變體。在其他的方面，所述植物異戊二烯合酶多肽為桉樹異戊二烯合酶多肽或其變體。在任何本文所述方法的一些方面，所述（b)的一種或多種編碼一種或多種MVA途徑多肽的核酸是異源核酸。在一些方面，所述細胞包含一種或多種編碼來自MVA上游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA上游途徑核酸選自AA-輔酶A硫解酶核酸或乙酰乙酰輔酶A合酶核酸、HMG-輔酶A合酶核酸和HMG-輔酶A還原酶核酸。在一些方面，所述細胞包含一種或多種編碼來自MVA下游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA下游途徑核酸選自MVK核酸、PMK核酸和MVD核酸。在一些方面，所述細胞包含一種或多種編碼完整MVA途徑的MVA途徑多肽的核酸。在一些方面，所述細胞還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸異構酶（IDI)多肽的核酸。在任何本文所述細胞的其他方面，所述細胞還包含1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。在另一個方面，所述（b)的一種或多種編碼DXS多肽的核酸為編碼DXS多肽的異源核酸。在又一個方面，所述（b)的一種或多種編碼DXS多肽的核酸為編碼DXS多肽的內源核酸的拷貝。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖la繪出了 CMP882和CMP884發酵期間的甲羥戊酸進料濃度。圖lb繪出了菌株 CMP882和CMP884發酵期間培養基中的甲羥戊酸積聚。
[0019] 圖2繪出了 CMP882和CMP884發酵期間的法尼基焦磷酸（FPP)濃度。
[0020] 圖3繪出了 CMP882和CMP884在發酵期間的細胞活力。
[0021] 圖4繪出了在菌株CMP882和CMP884發酵期間的呼吸率（CER)。
[0022] 圖5繪出了在發酵期間MVA途徑菌株（CMP457)及與之相比較的野生型對照菌株 (MCM1020)中的 yddV 表達。
[0023] 圖6繪出了菌株CMP457和MCM1020發酵期間的呼吸率（CER)。
[0024] 圖7a繪出了各種工程改造的產異戊二烯菌株的生長曲線（一式二份運行的平均值）。圖7b繪出了各種工程改造的產異戊二烯菌株的比生產率（任意單位）（一式二份運行的平均值）。
[0025] 圖8繪出了 IspA合成基因的核苷酸序列（SEQ ID N0:10)。
[0026] 圖 9 繪出了 pMCM1535 的核苷酸序列（SEQ ID NO: 11)。
[0027] 圖10繪出了質粒構建體pMCM1535。
[0028] 圖11繪出了禽法尼基二磷酸合酶A116W突變體的核苷酸序列（SEQ ID N0:12)。
[0029] 圖12繪出了禽法尼基二磷酸合酶N144'W突變體的核苷酸序列（SEQ ID NO: 13)。
[0030] 圖13繪出了隨時間推移15L發酵中，與對照菌株CMP1043(實心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (實心黑色正方形）所實現的從葡萄糖產生異戊二烯的產率。
[0031] 圖14繪出了隨時間推移15L發酵中，與對照菌株CMP1043(實心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (實心黑色正方形和空心正方形）所實現的異戊二烯滴度。
[0032] 圖15繪出了隨時間推移15L發酵中，與對照菌株CMP1043(實心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (實心黑色正方形）所實現的細胞生產力指數（CPI)。
[0033] 圖16繪出了隨時間推移15L發酵中，與對照菌株CMP1043(實心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (實心黑色正方形）所實現的體積生產率。
[0034] 圖17繪出了隨時間推移15L發酵中，與對照菌株CMP1043(實心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (實心黑色正方形）所實現的比生產率。
[0035] 圖18繪出了用于在大腸桿菌中表達的hrcA的密碼子優化等位基因的核苷酸序列 (SEQ ID N0:14)。
[0036] 圖19繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的從葡萄糖產生異戊二烯的產率。 CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由實心正方形示出。
[0037] 圖20繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的從葡萄糖產生異戊二烯的瞬時產率。CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由實心正方形示出。
[0038] 圖21示出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的細胞生產力指數（CPI)。 CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由實心正方形示出。
[0039] 圖22繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的體積生產率。CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136 (pgl_)由實心正方形示出。
[0040] 圖23繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的比生產率。CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136 (pgl_)由實心正方形示出。
[0041] 圖24繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的從葡萄糖產生異戊二烯的產率。使用_雞腸球菌（E. gallinarum)或鉛黃腸球菌（E. casseliflavus)進行的所有運行（分別是三角形和正方形）均比使用糞腸球菌（E.faecalis)上游途徑酶進行的兩個運行（空心菱形和實心菱形）實現更高的從葡萄糖產生異戊二烯的％產率。從葡萄糖產生的％重量產率計算為：異戊二烯總量（t) / [(進料Wt (0)-進料Wt (t) +83. 5) *0. 59)]，其中0. 59為葡萄糖進料液中葡萄糖的重量百分比，83. 5為在t = 0時分批供料進發酵罐中的該進料的克數。獨立地對每次進料測量其重量％。
[0042] 圖25繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的體積生產率。使用鶉雞腸球菌或鉛黃腸球菌進行的所有運行（分別是三角形和正方形）均比使用糞腸球菌上游途徑酶進行的兩個運行（空心菱形和實心菱形）實現更高的總體積生產率。使用下式計算體積生產率：體積生產率（g/L/hr) = [S(ER(t)/1000*68. 117)]/[t-tJ，其中求和是從 tQ 到 t。未納入罐的周轉時間。
[0043] 圖26繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的比生產率。使用鶉雞腸球菌或鉛黃腸球菌進行的所有運行（分別是三角形和正方形）均比使用糞腸球菌上游途徑酶進行的兩個運行（空心菱形和實心菱形）實現更高的峰值比生產率。使用下式計算比生產率：t匕生產率（mg/L/hr/OD) =HgER*68. 117g/mol/0D。HgER 為異戊二烯放出速率，單位為（mmol/ L/hr)。0D =光密度=550nm下的吸光度*在水中的稀釋系數。
[0044] 圖27繪出了所限定的菌株中的IspA濃度。
[0045] 圖28繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的從葡萄糖產生異戊二烯的產率。具有經修飾的RBS位點的菌株，S卩CMP 1286 (RBS9yddV)、CMP 1284 (RBS3yddV)和 CMP1275(RBSl/3yddV)(分別為空心圓、空心正方形和空心三角形）所實現的從葡萄糖產生異戊二烯的累積％產率與對照菌株（DW719,運行號為20120526和20120565,分別是實心正方形和實心菱形）相似。從葡萄糖產生的％重量產率計算為：異戊二烯總量（t)/[(進料 Wt(0)-進料Wt(t)+83. 5) *0. 59)]，其中0. 59為葡萄糖進料液中葡萄糖的重量百分比，83. 5 為在t = 0時分批供料進發酵罐中的該進料的克數。獨立地對每次進料測量其重量％。
[0046] 圖29繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的從葡萄糖產生異戊二烯的瞬時產率。具有經修飾的RBS位點的菌株，S卩CMP1286(RBS9yddV)、CMP1284(RBS3yddV)和 CMP1275(RBSl/3yddV)(分別為空心圓、空心正方形和空心三角形）所實現的從葡萄糖產生異戊二烯的峰值瞬時產率與對照菌株（DW719,運行號為20120526和20120565,分別是實心正方形和實心菱形）相似。所有經修飾的菌株均在運行前期實現較高的瞬時收率值，而菌株CMP1284在運行末期（56至64小時EFT)時具有最穩健的性能。異戊二烯瞬時產率（g/ g% )計算為：所產生的異戊二烯α「〇/所消耗的葡萄糖
[0047] 圖30繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的體積生產率。具有經修飾的RBS 位點的菌株，即 CMP1286 (RBS9yddV)、CMP1284 (RBS3yddV)和 CMP1275 (RBSl/3yddV)(分別為空心圓、空心正方形和空心三角形）所實現的異戊二烯體積生產率與對照菌株（DW719,運行號為20120526和20120565,分別是實心正方形和實心菱形）相似。使用下式計算體積生產率：體積生產率（g/L/hr) = [Σ (HGER(t)/1000*68. 117)]/[t-t。]，其中求和是從t0至 t。未納入罐的周轉時間。
