專利名稱：一個基于隨機單接頭擴增dna文庫的方法
技術領域：
本發明涉及一種DNA文庫的擴增方法，具體的說，涉及一種只利用單一的接頭擴增DNA文庫方法，從而減少接頭合成的費用，以及減少擴增的非特異性。
背景技術：
隨著第二代測序技術的發展及應用，人們能很方便的測出樣品DNA序列，從而確定樣品。但是目前第二代測序對于原始樣品濃度有著比較高的要求，如深圳華大基因公司在進行基因組目標區域測序時，要求樣品總量大于6 μ g DNA,濃度大于50ng/ μ L，對于一些微量樣品，就比較難達到測序的要求。其中一個解決辦法是對樣品加上通用接頭進行擴增，然后再送去測序。
目前市場上已經有比較成熟的接頭試劑盒，如illumina公司就制造了為其公司測序儀測序的接頭，目前市場上的接頭試劑盒價格較昂貴，切有一定偏向性，比如illumina 公司的接頭適合擴增300-500bp的DNA片段，且大部分接頭序列在3’末端沒有酶切位點， 擴增后的產物比較難去除干凈接頭序列。發明內容
本發明要解決的技術問題是針對市場接頭昂貴、擴增后不易去除接頭序列等問題，提供一種新型的接頭。
本發明的技術解決方案首先隨機生成25_30bpDNA序列最為接頭，然后在該接頭 3’末端加上平末端的酶切位點，根據隨機接頭設計引物。具體地說，包括如下步驟
1.隨機序列的生成可以用通過寫程序也可以在相關網站上隨機生成接頭序列的一條序列，另一條是其反向互補序列，例如http://bioinformatics· org/sms/index. htm0
2.平末端酶切序列的選擇可以自由的選擇平末端的限制性酶切酶如MlyI酶切位點見圖1，這個酶不僅可以切除接頭還能把酶切序列完全切 除干凈。
3.接頭序列的引物的設計可以直接利用接頭的前15_20bpDNA序列作為引物。
4.接頭及引物的合成隨機序列加上酶切序列便成了接頭，要注意接頭必須有一條鏈3’突出T，送出引物合成公司合成即可。
5. DNA末端處理引物接頭是T突出，所以用先用Klenow Fragment (3' —5' exo_)處理DNA使用末端突出A。
6. DNA樣品純化純化上一步DNA樣品
7.接頭退火把根據兩條合成好的接頭單鏈的退火溫度(TM)，設置退火程序，使其退火雜交成雙鏈接頭。
8.加接頭把已經純化好的DNA樣品連接制備好的雙鏈接頭。
8. DNA樣品純化純化上一步的DNA樣品。
9. PCR:用接頭引物擴增DNA樣品。
10. PCR產物純化純化擴增產物。
11 :切除接頭用相應的限制性內切酶切除接頭。
12 =DNA樣品純化純化上一步產物。
本方法具有如下的優點和效果
1.本方法可以對微量DNA樣品進行擴增，與市場上的接頭試劑盒相比，容易生產， 造價便宜，無DNA長度偏向性。
2.本方法，具有操作簡便、試劑有效期長、成本低廉、反應靈敏等優點。
3.本方法可以比較完全去除接頭序列和酶切序列。


圖1為MlyI酶切序列圖。
圖2為隨機單接頭圖。
圖3為接頭和樣品DNA連接圖，圖左邊和右邊是全式金公司IOObp DNALadder, 分子量依次是 IOObp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、IOOObp、 1500bp，中間是連接產物。
圖4為擴增樣品DNA圖，圖左邊和右邊是全式金公司IOObp DNA Ladder，中間是擴增產物。
圖5為超聲打斷Hela S3基因組圖，圖左邊是全式金公司IOObp DNA Ladder，右邊是金公司 IKbp DNALadder,分子量依次是 Ikbp、2kbp、3kbp、4kbp、5kbp、6kbp、8kbp、IOkbp。
圖6為200-600bp文庫擴增圖，圖左邊和右邊是全式金公司IOObp DNALadder，中間是擴增產物。
具體實施方式
實施實例I
用隨機單接頭擴增DNA文庫的過程
1.接頭的序列設計及合成根據需要設計了如圖2接頭。
2.接頭退火取10 μ L，100 μ M/L接頭單鏈加入的80 μ L，ddH20中，按表I的程序雜交。
表1:接頭退火雜交程序
權利要求
1.一個基于隨機單接頭擴增DNA文庫的方法，其特征在于用一個隨機生成的序列加上一個酶切序列構成一個雙鏈單接頭，把雙鏈單接頭加到文庫DNA兩端，用接頭引物就能擴增文庫DNA。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于用接頭引物擴增兩端加上接頭的文庫DNA。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)隨機單接頭的設計與合成；(2)文庫DNA與隨機單接頭相連；(3)擴增文庫DNA，并切除接頭。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于步驟(I)隨機單接頭的設計與合成 用程序或軟件生成隨機序列，根據需要在3’末端加入酶切位點，并使雙鏈接頭3’ T突出，送引物合成公司合成。根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于步驟(2)文庫DNA與隨機單接頭相連 用 Klenow Fragment (3' —> 5' exo_)處理文庫 DNA,用 T4DNA Ligase 連接文庫 DNA 與隨機單接頭。
5.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于步驟(3)擴增文庫DNA:用隨機單接頭引物用PCR擴增DNA文庫，并用相應的限制性內切酶切除接頭。
全文摘要
一個基于隨機單接頭擴增DNA文庫的方法，是將一個隨機生成的序列加上一個酶切序列并末端突出T的雙鏈接頭加到文庫DNA兩頭，并用接頭引物對連接產物擴增，從而達到擴增DNA文庫的目的。由于接頭制備簡單快速，價格便宜，對于快速擴增微量DNA文庫提供了一種簡單低價的方法。
文檔編號C12Q1/68GK103060310SQ201310013630
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者張玉祥, 鄒斌斌 申請人:首都醫科大學