專利名稱：谷氨酸棒桿菌突變株及其在發酵法生產l-亮氨酸中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，特別涉及一種谷氨酸棒桿菌突變株，還涉及所述谷氨酸棒桿菌突變株在發酵法生產L-亮氨酸中的應用。
背景技術：
L-亮氨酸是人體八大必需氨基酸(EAA)之一，同時又屬于三種支鏈氨基酸(BCAA)的一種，因其特殊的結構和功能而在人類生命代謝中具有特別重要的地位，廣泛應用于醫藥、食品、飼料、化妝品等領域。L-亮氨酸的生產方法有蛋白質水解提取法(目前國內的主要生產方法)和植物源發酵法(目前國外的主要生產方法)。國內主要采用水解提取法，即從毛發水解提取L-胱氨酸的廢母液中以鄰二甲苯-4-磺酸作沉淀劑提取L-亮氨酸，不但生產環境惡劣，污染嚴重，而且產品中殘留有毒沉淀劑，安全性差，尤其是近年來因瘋牛病及禽流感事件，國際上特別是歐美發達國家對動物源產品的抵制日趨嚴厲，由此推動了發酵法生產L-亮氨酸的開發。T. Takayasu et. al 從乳糖發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869出發，經亞硝基胍誘變處理，選育獲得了 No. 218菌(Ile_ Met^ 2_TAr)，搖瓶產酸達到28g/L (Agr1. Biol. Chem .，39(15),1149 1153,1975)。張素珍等選育得到的鈍齒棒狀桿菌突變株L_421(Ile_，2-TAD，在2000升罐上發酵40小時，產L-亮氨酸20g/L (微生物學通報，1990，6，264 267 )。
劉黨生等從天津短桿菌T6 - 13出發經紫外誘變選育得到的AHVlrRiflr突變株L145，搖瓶產酸32. lg/L，16L罐發酵產酸達21. 8g/L (沈陽藥學院學報，1994，11 (2)，119 123)。天津科技大學選育獲得的黃色短桿菌突變株TK0303 (Met— + IleL+ 2~TAr +a -ABr+ β -HLr+ Rifr+ SGr),在 IOL 罐上發酵產酸達到 30g/L (CN200610013399. 2)，在《L-亮氨酸的發酵中試生產》一文中記載了該菌在5M3發酵罐上中試產酸最高達到26. 5g/L (現代食品科技，2010，26 (12)，1367 1369)。蔡立明等選育得到的谷氨酸棒桿菌突變株JH — 27 (Leuhxr + 2~TAr + a -ABr+β -HLr+ SC)，是以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發菌種，分別經硫酸二乙酯、亞硝基胍和紫外誘變處理篩選得到的一株抗磺胺胍和支鏈氨基酸結構類似物的L-亮氨酸高產菌，搖瓶產酸 30 32g/L，5L 發酵罐產酸 40g/L (CN200510040431.1)。
謝希賢等報道的谷氨酸棒桿菌突變株TG8207 (Met- + IleL + 2-TAr + Leuhxr + NVr+SGr),搖瓶產酸27. 2g/L，IOL罐補料發酵產酸達到44. 5g/L (中國食品學報，2009，9 (2)，29-33)。盡管目前國內報道的L-亮氨酸菌種小試產酸水平逐年提高，但實際上我國發酵法工業化生產L-亮氨酸產量甚少，市場上銷售的L-亮氨酸絕大部分是水解法產品，原因就在于缺乏遺傳標記簡單、培養工藝粗放、適合大規模工業化生產的L-亮氨酸優良菌種。因此，加快選育適合中國國情的粗放型L-亮氨酸優良生產菌，對于早日實現我國發酵法L-亮氨酸生產的穩定化和規模化，意義十分重大。

發明內容
為了解決以上適合大規模工業化的粗放型L-亮氨酸優良生產菌缺乏的問題，本發明提供了一種具有很高的L-亮氨酸生產能力，遺傳標記為L-亮氨酸缺陷回復及α-氨基-β -輕基戍酸抗性的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變株SL-0193(Leu+AHVr),保藏編號為 CGMCC No. 7033。本發明還提供了所述的谷氨酸棒桿菌突變株SL-0193在發酵法生產L-亮氨酸中的應用。所述應用包括以下步驟
(O將谷氨酸棒桿菌突變株SL-0193接種于搖瓶種子培養基中，在往復式搖床上，3rC，96rpm振蕩培養18小時，得到搖瓶種子液；
(2)將搖瓶種子液以10%比例接入搖瓶發酵培養基中，在往復式搖床上，31°C，96rpm振蕩培養48小時即得；或將搖瓶種子液以10%比例接入5L罐發酵培養基中，控制發酵溫度30 32°C，pH7. O 7· 2，攪拌500 700rpm，通風2 3L/min，當殘糖彡2%時，流加55%葡萄糖溶液，發酵60小時即得。所述的應用，搖瓶種子培養基中含有葡萄糖30g/L，硫酸銨5g/L，玉米漿40mL/L，KH2PO4·3Η20 lg/L, MgSO4·7Η20 O. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L, MnSO4^H2O 0. Olg/L, Vh100 μ g/L，Vbi 200 μ g/L，尿素 2g/L，pH 為 7. 0 7. 2。

