專利名稱：定點重組的組合物和方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領域，具體涉及可用于在人基因組中特定的位點進行基因重組的組合物和方法，以及由此產(chǎn)生的基因修飾的細胞。
背景技術(shù)：
基因打靶是根據(jù)同源重組的原理而設計的一項技術(shù)。在這一技術(shù)中，體內(nèi)細胞基因組的某一段DNA序列被視為“靶子”，經(jīng)精巧構(gòu)建的欲導入的外源基因DNA序列被視為“彈頭”，這樣導入的外源基因進入受體細胞后就不再是隨機重組，而是“彈頭”錨準“靶子”進行準確的定點重組。外源基因?qū)肭氨仨毥?jīng)過精巧的構(gòu)建，經(jīng)構(gòu)建的外源基因稱為打靶載體(targeting vector)。基因打祀的結(jié)果有如下可能:(I)祀基因被滅活，即基因敲除，當打革El載體中插入一個特定的DNA序列就可以實現(xiàn)基因敲除(gene knockout)。(2)祀基因被導入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突變的基因。(3)在受體細胞基因組中定點引入一個原本不存在的完全新的基因,稱之為基因敲入(gene knockin)。歷經(jīng)30多年的發(fā)展，研究者們通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導、轉(zhuǎn)座子介導、乙烷亞硝基誘變、限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂等方法結(jié)合位點特異性重組酶進行了大量的基因打靶實踐，已經(jīng)在酵母、果蠅、植物、小鼠、人類干細胞的基因修飾、基因刪除、基因替換等方面取得了顯著的成果。繼2006年諾貝爾醫(yī)學獎授予讓致病基因沉默的RNA干擾技術(shù)之后，2007年諾貝爾醫(yī)學獎又頒 發(fā)給了基因敲除技術(shù)。兩者都屬于生物學中極為重要的重組DNA技術(shù)領域。然而,傳統(tǒng)的基因重組技術(shù),如Cre-1oxP和FLP-FRT基因重組系統(tǒng)等，由于①細胞內(nèi)的同源重組頻率低下( 10_6)，遠低于非同源末端連接(二者比例為1: 10 000 1:1000);②外源DNA進入細胞后，絕大多數(shù)會借助非同源末端連接途徑隨機插入基因組，容易造成功能基因斷裂、原癌基因激活、染色體缺失、重排，最終外源基因沉默或者細胞癌變；③加之細胞的DNA轉(zhuǎn)化率低(通常1% -5% )，需要大量的處理細胞，以至于在后期的篩選工作中需要耗費大量的人力、物力和時間。這些問題成為當前限制其發(fā)展和推廣應用的瓶頸。為了解決這些問題，研究者們需要在提高同源重組效率和建立高效的后期篩選方法兩個方面進行大量的探索。鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)技術(shù)的出現(xiàn)促使基因組靶向修飾技術(shù)向前邁進了一大步，主要體現(xiàn)在整合效率由傳統(tǒng)技術(shù)的0.0001%提高到1% -20%。Sigma公司基于此項技術(shù)，開發(fā)了使用重組腺相關病毒(rAAV)載體可將外源基因定點引入人19ql3.4 AAVSl位點和鼠Rosa26位點的試劑盒。AAV載體雖然已被證明是唯一具有定點整合特性的載體，然而，其包裝能力限制了打靶載體的長度，外源DNA長度為4.1-4.9kb時其包裝效率最高。且對于許多研究者而言，設計出特異性靶向基因組目的序列的鋅指核酸酶仍然是一個相當大的技術(shù)挑戰(zhàn)，4-6個月的實驗周期將耗費大量的人力和財力。