[0048] 圖31繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的細胞生產力指數（CPI)。具有經修飾的RBS位點的菌株，即CMP1286(RBS9yddV)、CMP1284(RBS3yddV)和 CMP1275(RBSl/3yddV)(分別為空心圓、空心正方形和空心三角形）所實現的CPI與對照菌株（DW719,運行號為20120526和20120565,分別是實心正方形和實心菱形）相似。使用下式計算細胞生產力指數（CPI) :CPI =異戊二烯總克數/干細胞重量總克數。
[0049] 圖32繪出了隨時間推移每個15L發酵中所實現的比生產率。具有經修飾的RBS 位點的菌株，即 CMP1286 (RBS9yddV)、CMP1284 (RBS3yddV)和 CMP1275 (RBSl/3yddV)(分別為空心圓、空心正方形和空心三角形）所實現的異戊二烯比生產率與對照菌株（DW719,運行號為20120526和20120565,分別是實心正方形和實心菱形）相似。使用下式計算比生產率：比生產率（mg/L/hr/OD) = HgER*68. 117g/mol/0D。HgER為異戊二烯放出速率，單位為 (mmol/L/hr)。0D =光密度=550nm下的吸光度*在水中的稀釋系數。
[0050] 圖33繪出了在發酵32小時和44小時后測量的FPP水平。
[0051] 圖34繪出了在發酵32小時和44小時后測量的GPP水平。
[0052] 圖35繪出了在發酵32小時和44小時后測量的DMAPP水平。
[0053] 圖36繪出了在發酵32小時和44小時后測量的IPP水平。
[0054] 圖37繪出了質粒構建體pCHL426。
[0055] 圖 38 繪出了 pCHL426 的核苷酸序列（SEQ ID N0:104)。
[0056] 圖39繪出了質粒構建體pCHL427。
[0057] 圖 40 繪出了 pCHL427 的核苷酸序列（SEQ ID N0:105)。
[0058] 圖41繪出了包含組成型表達的異戊二烯合酶變體的宿主細胞和對比的包含誘導型異戊二烯合酶變體的宿主細胞的生長。
[0059] 圖42繪出了包含組成型表達的異戊二烯合酶變體的宿主細胞和對比的包含誘導型異戊二烯合酶變體的宿主細胞的異戊二烯比生產率。

【具體實施方式】
[0060] 本文提供的發明特別是公開了在重組細胞中產生異戊二烯的組合物和方法，所述重組細胞已工程改造為在發酵期間在精確的時期下調ispA基因的表達或功能活性。本發明是基于這樣的發現：重組細胞在發酵期間ispA基因表達降低導致與不具有降低的ispA 基因功能活性的細胞相比異戊二烯產量水平較高。不受理論束縛，據信降低ispA基因表達和/或功能活性可通過降低較高分子量類異戊二烯分子的產生和積聚從而導致供異戊二烯合成的碳可利用率較高以及細胞活力改善來改善異戊二烯產率。然而，因為ispA基因產生細菌和其他微生物穩健生長所必需的酶，所以完全消除該基因（例如通過基因敲除）對于改善異戊二烯產率而言不是可行的選項，因為據報道其導致細胞生長受損（Fukisaki等人，2005, J. Biochem.(《生物化學雜志》），137(3) :395-400)或導致細胞死亡（www. genome-wise, edu/resources/essential. htm ;Baba 等人， 2006, Mol. Syst. Biol. ，（《分子系統生物學》）2006. 0008)。本發明人已根據他們的如下發現解決了該技術問題：在異戊二烯產生期間（如發酵的線性生長期后）特定地和時間精確地降低ispA基因的表達和/或功能活性可導致重組細胞的異戊二烯產率、滴度、細胞生產力、體積生產率、比生產率和細胞活力較高。
[0061] 誦用摶術
[0062] 除非另外指明，否則本發明的實施將采用分子生物學（包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學領域的常規技術，這些技術均為本領域的現有技術。這些技術在以下文獻中有完整解釋'Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆：實驗室手冊》）"，第三版（Sambrook 等人，2001) ;"01igonucleotide Synthesis (《寡核苷酸合成》Gait 編輯，1984) ;"Animal Cell Culture:A practical approach (《動物細胞培養：實用方法》）"，第三版（J.R. Masters編輯，2000) ;"Methods in Enzymology(《酶學方法》）"（美國學術出版社（Academic Press, Inc·)) ;"Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物學實驗室指南》）"（F.M.Ausubel等人編輯，1987,以及定期更新版本）；"PCR:The Polymerase Chain Reaction(《PCR:聚合酶鏈反應》），'，（Mullis 等人編輯，1994)。Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology3rd revised ed·,(《微生物學和分子生物學詞典第三修訂版》），約翰威立父子出版公司（J. Wiley & Sons)(紐約州紐約市，2006年）以及March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure6th ed.(《馬奇高級有機化學反應、機理和結構，第六版》），約翰威立父子出版公司（紐約州紐約市，2007年），為本領域技術人員提供了關于本申請中所用的許多術語的一般性指導。
[0063] 定義
[0064] 術語"ispA"可以指任何生物體中的任何香葉基轉移酶或法尼基二磷酸（FPP)合酶或異戊烯基轉移酶家族的可催異戊烯二磷酸（IPP)與3, 3-二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP) 或香葉基二磷酸（GPP)縮合以生成FPP的酶的任何成員。在一些實施例中，ispA由ispA基因編碼。
[0065] 術語"異戊二烯"是指2-甲基-1，3- 丁二烯（CAS#78-79-5)。其可以是由DMAPP 消除焦磷酸所得的直接和最終的揮發性C5烴產物。其可能不涉及IPP分子與DMAPP分子的連接或聚合。除非本文中另外指明，否則術語"異戊二烯"通常不旨在受其產生方法的限制。
[0066] 如本文所用，術語"多肽"包括多肽、蛋白質、肽、多肽片段和融合多肽。
[0067] 如本文所用，"分離的多肽"不是多肽文庫（如2種、5種、10種、20種、50種或更多種不同多肽的文庫）的一部分，并且與和其一起存在于自然界中的至少一種組分分離。分離的多肽可例如通過編碼該多肽的重組核酸的表達來獲得。
[0068] 所謂"異源多肽"意指由衍生自其他生物體、物種或菌株而非宿主細胞的核酸序列編碼的多肽。在一些實施例中，異源多肽不同于存在于自然界中相同宿主細胞內的野生型多肽。
[0069] 如本文所使用，"核酸"是指單股或雙股形式的共價連接在一起的兩個或更多個脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
[0070] 所謂"重組核酸"意指這樣的目的核酸，其缺少位于該目的核酸旁側、目的核酸所源自的有機體的天然存在基因組中的一種或多種核酸（如，基因）。因此，該術語包括（例如）摻入載體中、摻入自主復制型質粒或病毒中、或摻入原核生物或真核生物的基因組DNA 中，或者獨立于其他序列作為單獨分子（如，cDNA、通過PCR或限制性核酸內切酶消化制備的基因組DNA片段或cDNA片段）存在的重組DNA。
[0071] 所謂"異源核酸"意指衍生自其他生物體、物種或菌株而非宿主細胞的核酸序列。在一些實施例中，異源核酸不同于自然界中的相同宿主細胞內存在的野生型核酸。
[0072] 如本文所用，"表達控制序列"意指指導目的核酸轉錄的核酸序列。表達控制序列可以為啟動子（例如組成型或誘導型啟動子）或增強子。表達控制序列可以是"天然的"或異源的。天然的表達控制序列衍生自與所表達基因相同的生物體、物種或株系。異源表達控制序列衍生自與所表達基因不同的生物體、物種或株系。"誘導型啟動子"是在環境或發育調節下具有活性的啟動子。
[0073] 所謂"有效連接的"意指核酸表達控制序列（例如啟動子）與第二核酸序列之間的功能性連接，其中該表達控制序列指導對應于該第二序列的核酸的轉錄。
[0074] 如本文所用，術語"基礎培養基"是指含有細胞有可能生長所需的最少營養物，通常不存在氨基酸的培養基。基本培養基通常含有：（1)用于細菌生長的碳源；（2)各種鹽，其可因細菌物種和生長條件而變動；和（3)水。碳源的范圍很大，從簡單的糖如葡萄糖到其他生物質的較復雜水解產物如酵母提取物，如下文更詳細論述的。鹽通常提供必需元素如鎂、氮、磷和硫以允許細胞合成蛋白質和核酸。基本培養基還可補充有選擇劑，例如抗生素，以針對某些質粒的維持等進行選擇。例如，如果微生物對某一抗生素例如氨芐青霉素或四環素具有抗性，則可將該抗生素添加至培養基以便防止缺乏該抗性的細胞生長。培養基可在必要時補充有其他化合物以選擇所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。
[0075] 如本文所用，術語"類異戊二烯"是指數量大且多樣的一類天然存在的有機化合物，其由兩個或更多個烴單元構成，每個單元由以特定模式排列的五個碳原子組成。類異戊二烯可包括（但不限于）萜類化合物（例如半萜類化合物、單萜類化合物、倍半萜類化合物、二萜類化合物、二倍半萜類化合物、三萜類化合物、四萜類化合物和/或多萜類化合物）。如本文所用，明確地將"異戊二烯"從"類異戊二烯"的定義中排除。
[0076] 如本文所用，術語"質量產率"是指重組細胞（如細菌細胞）所產生的產物的質量除以重組細胞所耗費的葡萄糖的質量乘以100。