所述的應用，搖瓶發酵培養基中含有葡萄糖135g/L，硫酸銨35g/L，玉米漿25mL/L，KH2PO4·3Η20 lg/L, MgSO4·7Η20 O. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L, MnSO4^H2O 0. Olg/L, Vh100 μ g/L, Vbi 200 μ g/L, CaCO3 40g/L, pH 為 7. 0 7. 2。所述的應用，5L罐發酵培養基中含有葡萄糖120g/L，硫酸銨20g/L，玉米漿25mL/L，KH2PO4.3H20 lg/L, MgSO4·7Η20 O. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L, MnS04*H20 0. Olg/L, Vh100 μ g/L, Vbi 200 μ g/L,泡敵 0. 05g/L。本發明的有益效果從谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) CGMCC1.495 (LeiT)出發，經DES—步誘變篩選得到L-亮氨酸缺陷回復及0-氨基-0-羥基戊酸抗性突變株SL-0193 (Leu+AHVr),有效解除了目的產物L-亮氨酸對L-亮氨酸生物合成酶系的反饋調節，從而大幅度提高了 L-亮氨酸的生產能力。從L-亮氨酸缺陷型(Leu_)的回復突變株(Leu+)中選育L-亮氨酸生產菌至今尚未見報道。生物材料樣品保藏信息
谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變株SL-0193,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 7033,保藏日期為2012年12月 24日。
具體實施例方式實施例1 :谷氨酸棒桿菌突變株SL-0193 (Leu+ AHVr)的獲得
以谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) CGMCC1. 495 (LeiT)為出發菌株，經硫酸二乙酯(DES)—步誘變處理，定向篩選出一株L-亮氨酸缺陷回復及^-氨基-@-羥基戊酸抗性突變株SL-0193 (Leu+AHVr)0誘變處理和定向篩選培養基組成如下完全培養基(CM):葡萄糖5g,牛肉膏IOg,蛋白胨IOg,酵母膏5g,氯化鈉5g,瓊脂20g,用純水定容至1L，pH7. O 7. 2。基本培養基(MM):葡萄糖20g，硫酸銨 L 5g，尿素 L 5g，ΚΗ2Ρ04·3Η20 IgjK2HPO4 3g，MgSO4*7H20 0. lg，FeSO4*7H20 0. Olg, MnS04.H20 0. Olg, Vh 20 μ g，Vbi 100 μ g，瓊脂 20g，用純水定容至1L，pH7. 0 7. 2。篩選培養基(SM):在基本培養基(麗)中加入3mg/mLa-氨基-β-羥基戊酸(AHV)。搖瓶發酵培養基葡萄糖135g/L，硫酸銨35g/L，玉米漿25mL/L，KH2PO4-3H20 lg/L, MgSO4·7Η20 O. 5g/L, FeSO4·7Η20 0. Olg/L, MnS04.H20 0. Olg/L, Vh 100 μ g/L, Vbi 200 μ g/L, CaCO3 40g/L, pH7. 0 7. 2。具體選育過程如下
(I)誘變初篩
在出發菌株菌懸液中加入O. 5%硫酸二乙酯(DES)，31°C振蕩處理30min，中止處理后涂布于篩選培養基SM平板上，31°C靜止培養4 6天，挑選在SM上生長的突變株單菌落轉接至CM平板上，31 °C靜止培養24小時后進入搖瓶復篩。(2)搖瓶復篩
在CM平板上生長的突變株菌苔接一環于搖瓶發酵培養基中，31 °C，96rpm振蕩培養48小時，然后用常規紙層析法檢測突變株發酵液中積累的L-亮氨酸。在所有突變株中 ，產L-亮氨酸最高的菌株為SL_0193，48小時搖瓶產酸達到32. Og/L。實施例2 :谷氨酸棒桿菌突變株SL-0193在發酵法生產L-亮氨酸中的應用 發酵法生產L-亮氨酸的培養基組成為