事實上，由于病毒載體發(fā)生的隨機整合激活了 LM02表達，致使接受2年基因治療的SCID-XI患者又換上了白血病，已引發(fā)了對基因治療可行性的爭議和安全性的重視。現(xiàn)已證實，重組腺相關病毒載體一旦去除R印基因，即會失去定點整合能力，其隨機整合便會造成染色體缺失、重排和功能基因被打斷等后果。近年，來自Sangamo BioSciences公司和哈佛大學兩個研究小組的兩篇研究論文發(fā)表在同一期的《自然生物技術(shù)》(Nature Biotechnology)雜志上,分別介紹了一種類似的基因組祀向修飾技術(shù)-TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases)技術(shù)，即植物病原體中的一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應因子(transcription activator-like effector, TALE)表現(xiàn)出了 DNA結(jié)合特異性，不同于每個鋅指蛋白識別特異性的三聯(lián)體堿基，TALEs上的每個重復可變的d1-residues (RVDs)位點僅能識別一個堿基。將TALE的DNA結(jié)合功能域與野生型FokI限制酶引發(fā)DNA雙鏈斷裂的功能域連接形成重組蛋白，就形成了一種基于引發(fā)同源重組的基因組靶向修飾技術(shù)。可是，合成出如此多重復序列的TALEs是很困難的，而且其脫靶活性以及基本生物特性包括結(jié)構(gòu)和親和力等尚待研究。迄今為止，全世界科學家利用基因打靶技術(shù)已經(jīng)對上萬種基因的功能進行了研究，由此催生出新的藥物(如癌基因靶向治療藥物)以及新的疾病治療方法(如血友病基因治療方法)等，并培育了上千種存在不同基因變異的人類疾病動物模型和細胞株模型。但是，基因打靶技術(shù)仍然存在諸多不足之處:①由于外源基因整合位點常常不在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域，很多基因打靶的敲入基因表達量低且不穩(wěn)定；②通常基因打靶敲入需要置換體內(nèi)一些原有的基因，這極有可能影響細胞基因組的穩(wěn)定性，改變鄰近基因的功能，內(nèi)環(huán)境平衡被打破，細胞的生物學特性也將發(fā)生改變，基因工程下游的生產(chǎn)工藝優(yōu)化困難重重；③基因打靶的基因敲入技術(shù)利用的同源重組靶位點通常為單拷貝序列，與載體發(fā)生同源重組的概率極低，即定點整合效率太低。目前，安全、高效、穩(wěn)定的基因打靶優(yōu)選靶位點少見報道，且現(xiàn)有的基因重組技術(shù)也有諸多不足之處有待改進。

發(fā)明內(nèi)容
本申請?zhí)峁┝四軌蛟诎泻塑账嵝蛄兄卸c重組外源序列的組合物和方法。在一方面，本申請?zhí)峁┝朔蛛x的多核苷酸，其含有高表達位點的至少7個連續(xù)核苷酸，其中所述高表達位點存在于人的染色體或基因組中。在某些實施方式中，所述高表達位點選自下組:HumanGenome.1TSl 到 HumanGenome.1TS155。在另一方面，本申請?zhí)峁┝说途刍衔铮锌商禺愋噪s交于靶位點的靶區(qū)域，所述靶位點含有高表達位點的至少7個連續(xù)核苷酸，其中所述高表達位點存在于人的染色體或基因組中。在某些實施方式中，所述靶區(qū)域含有低聚的核苷酸。所述靶區(qū)域可以含有至少一個修飾的核苷酸。至少一個所述修飾的核苷酸可以是鎖核酸。在某些實施方式中，所述靶區(qū)域是5’ 一 3’走向的，且所述靶位點是3’ 一 5’走向的，或者所述靶區(qū)域是3’ 一 5’走向的，且所述靶位點是5’ 一 3’走向的。