[0077] 所謂"比生產率"，其意指細菌細胞所生成的產物的質量除以產生產物的時間、細胞密度和培養物體積。
[0078] 所謂"滴度"，其意指重組細胞（例如細菌細胞）所產生的產物的質量除以培養物的體積。
[0079] 如本文所用，術語"細胞生產力指數（CPI) "是指重組細胞（如細菌細胞）所產生的產物的質量除以培養物中產生的重組細胞的質量。
[0080] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域普通技術人員所一般理解的含義相同的含義。
[0081] 如本文所用，除非上下文另有明確說明，否則單數"一個"、"一種"和"該"包括復數指代。
[0082] 在本說明書通篇中給出的每一最大數值限度旨在包括每一較低數值限度，就如同此類較低數值限度在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一最小數值限度將包括每一較高數值限度，就如同此類上限值在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一個數值范圍將包括落入此類較寬數值范圍內的每一個較窄數值范圍，就如同此類較窄數值范圍在本文中全部明確地寫出一樣。
[0083] 能夠增大異戊二烯的產量的重纟目微牛物
[0084] 異戊二烯（2-甲基-1，3-丁二烯）是在大量應用中使用的重要有機化合物。例如，異戊二烯在多種化學組合物和聚合物的合成中，包括在合成橡膠的制備中用作中間體或原料。異戊二烯也是由許多植物和動物天然合成的重要生物材料。甲羥戊酸依賴性生物合成途徑（MVA途徑）是所有高等真核生物和某些細菌中存在的關鍵代謝途徑。除了對蛋白質異戊二烯化、細胞膜維持、蛋白質錨定和N-糖基化等各種各樣的過程中所用的分子的產生是重要的外，甲羥戊酸途徑還提供二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)和異戊烯二磷酸（IPP)的主要來源，這些分子充當類異戊二烯和異戊二烯二者的生物合成的基礎。
[0085] 類異戊二烯化合物如異戊烯基tRNA、類異戊二烯醌和糖載體脂質由包括大腸桿菌在內的許多微生物作為正常代謝的一部分合成（Fujisaki等人，（1989)J.Bacteri 〇l.(《細菌學雜志》）171:5654-5658)。用于類異戊二烯化合物產生的合成途徑的分支點涉及由酶法尼基二磷酸（FPP)合酶催化的反應，該酶使IPP與DMAPP或香葉基二磷酸（GPP)縮合而生成FPP。FPP合酶（EC: 2. 5. 1. 10)屬于轉移酶家族的酶，具體地講是能夠在代謝反應中轉移芳基或除了甲基之外的烷基的那些酶。FPP合酶的其他通用名稱包括香葉基轉移酶、香葉基轉移酶I、異戊烯基轉移酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼焦磷酸合成酶。
[0086] 如上所述，DMAPP和IPP為類異戊二烯和異戊二烯二者的生物合成提供了初始碳源輸入。異戊二烯合酶使用這些分子來催化異戊二烯的產生而FPP合酶則利用它們來產生 GPP和FPP-這兩者則進一步被合成為更大分子量的類異戊二烯分子。因而，不受理論束縛，據信對于工程改造為產生異戊二烯的重組細胞，FPP合酶的酶活性通過使可供由異戊二烯合酶轉化成異戊二烯的DMAPP和IPP分子較少而導致供異戊二烯產生的碳可利用率降低。此外，重組細胞中或由于別的原因易于發生類異戊二烯積聚的細胞中類異戊二烯產量增加與差的形態和降低的細胞活力相關。
[0087] 在諸如大腸桿菌之類的微生物中，FPP合酶由ispA基因編碼（Fukisaki等人， (1990)，J.Biochem.(《生物化學雜志》）108:995-1000)。ispA基因與如下兩個其他基因位于操縱子中：dxs基因，其編碼脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)，以及xseB基因，其產生外切核酸酶 VII 小亞基（Lois 等人，（1998 年 3 月 3 日）Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(《美國國家科學院院刊》）95 (5) :2105-2110)。IspA基因表達據報道是微生物穩健生長所需的，因為完全移除該基因會產生生長速率低于野生型株系的生長速率的細胞（Fukisaki等人，2005, J. Biochem.(《生物化學雜志》）137(3) :395-400)或導致細胞致死（www. genome-wise, edu/resources/essential. htm ;Baba 等人， 2006, Mol. Syst. Biol. (《分子系統生物學》）2006. 0008)。
[0088] 已工程改造為產生異戊二烯的重組細胞在培養中可表現具有兩個階段：1)生長階段，其中重組細胞以線性方式分裂，和2)發酵階段，其中細胞利用碳源（如葡萄糖）來產生異戊二烯。因而，在一些實施例中，重組細胞包含具有降低的功能活性的ispA。在一個方面，ispA的功能活性僅在細胞培養的發酵階段期間降低。在另一個方面，ispA的功能活性在細胞培養期間的線性生長階段期間不降低。在一些方面，ispA的功能活性在細胞培養的生長階段和發酵階段二者中均降低。在又一個方面，ispA的功能活性在細胞培養的生長階段和發酵階段二者中均降低，但是在發酵階段的降低較大。
[0089] 可將任何方法用于降低ispA的功能活性，例如但不限于缺失ispA基因、降低ispA 基因表達或降低由ispA基因編碼的多肽的活性或可利用率。在其他方面，本發明的重組細胞包含具有降低的功能活性的ispA和涉及異戊二烯生物合成的一組基因中的一種或多種，所述一組基因使得能在宿主微生物中合成異戊二烯。在另一個方面，本發明的重組宿主細胞包含為了在宿主細胞中表達而經密碼子優化的重組ispA基因。在一些方面，密碼子優化的ispA基因整合進宿主基因組中。在其他方面，密碼子優化的ispA基因在一段染色體外DNA (如質粒）上表達。在另一個方面，密碼子優化的ispA基因在yhfS基因座處整合進宿主細胞基因組中并且內源ispA基因缺失。
[0090] 在一些方面，本發明的重組宿主細胞包含重組ispA基因，該重組ispA基因編碼的 FPP合酶（例如禽FPP合酶）對DMAPP的Km值與內源編碼的FPP合酶所展現的對DMAPP 的Km值相比增加。這種高Km FPP合酶已經例如在Fernandez等人，Biochemistry (《生物化學》)2000,39(50) :15316-21中進行了描述。在其他方面，本發明的重組宿主細胞可包含具有不同最適溫度的FPP合酶（例如但不限于在Koyama等人，1993，J.Biochem.(《生物化學雜志》），113(3) :355-363中描述的嗜熱FPP合酶）、嗜冷FPP合酶（如在Nichols 等人，2004, J.Bact.(《細菌學雜志》）186:8508-8515中描述的FPP合酶，將其公開內容以引用方式全文并入本文）或來自海洋原核生物的FPP合酶（如在Ranzer等人，2009, Mar. Biotechnol (《海洋生物技術》），11:62-73中描述的FPP合酶）。在一些方面，任何本文所述重組細胞中的內源宿主細胞ispA基因被替換為編碼本文所述FPP合酶的任何備選基因。在其他方面，重組ispA基因設置于誘導型啟動子或組成型啟動子的控制之下。在另一個方面，重組ispA基因在多拷貝質粒上表達。在又一方面，重組ispA基因整合進宿主細胞的染色體中。
[0091] 在一些方面，本發明的重組宿主細胞包含處于弱啟動子（即驅動ispA基因表達的啟動子，其中表達量低于對于內源或野生型ispA啟動子所觀察到的表達量）的控制下的 ispA基因。在一些方面，與發酵階段期間的ispA基因表達相比，在細胞培養期間的線性生長階段，控制ispA基因表達的啟動子可以較高水平表達ispA基因。
[0092] ispA的降低的功能活件
[0093] 在一些方面，本文所述的重組細胞包含具有降低的功能活性的ispA。在該語境中的"降低的功能活性"是指ispA多肽（例如由ispA基因編碼的多肽）將IPP和DMAPP轉化為GPP和/或FPP (即后續產生類異戊二烯所必需的分子）的能力。在一些方面，任何本文所公開的重組細胞可包含ispA基因，其中ispA的功能活性降低而使得與不包含具有降低的功能活性的ispA的細胞中的GPP和/或FPP濃度相比，該細胞產生的GPP和/或FPP 濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、 40 %、45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 % (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含具有降低的功能活性的ispA的重組細胞中的GPP和/或FPP濃度相比，包含一種或多種編碼具有異戊二烯合酶活性的多肽的異源核酸、一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和具有降低的功能活性的ispA、已工程改造為產生異戊二烯的重組細胞產生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。