搖瓶種子培養基葡萄糖30g/L,硫酸銨5g/L，玉米漿40mL/L, KH2PO4-3H20 lg/L,MgSO4*7H20 0. 5g/L, FeS04*7H20 0. Olg/L, MnS04*H20 0. Olg/L, Vh 100 μ g/L，Vbi 200 μ g/L,尿素 2g/L，pH7.0 7.2。5L罐發酵培養基葡萄糖120g/L，硫酸銨20g/L，玉米漿25mL/L，KH2PO4·3Η20 lg/L, MgSO4·7Η20 O. 5g/L, FeSO4·7Η20 O. 01g/L, MnS04.H20 0. Olg/L, Vh 100 μ g/L, Vbi 200 μ g/L，泡敵 0. 05g/L, pH7. 0 7. 2。將谷氨酸棒桿菌突變株SL-0193的CM斜面菌苔接一環于搖瓶種子培養基中，31 °C，96rpm振蕩培養18小時后，得到搖瓶種子液，以10%比例接入5L罐發酵培養基中通風培養，控制發酵溫度30 32°C，pH7. O 7. 2 (流加氨水控制)，轉速500 700rpm，通風量2 3L/min，待殘糖下降至2%以下時，流加55%葡萄糖液，發酵時間為60小時，產L-亮氨酸 41.3g/L。所使用的搖瓶種子培養基、搖瓶發酵培養基、5L罐發酵培養基并不僅僅限于上述實施例中所提到的，只要是能夠達到培養的目的，本領域普通技術人員根據菌種培養常識所能夠進行的培養基成分的變換，都是可以用于上述實施例中的，都是在本發明所要保護的范圍之內。
權利要求
1.一種谷氨酸棒桿菌突變株SL-0193,其特征在于 其遺傳標記為L-亮氨酸缺陷回復及a-氨基-￠-羥基戊酸抗性(Leu+ AHVr),保藏編號為 CGMCC No. 7033。
2.根據權利要求1所述的谷氨酸棒桿菌突變株SL-0193在發酵法生產L-亮氨酸中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述應用包括以下步驟 (1)將谷氨酸棒桿菌突變株SL-0193接種于搖瓶種子培養基中，在往復式搖床上，3rC，96rpm振蕩培養18小時，得到搖瓶種子液； (2)將搖瓶種子液以10%比例接入搖瓶發酵培養基中，在往復式搖床上，31°C，96rpm振蕩培養48小時即得；或將搖瓶種子液以10%比例接入5L罐發酵培養基中，控制發酵溫度30 32°C，pH7. 0 7. 2，攪拌500 700rpm，通風2 3L/min，當殘糖彡2%時，流加55%葡萄糖溶液，發酵60小時即得。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征是搖瓶種子培養基中含有葡萄糖30g/L，硫酸銨 5g/L，玉米漿 40mL/L，KH2P04*3H20 lg/L, MgSO4*7H20 0. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L,MnS04.H20 0. Olg/L, Vh 100 u g/L, Vbi 200ii g/L，尿素 2g/L，pH 為 7. 0 7. 2。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征是搖瓶發酵培養基中含有葡萄糖135g/L，硫酸銨 35g/L，玉米漿 25mL/L，KH2P04*3H20 lg/L, MgSO4*7H20 0. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L,MnS04.H20 0. Olg/L, Vh 100 u g/L, Vbi 200 u g/L, CaCO3 40g/L, pH 為 7. 0 7. 2。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征是5L罐發酵培養基中含有葡萄糖120g/L，硫酸銨 20g/L，玉米漿 25mL/L，KH2P04*3H20 lg/L, MgSO4*7H20 0. 5g/L，FeS04.7H20 0. Olg/L,MnS04.H20 0. Olg/L, Vh 100 u g/L, Vbi 200 u g/L,泡敵 0. 05g/L。
全文摘要
本發明涉及生物工程技術領域，特別涉及一種谷氨酸棒桿菌突變株及其在發酵法生產L-亮氨酸中的應用。所述的谷氨酸棒桿菌突變株是從谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC1.495(Leu-)出發，經DES一步誘變篩選得到的L--亮氨酸缺陷回復及α-氨基-β-羥基戊酸抗性突變株SL-0193(Leu+AHVr)，保藏編號為CGMCCNo.7033，有效解除了目的產物L-亮氨酸對L-亮氨酸生物合成酶系的反饋調節，具有很高的L-亮氨酸生產能力，在適宜的培養條件下，搖瓶發酵48小時產L-亮氨酸32.0g/L，5L自控發酵罐發酵60小時產L-亮氨酸41.3g/L。
文檔編號C12R1/15GK103031265SQ20131001046
公開日2013年4月10日 申請日期2013年1月11日 優先權日2013年1月11日
發明者張炳榮, 周群 申請人:新泰市佳禾生物科技有限公司