在某些實施方式中，所述靶區(qū)域與所述靶位點有50%到100%的互補性。在某些實施方式中，低聚化合物進一步含有能夠與第二低聚化合物形成結(jié)合的結(jié)合區(qū)域。所述結(jié)合可以是堿基配對、共價鍵、非共價鍵、共價接頭、或非共價接頭。所述結(jié)合區(qū)域可以連接在所述靶區(qū)域的5’上游，或連接在所述靶區(qū)域的3’下游。在某些實施方式中，所述結(jié)合區(qū)域可以含有核苷酸，在某些實施方式中也可以含有至少一個修飾的核苷酸，在某些實施方式中至少一個所述修飾的核苷酸是鎖核酸。在另一方面，本申請?zhí)峁┝说途蹣?gòu)建體，其含有:第一低聚化合物，其含有與第一結(jié)合區(qū)域連接的第一 5’一 3’靶區(qū) 域；第二低聚化合物，其含有與第二結(jié)合區(qū)域連接的第二3’一 5’靶區(qū)域；以及在第一結(jié)合區(qū)域和第二結(jié)合區(qū)域之間的結(jié)合；其中:所述第一 5’一 3’靶區(qū)域與第一 3’ 一 5’靶位點可特異性雜交；所述第二 3’ 一 5’靶區(qū)域與第二 5’ 一 3’靶位點可特異性雜交；且所述第一 3’ 一 5’靶位點和所述第二 5’ 一 3’靶位點各含有高表達位點的至少7個連續(xù)核苷酸，其中所述高表達位點存在于人的染色體或基因組中。在某些實施方式中，所述第二 5’ 一 3’靶位點位于所述第一 3’ 一 5’靶位點在所述高表達位點上的互補序列的5’上游或3’下游。在另一方面，本申請?zhí)峁┝硕嗪塑账峁w，其含有第一 5’ 一3’同源位點，其含有高表達位點的5’ 一 3’鏈的至少7個連續(xù)核苷酸的同源序列，其中所述高表達位點存在于宿主細胞的染色體或基因組中，并且允許位于所述高表達位點中的基因高度表達。本申請還提供了多核苷酸供體，其含有第一 3’ 一 5’同源位點，其含有高表達位點的3’ 一 5’鏈的至少7個連續(xù)核苷酸的同源序列，其中所述高表達位點存在于宿主細胞的染色體或基因組中，并且允許位于所述高表達位點中的基因高度表達。在某些實施方式中，所述供體進一步含有第二 5’ 一 3’同源位點，其含有所述高表達位點的5’ 一 3’鏈的至少7個連續(xù)核苷酸的同源序列。在某些實施方式中，所述 第一 3’ —5’同源位點位于所述第二 5’ 一3’同源位點在所述供體上的互補序列的5’上游或3’下游。在某些實施方式中，所述供體進一步含有外源序列，所述外源序列兩端側(cè)接有所述第一 3’ 一5’同源位點和所述第二 5’ 一3’同源位點。在某些實施方式中，所述外源序列含有外源基因、外源調(diào)控序列、和外源限制性克隆位點中的一個或多個。在某些實施方式中，所述外源序列進一步含有選擇性標記。在另一方面，本申請?zhí)峁┝嗽谌旧w或基因組上含有高表達位點的宿主細胞，其進一步含有本申請?zhí)峁┑牡途蹣?gòu)建體。在某些實施方式中，所述宿主細胞進一步含有本申請?zhí)峁┑亩嗪塑账峁w。在某些實施方式中，所述供體進一步含有外源序列，所述外源序列的兩端側(cè)接有所述第一 3’ 一 5’同源位點和所述第二 5’ 一 3’同源位點。所述外源序列可以含有一個或多個基因。在某些實施方式中，所述宿主細胞進一步含有能夠促進外源序列與高表達位點重組的重組促進劑。所述重組促進劑可以是重組酶、重組酶的編碼序列或化合物。在另一方面，本申請?zhí)峁┝巳怂拗骷毎湓谌旧w或基因組上含有第一高表達位點，其中所述第一高表達位點處整合了第一外源序列。在某些實施方式中，所述第一外源序列含有一個或多個功能性基因。在某些實施方式中，宿主細胞的染色體上進一步含有第二高表達位點，其中所述第二高表達位點處整合了第二外源序列。