[0094] 在其他方面，任何本文所公開的重組細胞可包含ispA，其中ispA的功能活性降低而使得與不包含具有降低的功能活性的ispA的細胞中的類異戊二烯濃度相比，該細胞產生的類異戊二烯濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、 25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 % 或 100 % (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在其他方面，任何本文所公開的重組細胞可包含ispA，其中ispA基因的功能活性降低而使得與不包含具有降低的功能活性的ispA的細胞的活力相比，該細胞表現出約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）的改善的活力中的任一者。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA 途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含具有降低的功能活性的ispA的細胞的活力相 t匕，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和具有降低的功能活性的ispA、已工程改造為產生異戊二烯的重組細胞可表現出約5%、10 %、15%、20%、25 %、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）的改善的活力中的任一者。如本文所用，"改善的活力"意指在發酵過程期間產生較少的死亡、瀕死或另外在形態學上異常的細胞。形態異常可包括但不限于伸長的細胞和/或來自死亡或瀕死細胞的細胞碎片。在一些實施例中，"改善的活力"可意指較大數目的細胞通過本領域已知的細胞生物學技術、分子生物學技術或生物化學技術（如但不限于熒光激活細胞分選（FACS)或者DiBAC4(3)染色）測定是有活力的。在一些方面，ispA功能活性在發酵的峰值異戊二烯產生階段期間降低。在其他方面，ispA功能活性在發酵的線性生長階段期間不降低。
[0095] 測量ispA功能活性降低的方法有很多并且是本領域眾所周知的。例如，可將標準方法用于確定細胞中的代謝物（例如FPP和GPP)產量，例如通過從全細胞用化學方法提取代謝物，然后通過質譜法鑒定。相似地，可將標準方法用于測定具有降低的ispA功能活性的細胞的活力，例如通過顯微鏡法進行的形態分析和通過評估膜電位。膜電位保持不變的細胞被認為是活的和代謝活躍的，而沒有膜電位的細胞被認為是死亡的和代謝惰性的。
[0096] ispA某閔的降低的表汰
[0097] 在一些方面，通過降低ispA基因的表達來降低ispA基因的功能活性。這可包括缺失ispA基因本身（全部缺失或部分缺失），或通過用多種本文所述方法或本領域技術人員已知方法來降低其表達。在一些方面，可將啟動子工程轉入細胞來控制ispA基因的表達。在一個方面，驅動ispA基因表達的啟動子可因為類異戊二烯化合物的積聚增加而受到抑制。當引入這種啟動子來控制ispA的表達時，ispA可在對應于流通過類異戊二烯途徑的期間受到阻遏。然而，在通量低的期間，啟動子保持受到誘導并因而允許ispA表達。
[0098] 經由自動調節啟動子講行的時序調節的表汰降低
[0099] 在一些方面，ispA基因表達通過將ispA基因設置于自動調節啟動子的控制下來降低。在某些實施例中，可將僅在已工程改造為產生增加水平的異戊二烯的重組細胞的后期發酵期間受阻遏的啟動子用于降低ispA基因的功能活性。不受理論束縛，假設這種啟動子在類異戊二烯化合物隨發酵進行而積聚增加期間受到阻遏。因而，將ispA基因設置于這些啟動子的控制之下可用于時序調節ispA的表達，使得在對應于通過類異戊二烯途徑的通量增加的時期發生ispA阻遏。然而，在類異戊二烯途徑通量低的時期，例如在發酵的線性生長階段期間，則啟動子將保持受到誘導并從而允許ispA基因的表達。該標記式活性譜 (signature activity profile)構成了自動調節ispA表達控制系統。
[0100] 因此，在一些方面，任何本文所述重組細胞可包含具有降低的功能活性的ispA基因，其中通過將ispA基因設置于自動調節啟動子的控制之下來降低ispA基因的功能活性。在一些方面，自動調節啟動子選自：efeO、kpsC、kpsD、kpsD、kpsE、kpsF、kpsS、kpsU、nmpC、 sodA、ybll29、ybll30、ybll31、yddV 和 ydiU。在一個方面，將 ispA 基因設置于 yddV 啟動子的控制之下。在其他方面，可從重組細胞（例如，重組大腸桿菌細胞）的基因組缺失內源 ispA基因，并且可將新的ispA基因在一不同基因座處替代進基因組中。在一個方面，將異源ispA基因在yhfS基因座處插入進重組細胞（例如，重組大腸桿菌細胞）的基因組中。該異源ispA基因可以與缺失的內源ispA基因相同或可為來自另一來源的ispA基因。在其他方面，處于自動調節啟動子的控制之下的異源ispA基因在染色體外表達。在另一個方面，本發明的重組宿主細胞包含為了在宿主細胞中表達而經密碼子優化的重組ispA基因。在一些方面，密碼子優化的ispA基因整合進宿主基因組中。在另一個方面，密碼子優化的ispA基因處于選自如下的自動調節啟動子的控制之下：efeO、kpsC、kpsD、kpsD、kpsE、 kpsF、kpsS、kpsU、nmpC、sodA、ybll29、ybll30、ybll31、yddV 和 ydiU。在一些方面，密碼子優化的ispA基因處于yddV啟動子的控制之下。在又一個方面，任何本文所述的自動調節啟動子可驅動選自如下的ispA基因的表達：密碼子優化的ispA、編碼的酶與來自微生物的 ispA編碼的酶相比具有較高的Km的ispA等位基因（例如，禽ispA等位基因）和內源ispA 等位基因。
[0101] 在一些方面，與不包含處于自動調節啟動子控制之下的ispA基因的細胞中的GPP 和/或FPP濃度相比，表達處于自動調節啟動子控制之下的ispA基因的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）產生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、 7%,8%,9 %U0%>15%,20 %,25%,30%,35 %,40%,45%,50 %,60%,70%,80 %,90% 或100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于自動調節啟動子控制之下的ispA基因的重組細胞中的GPP和/或FPP濃度相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和處于自動調節啟動子控制之下的ispA基因、工程改造為產生異戊二烯的重組細胞產生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、 7 %,8%,9%U0 %>15%,20%,25 %,30%,35%,40 %,45%,50%,60 %,70%,80%,90 % 或100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在一些方面，與不包含處于自動調節啟動子控制之下的ispA基因的細胞中的類異戊二烯濃度相比，表達處于自動調節啟動子控制之下的ispA基因的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）產生的類異戊二烯濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在其他方面，與不包含處于自動調節啟動子控制之下的ispA基因的細胞的活力相比，表達處于自動調節啟動子控制之下的ispA基因的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）表現出 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）的改善的活力中的任一者。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA 途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于自動調節啟動子控制之下的ispA基因的細胞的活力相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和處于自動調節啟動子控制之下的ispA基因、工程改造為產生異戊二烯的重組細胞可表現出約5%、 10 % U5 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %, 85%、90%、95%或100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）的改善的活力中的任一者。
[0102] 通討異源陽遏蛋白HrcA講行的時序調節的表汰降低
[0103] 控制ispA表達的一種備選方法利用新月柄桿菌（Caulobacter crescentus)的轉錄阻遏蛋白HrcA(Roberts等人，1996，Journal of Bacteriology(《細菌學雜志》）， 178(7):1829-1841 ;Susin 等人，2004，Journal of Bacteriology (《細菌學雜志》）， 186(20) :6759-6767)。編碼HrcA的基因不天然存在于大腸桿菌中并且沒有已知的信息表明CIRCE元件（為HrcA所識別）涉及控制大腸桿菌基因表達。因此，將CIRCE元件摻入進控制大腸桿菌異戊二烯產生系統內的ispA表達的調節序列內將會允許HrcA-介導的ispA 阻遏。此外，可將異源hrcA基因引入進大腸桿菌產異戊二烯宿主中，在該宿主中其表達可通過多種嚴格調節手段中的至少一種來控制。
[0104] 因此，在一些方面，任何本文所述重組細胞可包含具有降低的功能活性的ispA基因，其中通過由hrcA基因編碼的HrcA轉錄阻遏蛋白降低ispA基因的功能活性并且其中將 CIRCE元件工程改造進控制ispA表達的調節序列中。在一些方面，通過線性生長階段調節啟動子控制hrcA表達，所述啟動子是在整個大規模產異戊二烯發酵中細胞的轉錄譜內鑒別的。在一些方面，線性生長階段調節啟動子選自〇tsA、amiB和deoC。
[0105] 在其他方面，可通過正調節回路（positive regulatory-loop)控制hrcA表達，該正調節回路自身經由誘導信號（如嚴重營養限制或改變的溫度）在所需的發酵緩慢生長階段打開。在該方面，反式激活肽如反式激活蛋白T與特定的信號感測啟動子 (signal-sensing promoter)功能性連接。引入誘導信號將會誘導該信號感測啟動子的活性，其繼而上調反式激活蛋白T的表達。通過將另外拷貝的反式激活蛋白T基因連接至反式激活蛋白T依賴性啟動子，正反饋回路被引發并且一旦移除誘導信號就得到維持。在其他方面，將hrcA基因連接至至少一個反式激活蛋白T依賴性啟動子，從而導致在正調節回路激活之后的期間HrcA連續表達。在某些方面，由轉錄激活蛋白T依賴性啟動子驅動的反式激活蛋白T基因位于與hrcA基因相同的操縱子上。在其他方面，由轉錄激活蛋白T依賴性啟動子驅動的反式激活蛋白T基因位于不含hrcA基因的獨立基因座中。
[0106] 在一些方面，與不包含處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的細胞中的GPP 和/或FPP濃度相比，表達處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）產生的GPP和/或FPP濃度小于約1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、6 %、 7 %,8%,9%U0 %>15%,20%,25 %,30%,35%,40 %,45%,50%,60 %,70%,80%,90% 或100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的重組細胞中的GPP和/或FPP濃度相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因、工程改造為產生異戊二烯的重組細胞產生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在一些方面，與不包含處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的細胞中的類異戊二烯濃度相比，表達處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）產生的類異戊二烯濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、 45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 % (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在其他方面，與不包含處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的細胞的活力相 t匕，表達處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）表現出 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）的改善的活力中的任一者。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的細胞的活力相 t匕，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因、工程改造為產生異戊二烯的重組細胞可表現出約5%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）的改善的活力中的任一者。
[0107] 通過木糖調節的i sdA表汰講行的時序調節的表汰降低
[0108] 通過碳源可利用率介導的受調節的基因表達是控制生產宿主（例如大腸桿菌生產宿主）內的ispA基因表達的另一可放大的備選方法。這種方法使得能夠提供健康穩健快速生長的細胞所需的相對正常和/或足夠水平的ispA基因表達，從而快速產生生物量。此夕卜，當據信FPP合酶活性對細胞活力有害從而導致從葡萄糖產生的異戊二烯產率降低時，這種方法使得能夠限制葡萄糖支持的異戊二烯產生期間的ispA表達。
[0109] 因此，在一些方面，任何本文所述重組細胞可包含具有降低的功能活性的ispA基因，其中通過將ispA基因設置于木糖調節的啟動子的控制之下來降低ispA基因的功能活性。在一些方面，重組細胞（如重組大腸桿菌細胞）中的ispA表達設置在重組細胞內的內源xylA或xylF啟動子的直接控制之下或處于由D-木糖正向影響和由葡萄糖負向影響的任何啟動子的控制之下。這可通過缺失內源ispA基因和替代處于xylA或xylF D-木糖響應啟動子的控制下的異源ispA來實現。大腸桿菌反向xylA-xylF啟動子及它們經由D-木糖進行的正向調節和轉錄激活因子XylR以及它們由葡萄糖進行的負向調節和分解代謝物阻遏已經有所描述（S. Song和C. Park, 1997, J. Bacterial.(《細菌學雜志》）， 179(22) :7025-7032)。在一些方面，ispA基因表達通過在不存在葡萄糖時木糖的可利用性來正向控制以及通過葡萄糖的存在來負向控制。在一些方面，木糖誘導型ispA基因座存在于重組細胞（如重組大腸桿菌細胞）的染色體內，但作為另一種選擇，也可在染色體外核苷酸序列如質粒上編碼。木糖誘導型ispA構建體的構造以及其向產異戊二烯大腸桿菌宿主中的引入可使用標準的分子和微生物學技術來進行（J. Sambrook, E. F. Fritsch和 T.Maniatis Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實驗室出版社），NY. 1989)。
[0110] 在一些方面，與不包含處于木糖誘導型啟動子控制之下的ispA基因的細胞中的 GPP和/或FPP濃度相比，表達處于木糖誘導型啟動子控制之下的ispA基因的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）產生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、 6 %,7%,8%,9 %U0%>15%,20 %,25%,30%,35 %,40%,45%,50 %,60%,70%,80 %, 90%或100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于木糖誘導型啟動子控制之下的ispA基因的重組細胞中的GPP和/或FPP濃度相比，包含一種或多種編碼MVA 途徑的一個或多個成員的異源核酸和處于木糖誘導型啟動子控制之下的ispA基因、工程改造為產生異戊二烯的重組細胞產生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、 6%,7%,8 %,9%U0%>15 %,20%,25%,30 %,35%,40%,45 %,50%,60%,70 %,80%, 90%或100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在一些方面，與不包含處于木糖誘導型啟動子控制之下的ispA基因的細胞中的類異戊二烯濃度相比，表達處于木糖誘導型啟動子控制之下的ispA基因的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）產生的類異戊二烯濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在其他方面，與不包含處于木糖誘導型啟動子控制之下的 ispA基因的細胞的活力相比，表達處于木糖誘導型啟動子控制之下的ispA基因的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）表現出5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）的改善的活力中的任一者。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于木糖誘導型啟動子控制之下的ispA基因的細胞的活力相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和處于木糖誘導型啟動子控制之下的ispA基因、工程改造為產生異戊二烯的重組細胞可表現出約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或100 % (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）的改善的活力中的任一者。
[0111] 降低的FPP合酶活件
[0112] 在一些方面，通過降低IspA蛋白FPP合酶的活性來降低ispA基因的功能活性。這可包括抑制IspA mRNA的翻譯或通過用多種本文所述方法降解FPP合酶本身。
[0113] IsdA蛋白與蛋白水解標簽的翻譯融合以降低蛋白質活件
[0114] 在任何本文所述重組細胞的一些方面，通過將編碼11個氨基酸的蛋白質標簽的 DNA序列工程改造進ispA基因中來祀向FPP合酶進行蛋白質水解降解（Andersen等人， 1998, Appl Environ Microbiol.(《應用和環境微生物學》），64(6) :2240-2246)。蛋白水解 tmRNA標簽于是在宿主細胞中靶向FPP合酶進行降解，從而降低FPP合酶活性。在一些方面，蛋白水解標簽融合至FPP合酶蛋白的C末端。在其他方面，蛋白水解標簽融合至FPP合酶蛋白的N末端。