在某些實施方式中，所述第二外源序列含有一個或多個功能性基因。所述第一外源序列中的功能性基因和所述第二外源序列中的功能性基因相同或不同。在某些實施方式中，所述第一和/或所述第二外源序列中至少有一個外源基因能夠在所述宿主細胞中穩(wěn)定表達，或穩(wěn)定高表達。在某些實施方式中，所述宿主細胞傳代30代以后，所述第一和/或第二外源序列中至少有一個外源基因的表達與未整合所述外源序列的對照細胞相比至少高10 %、高15 %、高20 %、高30 %、高40%、高50%、高60%、高70%或者更高。所述宿主細胞可以是穩(wěn)定的細胞系。如果對照細胞中不表達外源基因或者檢測不到外源基因的表達，則所述“至少高10%”是指在本發(fā)明的整合了外源基因的宿主細胞中能夠檢測到外源基因的表達。在另一方面，本申請?zhí)峁┝嗽噭┖校浜斜旧暾執(zhí)峁┑膬蓚€低聚化合物，其能夠形成如本申請所提供的低聚構(gòu)建體；以及本申請所提供的多核苷酸供體，其中所述低聚構(gòu)建體可與所述供體的所述第一同源位點和所述第二同源位點特異性雜交。在另一方面，本申請?zhí)峁┝嗽噭┖校浜斜旧暾執(zhí)峁┑牡途蹣?gòu)建體；以及本申請所提供的多核苷酸供體，其中所述低聚構(gòu)建體可與所述供體的所述第一同源位點和所述第二同源位點特異性雜交。在另一方面，本申請?zhí)峁┝嗽谒拗骷毎幕蚪M中引入外源序列的方法，所述宿主細胞的染色體或基因組中含有高表達位點，所述方法包括:向所述宿主細胞中引入本申請的低聚構(gòu)建體，本申請?zhí)峁┑亩嗪塑账峁w，其中所述低聚構(gòu)建體與所述供體的所述第
一3’ 一 5’同源位點和所述第二 5’ 一 3’同源位點特異性雜交，以及培養(yǎng)所述宿主細胞以允許所述外源序列重組到所述宿主細胞的所述高表達位點中。所述方法可以進一步包括向所述宿主細胞中弓I入重組促進劑。在另一方面，本申請?zhí)峁┝嗽谒拗骷毎幕蚪M中表達外源基因的方法，所述宿主細胞的染色體或基因組中含有高表達位點，所述方法包括:向所述宿主細胞中引入本申請?zhí)峁┑牡途蹣?gòu)建體，本申請?zhí)峁┑亩嗪塑账峁w，其中所述低聚構(gòu)建體與所述供體的所述第一 5’ 一 3’同源位點和所述第二 3’ 一 5’同源位點特異性雜交，其中所述多核苷酸供體含有的所述外源序列是 外源基因，以及培養(yǎng)所述宿主細胞以允許所述外源基因重組到所述宿主細胞的所述高表達位點中。


圖1顯示低聚構(gòu)建體的示意圖。(a)中的低聚構(gòu)建體中，兩個低聚化合物中的靶區(qū)域位于結(jié)合區(qū)域的3’下游，當結(jié)合區(qū)域形成結(jié)合后，兩個靶區(qū)域分別位于各自低聚化合物的3’端；(b)中的低聚構(gòu)建體中，兩個低聚化合物中的靶區(qū)域位于結(jié)合區(qū)域的5’上游，當結(jié)合區(qū)域形成結(jié)合后，兩個靶區(qū)域分別位于各自低聚化合物的5’端。圖2為定點重組方法的原理圖。簡單地說，本申請的一對低聚化合物可以形成低聚構(gòu)建體，低聚構(gòu)建體中的靶區(qū)域可以與靶核苷酸序列中的靶位點特異性雜交，也可以與多核苷酸供體中的同源位點特異性雜交。這樣的特異性雜交使得多核苷酸供體的同源位點附近產(chǎn)生了單鏈結(jié)構(gòu)，靶核苷酸的靶位點附近也產(chǎn)生了單鏈結(jié)構(gòu)。在這些單鏈結(jié)構(gòu)之間可以進行重組，使得多核苷酸供體的同源位點附近的序列能夠重組到靶核苷酸的靶位點附近。可選地，可以使用重組促進劑來提高重組效率。圖3是PCR分析的電泳結(jié)果，其中的圖片通過軟件處理反色顯示。圖中M是DNAIOObpladder marker ’第1_5泳道是高表達位點iTS45_l的擴增片段，第6泳道是外源基因GPR4的擴增片段。圖4為對照和重組HEK293細胞的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果，其中的圖片通過軟件處理反色顯示。M是DNA IOObp ladder marker,第I泳道代表在對照組HEK293細胞中，GPR4基因的RT-PCR結(jié)果；第2_4泳道是在HEK293宿主細胞(第I代)的iTS45_l位點處進行GPR4基因重組后，GPR4基因的RT-PCR結(jié)果。圖5為PCR分析的電泳結(jié)果，其中的圖片通過軟件處理反色顯示，“Marker”表示分子標記，“iTS45-2”和“iTS117”分別表示iTS45_2和iTS117擴增片段。圖6為PCR分析的電泳結(jié)果，其中的圖片通過軟件處理反色顯示，“Marker”表示分子標記，“itS118”表示iTS118擴增片段。圖7是PCR分析的電泳結(jié)果，其中的圖片通過軟件處理反色顯示，“Marker”表示分子標記，“S0X2”表示外源基因S0X2的擴增片段，約為lOOObp。圖8為檢測GPR4基因整合在HEK293宿主細胞中(第30代)iTS45_l位點處表達水平的Elisa結(jié)果圖。在挑選出的細胞克隆中檢測到GPR4蛋白的表達，特別是在第4、8、
12、16、33和35個細胞克隆中，檢測到顯著高水平的GPR4蛋白表達。圖9為Western Blot圖，檢測了在第I代細胞克隆中，整合在HEK293宿主細胞中1TS45-1和iTS45-2位點處的S0X2基因的表達水平。圖10為Western Blot圖，檢測了在第I代細胞克隆中，整合在HEK293宿主細胞中iTS-117和iTSl 18位點處的S0X2基因的表達水平。圖11為Western Blot圖，檢測了在第10代細胞克隆中，整合在HEK293宿主細胞中iTS45-l、iTS45-2、iTS117和iTS118位點處的S0X2基因的表達水平。圖12為Western Blot圖，檢測了在第20代細胞克隆中，整合在HEK293宿主細胞中iTS45-l、iTS45-2位點、iTSl 17和iTSl 18處的S0X2基因的表達水平。圖13為pROSE質(zhì)粒的D NA序列。
具體實施例方式定點重組在一方面，本申請?zhí)峁┑慕M合物和方法可用于定點重組外源序列，例如，在靶核苷酸序列中定點重組外源序列。“定點重組”，在本申請中是指，將外源序列通過非隨機的方式整合到靶核苷酸序列的特定的靶位點處。例如，可以整合到某特定靶位點的5’上游、3’下游、或兩個特定靶位點之間。“外源序列”在本申請中是指，期望被定點重組到靶位點處的核苷酸序列。外源序列可以是靶核苷酸序列中不存在的序列，或者可以是存在于靶核苷酸序列中、但是不存在于靶位點處的序列。“靶核苷酸序列”在本申請中是指，含有靶位點的任何多核苷酸序列，其能夠容納外源序列在靶位點處的整合。在某些實施方式中，靶核苷酸序列是雙鏈的DNA序列。示例的靶核苷酸序列包括，但不限于，細胞的基因組中的多核苷酸序列、細胞基因組外的多核苷酸序列(例如線粒體基因組)、質(zhì)粒、和雙鏈的多核苷酸。優(yōu)選地，靶核苷酸序列是染色體或基因組本身，或其中的序列，更優(yōu)選地，是人類染色體或基因組中的序列。在某些實施方式中，靶核苷酸序列是人類染色體或基因組本身，或其中的序列。“靶位點”在本申請中是指，在靶核苷酸中任何一段感興趣的核苷酸序列。靶位點的選擇可以不受任何限制，在靶核苷酸中任何感興趣的核苷酸序列都可以作為靶位點。在某些實施方式中，靶位點可以存在于人類的基因組或染色體的高表達位點中，或該高表達位點中的某個區(qū)段或片段。不受理論的限制，認為通過堿基互補原則，可以設計出與靶位點具有足夠互補度的本申請的組合物(如低聚化合物或低聚構(gòu)建體)，使其能夠通過堿基互補的方式識別靶核苷酸序列上的靶位點。