[0115] 在一些方面，與不包含與蛋白水解標簽融合的FPP合酶蛋白的細胞中的GPP和/ 或FPP濃度相比，表達與蛋白水解標簽融合的FPP合酶蛋白的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）產生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含與蛋白水解標簽融合的FPP合酶蛋白的重組細胞中的GPP和/或FPP濃度相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸、已工程改造為產生異戊二烯的表達與蛋白水解標簽融合的FPP合酶蛋白的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）產生的GPP和/或FPP濃度小于約1 %、 2 %,3%,4%,5 %,6 %,7%,8 %,9 % U0 % >15%,20 %,25 %,30 %,35%,40 %,45 %,50%, 60%、70%、80%、90%或100%(包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在一些方面，與不包含與蛋白水解標簽融合的FPP合酶蛋白的細胞中的類異戊二烯濃度相 t匕，表達與蛋白水解標簽融合的FPP合酶蛋白的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）產生的類異戊二烯濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% (包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）。在其他方面，與不包含與蛋白水解標簽融合的IspA蛋白的細胞的活力相比，表達與蛋白水解標簽融合的FPP合酶蛋白的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）表現出 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）的改善的活力中的任一者。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA 途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含與蛋白水解標簽融合的FPP合酶蛋白的細胞的活力相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和ispA基因、表達與蛋白水解標簽融合的FPP合酶蛋白的重組細胞（如任何本文所公開的重組細胞）可表現出約約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括這些百分數，且包括這些值之間的任何百分數）的改善的活力中的任一者。
[0116] 通丄寸j申用反.義mRNA矛口核糖體結合突變講斗〒的IspA蛋白表汰降j氏
[0117] 在一些方面，將針對ispA mRNA的反義mRNA用于防止ispA mRNA翻譯成IspA蛋白并導致IspA蛋白表達降低。反義是本領域眾所周知的并且已經用于大腸桿菌等生物體中來降低諸如乙酸之類的分子的產生（Kim J.和Cha H.J.，2003，Biotech Bioeng.(《生物技術和生物工程》），83:841-853)或用于工程改造過氧化氫酶敲除表型（Chan E.等人， 2010, J. Exp. Microbiol Immunol.(《實驗微生物學和免疫學雜志》），14:127-134)。可使用如下文獻中描述的方法來制備祀向大腸桿菌的ispA基因的反義構建體設計：Shao Y.等人，2006, Nucleic Acids Res.(核酸研究），34:5660-5669。可使用配對的末端使反義RNA 分子穩定化（似1^811；[1]^11等人，2006，池(316；^六(^(18 1^8.(《核酸研究》），34:6138)。在一些方面，反義寡核苷酸長約150bp。可通過本領域已知的任何手段（包括但不限于酶活性測定法、蛋白質印跡法、RNA印跡法或RT-PCR)測量由于反義mRNA處理引起的ispA mRNA 翻譯降低。
[0118] 在其他方面，通過將一個或多個突變引入位于ispA mRNA分子中的一個或多個核糖體結合位點來降低IspA蛋白表達。引入核糖體結合突變可干擾或廢止IspA mRNA的翻譯從而導致IspA蛋白表達降低。可通過本領域已知的任何手段（包括但不限于酶活性測定法或蛋白質印跡法）測量由于將一個或多個突變引入位于ispA mRNA分子中的一個或多個核糖體結合位點而引起的ispA mRNA翻譯降低。
[0119] 可使用本領域已知的優化軟件鑒別具體mRNA中的核糖體結合位點（RBS)的位置。例如，可將使用RNA熱力學參數的RBS calculator優化軟件與Vienna RNA軟件包1. 8. 4 版（可得自 world, wide. web. tbi. univie. ac. at/ ?ivo/RNA/，Gruber 等人，（NAR, 2008)) 和用于RBS calculator的Vienna RNA模塊結合使用。這種RBS calculator優化軟件可用于鑒別對蛋白質表達具有預測效果的RBS。例如，可使用RBS calculator優化軟件鑒別應該會使祀標蛋白質（如ispA)的表達降低的RBS。
[0120] 異戊二烯合酶核酸和多狀
[0121] 在本發明的一些方面，在任何本文所述的組合物或方法中所述的重組細胞還包含編碼異戊二烯合酶多肽或具有異戊二烯合酶活性的多肽的一種或多種核酸。在一些方面，異戊二烯合酶多肽為內源多肽。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸有效連接至組成型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸有效連接至誘導型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸有效連接至強啟動子。在一些方面，使用不止一種編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸（如，2個、3個、4個或更多個拷貝的編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸）。在一個特定方面，對細胞進行工程改造以相對于野生型細胞過表達內源異戊二烯合酶途徑多肽。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸有效連接至弱啟動子。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬或楊屬或雜種例如銀白楊X歐洲山楊的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽來自桉樹。
[0122] 在一些方面，異戊二烯合酶多肽為異源多肽。在一些方面，細胞包含不止一個拷貝的編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至組成型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至誘導型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至強啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至弱啟動子。
[0123] 編碼異戊二烯合酶多肽的核酸可整合進宿主細胞的基因組中，或者可在細胞中穩定表達。編碼異戊二烯合酶多肽的核酸另外可位于載體上。
[0124] 示例性異戊二烯合酶核酸包括編碼具有異戊二烯合酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。異戊二烯合酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)轉化成異戊二烯。示例性的異戊二烯合酶多肽包括具有異戊二烯合酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的異戊二烯合酶多肽和核酸包括來自任何本文所述來源生物體的天然多肽和核酸。此外，異戊二烯合酶的變體可具有改善的活性例如改善的酶活性。在一些方面，異戊二烯合酶變體具有其他改善的特性，例如改善的穩定性（如熱穩定性）和/或改善的可溶性。
[0125] 可使用標準的方法，通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內將DMAPP轉化為異戊二烯的能力，來測定該多肽是否具有異戊二烯合酶多肽活性。細胞提取物中的異戊二烯合酶多肽活性可例如按如下文獻中所描述的進行測量：Silver等人，1995, J. Biol. Chem.(《生物化學雜志》）270:13010-13016。在一個示例性的測定法中，可在氮氣流下將 DMAPP(西格瑪公司（Sigma))蒸發至干燥并在100mM磷酸鉀緩沖液（pH8. 2)中將其再水化至lOOmM的濃度，并保存于-200C下。為了進行該測定法，可將5mL的1M MgCl2、lmM(250mg/ ml)DMAPP、65mL的植物提取緩沖液（PEB)(50mMTris-HCl，pH8.0,20mMMgCl2,5%甘油和 2mM DTT)的溶液添加至20mL頂空小瓶中的25mL的細胞提取物中并在振動下于37°C培養15分鐘，其中該小瓶具有金屬旋蓋和涂有特氟龍的硅隔膜（安捷倫科技公司（Agilent Technologies))。反應可通過加入200μ L的250mM EDTA進行淬滅并通過GC/MS進行定量。
[0126] 在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬的異戊二烯合酶或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自楊屬的異戊二烯合酶或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為白楊異戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為葛異戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬或楊屬或雜種銀白楊X歐洲山楊的多肽或其變體。