同時，也可以根據(jù)靶位點的堿基序列，設計出與靶位點具有足夠同源度的同源序列，使得本申請的組合物也能夠通過堿基互補的方式識別同源序列。這樣，一方面，本申請的組合物結(jié)合靶位點序列，另一方面，本申請的組合物也結(jié)合同源序列，由此促使同源序列與靶位點序列之間的同源重組(例如，見圖2)。當同源序列還連接有外源序列時，可以通過本申請的組合物，將該外源序列定點重組到所選擇的靶位點處。理論上，根據(jù)堿基互補的原則，可以對靶核苷酸序列中任何感興趣的靶位點設計出本申請的組合物，從而實現(xiàn)外源序列在這些靶位點處的定點重組。高表達位點在一方面，本申請?zhí)峁┑慕M合物和方法可用于在哺乳動物細胞，特別是人類細胞中定點重組外源序列。在某些實施方式中，可以在人類細胞的高表達位點中定點重組外源序列。“高表達位點”在本申請中是指，存在于宿主細胞的染色體或基因組中的一段多核苷酸區(qū)域，當某基因位于該區(qū)域時，其表達水平提高或表達效率提高。例如，當某基因位于高表達位點中時，其產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的量(如轉(zhuǎn)錄的RNA拷貝數(shù)，或表達的蛋白的量)高于當相同拷貝數(shù)的該基因位于染色體的非高表達位點時、或者隨機整合入染色體時產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的量，例如，至少高約I倍、高約2倍、高約5倍、高約10倍、高約20倍、高約30倍、高約40倍、高約50倍、高約60倍、高約70倍、高約80倍、高約90倍、高約100倍、高約200倍、高約300倍、高約400倍、高約500倍、或高約1000倍。在某些實施方式中，高表達位點可以是本領域公知的基因表達水平較高的任何區(qū)域(gegion of Increased Gene Expression, RIDGE)。本領域公知，在染色體或基因組中，位于某些區(qū)域中的基因能夠被高表達，這樣的區(qū)域被稱為RIDGE (見，例如，Caron等，Science, 291 (5507): 1289-1292 (2001))。可以通過本領域已知的方法識別出RIDGE，例如，通過將基因組中的表達序列標簽(Expression Sequence Tag7EST)與在組織或細胞中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物文庫(如，Serial Analysis of Gene Expression, SAGE文庫)進行比較,識別出高表達的EST并找到它們在基因組上聚集的區(qū)域，S卩RIDGE。再例如，Versteeg等總結(jié)了 RIDGE的特征，包括:基因以較高密度聚集、內(nèi)含子短、富含SINE重復序列，和/或LINE重復序列少等(見，例如，Versteeg et al,Genome Res.,13:1998-2004(2003))。本領域技術(shù)人員基于這些特征，也可以在染色體或基因組中進行篩選，從而找到對應的RIDGE。再例如，Zhou等列出了在染色體上，特別是在腫瘤細胞的染色體上高表達的區(qū)域(見下表1，摘自Zhou等,Cancer Research,63:5781_5784(2003))。本領域人員根據(jù)已知的染色體命名規(guī)則(例如，ISCN 2005:aninternational system for human cytogenetic nomenclature(2005):recommendations of theInternational Standing Committee on Human CytogeneticNomenclature, published by KargerPublishers, 2005),可以很容易地找到表 I 中所列出的這些染色體上的高表達位點。 表1、不例性的基因表達升聞的區(qū)域
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸，其含有高表達位點的至少7個連續(xù)核苷酸，其中所述高表達位點存在于人的染色體或基因組中。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述高表達位點選自下組:HumanGenome.1TSl 至Ij HumanGenome.1TS155。
3.低聚化合物，含有可特異性雜交于靶位點的靶區(qū)域，所述靶位點含有高表達位點的至少7個連續(xù)核苷酸，其中所述高表達位點存在于人的染色體或基因組中。
4.如權(quán)利要求3所述的低聚化合物，其中所述靶位點含有所述高表達位點的3’一 5’鏈的至少7個連續(xù)核苷酸,所述高表達位點選自下組:HumanGenome.1TSl到HumanGenome.1TS155。
5.如權(quán)利要求3所述的低聚化合物，其中所述靶位點含有所述高表達位點的5’一3’鏈的至少7個連續(xù)核苷酸,所述高表達位點選自下組:HumanGenome.1TSl到HumanGenome.1TS155。
6.如權(quán)利要求3-5任一所述的低聚化合物，進一步含有能夠與第二低聚化合物結(jié)合的結(jié)合區(qū)域，所述結(jié)合區(qū)域與靶區(qū)域連接。
7.如權(quán)利要求6所述的低聚化合物，其中所述第二低聚化合物含有第二靶區(qū)域和第二結(jié)合區(qū)域。
8.如權(quán)利要求7所述的低聚化合物，其中所述第二靶區(qū)域與第二靶位點特異性雜交，所述第二靶位點含有在人染色體或基因組中存在的高表達位點的至少7個連續(xù)核苷酸，其中所述第一靶位點和所述第二靶位 點在所述高表達位點的相反鏈上。
9.低聚構(gòu)建體，含有: 第一低聚化合物，其含有與第一結(jié)合區(qū)域連接的第一 5’ 一 3’靶區(qū)域； 第二低聚化合物，其含有與第二結(jié)合區(qū)域連接的第二 3’ 一5’靶區(qū)域；以及 在第一結(jié)合區(qū)域和第二結(jié)合區(qū)域之間的結(jié)合； 其中: 所述第一 5’ 一 3’靶區(qū)域與第一 3’ 一 5’靶位點可特異性雜交；所述第二 3’ 一 5’靶區(qū)域與第二 5’ 一 3’靶位點可特異性雜交；且 所述第一 3’ 一 5’靶位點和所述第二 5’ 一 3’靶位點各含有高表達位點的至少7個連續(xù)核苷酸，其中所述高表達位點存在于人的染色體或基因組中。
10.如權(quán)利要求9所述的低聚構(gòu)建體，其中所述第一5’一 3’靶區(qū)域與所述第一 3’一 5’靶位點有50%到100%互補性，和/或所述第二 3’ 一 5’靶區(qū)域與所述第二 5’ 一 3’靶位點有50 %到100 %互補性。
11.如權(quán)利要求9所述的低聚構(gòu)建體，其中所述第一3’一 5’靶位點含有所述高表達位點的3’ 一 5’鏈的至少7個連續(xù)核苷酸,所述高表達位點選自下組:HumanGenome.1TSl到HumanGenome.1TS155。
12.多核苷酸供體,含有第一5’ 一3’同源位點，所述同源位點含有高表達位點的5’一 3’鏈的至少7個連續(xù)核苷酸的同源序列，其中所述高表達位點存在于人的染色體或基因組中。