[0127] 在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸來自豆科（Fabaceae)，例如蝶形花亞科 (Faboideae)。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸為來自如下的多肽或核酸：山葛（葛） (Sharkey 等人，2005，Plant Physiology (《植物生理學》）137:700_712)、野葛、楊（如銀白楊、黑楊、毛果楊或銀白楊X歐洲山楊（CAC35696) (Miller等人，2001，Planta(《植物學》）213:483-487)、山楊（如美洲山楊）（Silver 等人，1995, JBC270 (22) :13010-1316)、英國橡樹（夏櫟（Quercus robur)) (Zimmer等人，W098/02550)或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自山葛、野葛、美洲山楊、銀白楊、黑楊或毛果楊的異戊二烯合酶或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自銀白楊的異戊二烯合酶或其變體。在一些方面，異戊二烯合酶是香脂楊（Populus balsamifera)(Genbank JN173037)、美洲黑楊 (Populus deltoides)(Genbank JN173039)、弗里芒氏楊（Populus fremontii)(Genbank JNl73〇40)、大齒楊（Populus granididenta)(Genbank JNl73〇38)、柳屬（Genbank JNl73〇 43)、刺槐（Robinia pseudoacacia)(Genbank JNl73〇4l)、紫藤屬（Wisteria) (Genbank JN173042)、藍按（Eucalyptus globulus) (Genbank AB266390)或 Melaleuca alterniflora(Genbank AY279379)或其變體。在一些方面，編碼異戊二烯合酶（如來自銀白楊的異戊二烯合酶或其變體）的核酸經密碼子優化。
[0128] 在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽是天然存在的多肽或核酸（例如，來自楊屬的天然存在的多肽或核酸）。在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽不是野生型或天然存在的多肽或核酸。在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽是野生型或天然存在的多肽或核酸的變體（例如，來自楊屬的野生型或天然存在的多肽或核酸的變體）。
[0129] 在一些方面，異戊二烯合酶多肽為變體。在一些方面，異戊二烯合酶多肽是野生型或天然存在的異戊二烯合酶的變體。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶相比具有改善的活性，例如改善的催化活性。活性（如催化活性）的增加可為至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 95% 中的任一者。在一些方面，諸如催化活性之類的活性的增加為至少約1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任一者。在一些方面，諸如催化活性之類的活性的增加為約10%至約100倍 (如，約20%至約100倍、約50%至約50倍、約1倍至約25倍、約2倍至約20倍或約5倍至約20倍）。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶相比具有改善的溶解性。溶解性的增加可為至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% 中的任一者。溶解性的增加可為至少約1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75 倍或100倍中的任一者。在一些方面，溶解性的增加為約10%至約100倍（如，約20%至約100倍、約50 %至約50倍、約1倍至約25倍、約2倍至約20倍或約5倍至約20倍）。在一些方面，異戊二烯合酶多肽為天然存在的異戊二烯合酶的變體，并與天然存在的異戊二烯合酶相比具有改善的穩定性（如熱穩定性）。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽來自桉樹或其變體。在其他方面，該異戊二烯合酶來自洋槐屬（Robinia)、柳屬（Salix)或白千層屬 (Melaleuca)或其變體。
[0130] 在一些方面，變體具有野生型或天然存在的異戊二烯合酶的活性的至少約10%、至少約20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約 140 %、至少約150 %、至少約160 %、至少約170 %、至少約180 %、至少約190 %、至少約 200%。變體可與野生型或天然存在的異戊二烯合酶具有序列相似性。在一些方面，野生型或天然存在的異戊二烯合酶的變體可與野生型或天然存在的異戊二烯合酶具有至少約 40 %,50 %,60 %,70 %,75 %,80 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或99. 9%中的任一者的氨基酸序列同一性。在一些方面，野生型或天然存在的異戊二烯合酶的變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶具有約70%至約99. 9%、約 75%至約99%、約80%至約98%、約85%至約97%或約90%至約95%中的任一者的氨基酸序列同一性。
[0131] 在一些方面，變體在野生型或天然存在的異戊二烯合酶中包含突變。在一些方面，變體具有至少一個氨基酸置換、至少一個氨基酸插入和/或至少一個氨基酸缺失。在一些方面，變體具有至少一個氨基酸置換。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶之間的不同氨基酸殘基的數量可為一個或多個，例如1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多個氨基酸殘基。天然存在的異戊二烯合酶可包括來自植物的任何異戊二烯合酶，例如葛異戊二烯合酶、楊異戊二烯合酶、英國櫟異戊二烯合酶和柳樹異戊二烯合酶。在一些方面，變體為來自銀白楊的異戊二烯合酶的變體。在一些方面，來自銀白楊的異戊二烯合酶的變體具有至少一個氨基酸置換、至少一個氨基酸插入和/或至少一個氨基酸缺失。在一些方面，變體為截短的銀白楊異戊二烯合酶。在一些方面，編碼變體（如來自銀白楊的異戊二烯合酶的變體）的核酸為密碼子優化的（例如，基于在其中表達異源異戊二烯合酶的宿主細胞而進行密碼子優化的）。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽來自桉樹或其變體。在其他方面，該異戊二烯合酶來自洋槐屬、柳屬或白千層屬或其變體。
[0132] 本文提供的異戊二烯合酶多肽可以是W02009/132220、W02010/124146和美國專利申請公開No. :2010/0086978中所述的任何異戊二烯合酶或異戊二烯合酶變體，將這些專利關于異戊二烯合酶和異戊二烯合酶變體的內容全文以引用的方式明確地并入本文。
[0133] 本文所述啟動子中的任一者（如本文所述的以及在本公開的實例中所鑒定的啟動子，包括誘導型啟動子和組成型啟動子）均可用于驅動任何本文所述異戊二烯合酶的表達。
[0134] 合適的異戊二烯合酶包括但不限于Genbank登錄號AY341431、AY316691、 AY279379、AJ457070和AY182241所標示的那些。可用于本文所述組合物或方法（包括產生編碼本文所述異戊二烯合酶的微生物的方法）中的任一者的異戊二烯合酶類型也在如下參考文獻中描述：國際專利申請公布No. W02009/076676、No. W02010/003007、 No.W02009/132220, No.W02010/031062, No.W02010/031068, No.W02010/031076, No.W02010/013077, No.W02010/031079, No.W02010/148150, No.W02010/124146, No. TO2010/078457、No. TO2010/148256 以及 Sharkey 等人，"Isoprene Synthase Genes Form A Monophyletic Clade Of Acyclic Terpene Synthases In The Tps_B Terpene Synthase Family"，Evolution (《進化》）（2012)(可在線得自 DOI: 10. 1111/evo. 12013)，將上述參考文獻每一者以引用的方式全文并入本文。
[0135] 可制備在表A中所示的殘基位置處具有置換的各種異戊二烯合酶變體。任何本文 (包括表A、權利要求書或實例中）所述的變體均可用于本發明的組合物和方法中。在一些方面，變體包含一個或多個（即2、3、4、5、6個等）來自表A的對應于銀白楊的氨基酸序列的突變。
[0136]

【權利要求】
1. 一種能夠產生異戊二烯的重組細胞，其中所述細胞包含具有降低的功能活性的 ispA基因和一種或多種編碼如下多肽的核酸： (a) 異戊二烯合酶多肽，其中所述異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和 (b) -種或多種甲羥戊酸（MVA)途徑多肽，其中在合適的培養基中培養所述重組細胞提供所述多肽的產生以及異戊二烯的合成。
2. 根據權利要求1所述的重組細胞，其中所述ispA基因的功能活性通過如下來降低： a. 缺失所述ispA基因； b. 降低ispA基因表達； c. 降低ispA蛋白活性； d. 降低ispA蛋白表達；或者 e. 時序調節ispA表達。
3. 根據權利要求2所述的重組細胞，其中ispA基因表達通過將所述ispA基因設置在弱啟動子的控制下來降低。
4. 根據權利要求2所述的重組細胞，其中ispA基因表達通過將所述ispA基因設置在自動調節啟動子的控制下來降低。
5. 根據權利要求2所述的重組細胞，其中ispA蛋白活性通過所述ispA蛋白與蛋白水解標簽的翻譯融合來降低。
6. 根據權利要求2所述的重組細胞，其中ispA蛋白活性通過使用反義RNA來降低。
7. 根據權利要求2所述的重組細胞，其中ispA蛋白活性通過將一個或多個突變引入位于ispA mRNA分子中的核糖體結合位點中來降低。
8. 根據權利要求2所述的重組細胞，其中ispA基因表達通過HrcA轉錄阻遏蛋白來降低。
9. 根據權利要求2所述的重組細胞，其中ispA蛋白活性通過將內源ispA基因替換為編碼這樣的多肽的基因來降低，所述多肽包含的針對DMAPP的Km與由內源ispA基因編碼的多肽的Km相比是增加的。
10. 根據權利要求2所述的重組細胞，其中ispA蛋白活性通過將內源ispA基因替換為包含不同最適溫度的另一基因來降低。
11. 根據權利要求1-10中任一項所述的重組細胞，其中所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽或其變體。
12. 根據權利要求11所述的重組細胞，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬 (Pueraria)或楊屬（Populus)或雜種銀白楊（Populus alba) X 歐洲山楊（Populus tremula)的多肽或其變體。
13. 根據權利要求12所述的重組細胞，其中所述異戊二烯合酶多肽選自山葛 (Pueraria montana)或野葛（Pueraria lobata)、美洲山楊（Populus tremuloides)、銀白楊、黑楊（Populus nigra)、毛果楊（Populus trichocarpa)或其變體。
14. 根據權利要求11所述的重組細胞，其中所述植物異戊二烯合酶多肽是葛異戊二烯合酶多肽或其變體。
15. 根據權利要求11所述的重組細胞，其中所述植物異戊二烯合酶多肽是桉樹 (Eucalyptus)異戊二烯合酶多肽或其變體。
16. 根據權利要求1-15中任一項所述的重組細胞，其中編碼（b)的一種或多種MVA途徑多肽的所述一種或多種核酸為異源核酸。
17. 根據權利要求16所述的重組細胞，其中所述細胞包含一種或多種編碼來自MVA上游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA上游途徑核酸選自AA-輔酶A硫解酶核酸或乙酰乙酰輔酶A合酶核酸、HMG-輔酶A合酶核酸和HMG-輔酶A還原酶核酸。
18. 根據權利要求16所述的重組細胞，其中所述細胞包含一種或多種編碼來自MVA下游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA下游途徑核酸選自MVK核酸、PMK核酸和MVD 核酸。
19. 根據權利要求16所述的重組細胞，其中所述細胞包含一種或多種編碼完整MVA途徑的MVA途徑多肽的核酸。
20. 根據權利要求1所述的細胞，所述細胞進一步包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸 δ-異構酶（IDI)多肽的核酸。
21. 根據權利要求1-20中任一項所述的重組細胞，所述重組細胞進一步包含1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。
22. 根據權利要求21所述的重組細胞，其中所述一種或多種編碼DXS多肽的核酸是編碼DXS多肽的異源核酸。
23. 根據權利要求21所述的重組細胞，其中所述一種或多種編碼DXS多肽的核酸是編碼DXS多肽的內源核酸的拷貝。
24. 根據權利要求1-23中任一項所述的重組細胞，其中所述一種或多種異源核酸被設置于誘導型啟動子或組成型啟動子之下。
25. 根據權利要求1-24中任一項所述的重組細胞，其中所述一種或多種異源核酸被克隆進多拷貝質粒中。
26. 根據權利要求1-25中任一項所述的重組細胞，其中所述一種或多種異源核酸被整合進所述細胞的染色體中。
27. 根據權利要求1-26中任一項所述的重組細胞，其中所述細胞是細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞或酵母細胞。
28. 根據權利要求27所述的重組細胞，其中所述細胞是細菌細胞。
29. 根據權利要求28所述的細菌細胞，其中所述細菌細胞是革蘭氏陽性細菌細胞或革蘭氏陰性細菌細胞。
30. 根據權利要求29所述的細菌細胞，其中所述細菌細胞選自大腸桿菌（E.coli) 細胞、檸檬泛菌（P. citrea)細胞、枯草芽孢桿菌（B. subtilis)細胞、地衣芽孢桿菌 (B.licheniformis)細胞、遲緩芽胞桿菌（B. lentus)細胞、短芽孢桿菌（B. brevis)細胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus)細胞、嗜堿芽孢桿菌（B.alkalophilus)細胞、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens)細胞、克勞氏芽孢桿菌（B. clausii)細胞、耐鹽芽孢桿菌（B. halodurans)細胞、巨大芽孢桿菌（B. megaterium)細胞、凝結芽孢桿菌 (B. coagulans)細胞、環狀芽孢桿菌（B. circulans)細胞、燦爛類芽孢桿菌（B. lautus)細胞、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis)細胞、白色鏈霉菌（S. albus)細胞、變鉛青鏈霉菌 (S. lividans)細胞、天藍色鏈霉菌（S. coelicolor)細胞、灰色鏈霉菌（S. griseus)細胞、假單胞菌屬物種（Pseudomonas sp.)細胞和產堿假單胞菌（P.alcaligenes)細胞。
31. 根據權利要求30所述的細菌細胞，其中所述細菌細胞是大腸桿菌。
32. 根據權利要求27所述的重組細胞，其中所述細胞是藻類細胞。
33. 根據權利要求32所述的藻類細胞，其中藻類細胞選自綠藻、紅藻、灰藻門、綠蜘藻、眼蟲、色藻或腰鞭毛蟲。
34. 根據權利要求27所述的重組細胞，其中所述細胞是真菌細胞。
35. 根據權利要求34所述的真菌細胞，其中所述真菌細胞是絲狀真菌。
36. 根據權利要求27所述的重組細胞，其中所述細胞是酵母細胞。
37. 根據權利要求36所述的酵母細胞，其中所述酵母細胞選自酵母屬物種 (Saccharomyces sp.)、裂殖酵母屬物種（Schizosaccharomyces sp.)、畢赤酵母屬物種 (Pichia sp.)或假絲酵母屬物種（Candida sp.)。
38. 據權利要求37所述的酵母細胞，其中所述酵母細胞是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)〇
39. 包含根據權利要求1-38中任一項所述的細胞的一種組合物。
40. -種產生異戊二烯的方法，所述方法包括：(a)在提供異戊二烯的合成的合適條件下培養根據權利要求1-38中任一項所述的重組細胞；以及（b)產生異戊二烯。
41. 根據權利要求40所述的方法，其還包括回收由所述重組細胞產生的異戊二烯。
42. 根據權利要求40或權利要求41所述的方法，其中所述ispA基因的功能活性通過如下來降低： a. 缺失所述ispA基因； b. 降低ispA基因表達； c. 降低ispA蛋白活性； d. 降低ispA蛋白表達；或者 e. 時序調節ispA表達。
43. 根據權利要求40-42中任一項所述的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽或其變體。
44. 根據權利要求40-43中任一項所述的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬或楊屬或雜種銀白楊X歐洲山楊的多肽或其變體。
45. 根據權利要求40-44中任一項所述的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自選自山葛或野葛、美洲山楊、銀白楊、黑楊和毛果楊的多肽或其變體。
46. 根據權利要求40-43中任一項所述的方法，其中所述植物異戊二烯合酶多肽是葛異戊二烯合酶多肽或其變體。
47. 根據權利要求40-43中任一項所述的方法，其中所述植物異戊二烯合酶多肽是桉樹異戊二烯合酶多肽或其變體。
48. 根據權利要求40-47中任一項所述的方法，其中編碼（b)的一種或多種MVA途徑多肽的所述一種或多種核酸為異源核酸。
49. 根據權利要求40-48中任一項所述的方法，其中所述細胞包含一種或多種編碼來自MVA上游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA上游途徑核酸選自AA-輔酶A硫解酶核酸或乙酰乙酰輔酶A合酶核酸、HMG-輔酶A合酶核酸和HMG-輔酶A還原酶核酸。
50. 根據權利要求40-48中任一項所述的方法，其中所述細胞包含一種或多種編碼來自MVA下游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA下游途徑核酸選自MVK核酸、PMK核酸和MVD核酸。
51. 根據權利要求40-48中任一項所述的方法，其中所述細胞包含一種或多種編碼完整MVA途徑的MVA途徑多肽的核酸。
52. 根據權利要求40-51中任一項所述的方法，所述方法進一步包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸異構酶（IDI)多肽的核酸。
53. 根據權利要求40-52中任一項所述的方法，所述方法進一步包含1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。
54. 根據權利要求40-53中任一項所述的方法，其中所述一種或多種編碼DXS多肽的核酸是編碼DXS多肽的異源核酸。
55. 根據權利要求40-54中任一項所述的方法，其中所述一種或多種編碼DXS多肽的核酸是編碼DXS多肽的內源核酸的拷貝。
【文檔編號】C12N9/10GK104245927SQ201280070444
【公開日】2014年12月24日申請日期:2012年12月21日優先權日:2011年12月23日
【發明者】J·C·麥考利夫, R·E·穆爾, A·T·尼爾森, C·M·派瑞斯, D·V·瓦維林, D·H·韋爾斯申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司

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