13.多核苷酸供體,含有第一3’ 一5’同源位點，所述同源位點含有高表達位點的3’一 5’鏈的至少7個連續(xù)核苷酸的同源序列，其中所述高表達位點存在于人的染色體或基因組中。
14.如權(quán)利要求13所述的供體，其中所述供體進一步含有第二5’一 3’同源位點，其含有所述高表達位點的5’ 一 3’鏈的至少7個連續(xù)核苷酸的同源序列。
15.如權(quán)利要求12-14任一所述的供體,其中所述高表達位點選自下組:HumanGenome.1TSl 至Ij HumanGenome.1TS155。
16.如權(quán)利要求14所述的供體，進一步含有外源序列，所述外源序列兩端側(cè)接有所述第一 3’ 一 5’同源位點和所述第二 5’ 一 3’同源位點。
17.試劑盒，含有: 如權(quán)利要求6所述的兩個低聚化合物，其能夠形成如權(quán)利要求9所述的低聚構(gòu)建體；以及 如權(quán)利要求14所述的多核苷酸供體， 其中所述低聚構(gòu)建體可與所述供體的所述第一同源位點和所述第二同源位點特異性雜交。
18.試劑盒，含有: 如權(quán)利要求9所述的低聚構(gòu)建體；以及 如權(quán)利要求14所述的多核苷酸供體， 其中所述低聚構(gòu)建體可與所述供體的所述第一同源位點和所述第二同源位點特異性雜父。
19.在染色體或基因組上含有高表達位點的宿主細胞，進一步含有如權(quán)利要求9所述的低聚構(gòu)建體。
20.如權(quán)利要求19所述的宿主細胞，進一步含有如權(quán)利要求14所述的多核苷酸供體。
21.如權(quán)利要求20所述的宿主細胞，其中所述供體進一步含有外源序列，所述外源序列的兩端側(cè)接有所述第一 3’ 一 5’同源位點和所述第二 5’ 一 3’同源位點。
22.如權(quán)利要求21所述的宿主細胞，進一步含有能夠促進外源序列與高表達位點重組的重組促進劑。
23.人宿主細胞，在染色體或基因組上含有第一高表達位點，其中在所述第一高表達位點處整合了第一外源序列。
24.在宿主細胞的基因組中引入外源序列的方法，所述宿主細胞的染色體或基因組中含有高表達位點，所述方法包括: 向所述宿主細胞中引入如權(quán)利要求9所述的低聚構(gòu)建體，如權(quán)利要求21所述的多核苷酸供體， 其中所述低聚構(gòu)建體與所述供體的所述第一 3’ 一 5’同源位點和所述第二 5’ 一 3’同源位點特異性雜交，以及 培養(yǎng)所述宿主細胞以允許所述外源序列重組到所述宿主細胞的所述高表達位點中。
25.在宿主細胞中表達外源基因的方法，所述宿主細胞的染色體或基因組中含有高表達位點，所述方法包括: 向所述宿主細胞中引入如權(quán)利要求9所述的低聚構(gòu)建體，如權(quán)利要求21所述的多核苷酸供體， 其中所述低聚構(gòu)建體與所述供體的所述第一 5’ 一 3’同源位點和所述第二 3’ 一 5’同源位點特異性雜交， 其中所述多核苷酸供體含有的所述外源序列是外源基因，以及 培養(yǎng)所述宿主細胞以允許所述外源基因重組到所述宿主細胞的所述高表達位點中。
全文摘要
本申請?zhí)峁┝四軌蛟诎泻塑账嵝蛄兄卸c重組外源序列的組合物和方法，特別地，在靶核苷酸序列的高表達位點中定點重組外源序列的組合物和方法。其中，所述靶核苷酸序列可以是人的基因組。本申請還提供了在染色體上含有高表達位點的宿主細胞。在所述宿主細胞中含有本申請?zhí)峁┑亩c重組的組合物，或者在其染色體的高表達位點中定點重組了外源序列。
文檔編號C12N5/10GK103215260SQ201310020358
公開日2013年7月24日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者凌建群, 鳳閣 申請人:江蘇吉銳生物技術(shù)有限公司