專利名稱：一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物技術領域，涉及一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌。
背景技術：
農作物秸桿廢棄物一直是我國長期存在的資源環境問題，東北地區的秸桿資源密度遠遠高于我國總秸桿資源密度值，傳統農業中，東北地區的秸桿主要用于燒火做飯取暖、秸桿養畜積肥，但隨著傳統農業向現代化農業的轉變、農村能源和飼料結構化的調整以及社會經濟的突飛發展，農業廢棄秸桿呈了污染空氣、水源和土壤板結的污染源，各國的研究學者為秸桿的利用開辟了新途徑和新方法，使傳統秸桿的利用途徑發生了歷史性的變化。目前剩余秸桿的處理方法主要包括化學法、物理法和生物法，相比較而言，微生物處理法具有化學法和物理法不可取代的優勢，其處理費用低、操作簡單、環境污染小，更容易被廣大農民接受。微生物能根據不同的底物污染物產生不同的酶，參與底物的降解反應，從而達到處理廢棄污染物的目的。

發明內容
本發明的目的是提供一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌(Pesudomonasmendocina)菌株。門多薩假單抱菌(Pesudomonas mendocina)菌株，保藏編號為CGMCC N0.6711 它的16SrDNA的基因序列，如序列表SEQ ID N0.1所不。本發明的另一個目的是提供一種生產纖維素酶的方法，將上述的門多薩假單孢菌(Pesudomonas mendoci na)菌株,在CMC+可溶性淀粉 0.3%、蛋白腺 + 酵母粉 l%、NaCl 0.5%、pH 7.4 7.8的培養基中，溫度30°C，培養，按常規方法提取纖維素酶。本發明借助生物技術的手段，從東北地區的樹林中雜草地土樣以及腐殖的樹葉、腐爛秸桿、放牛場中腐敗的牛糞、天然堆慪肥料采集樣品，經過菌種富集、分離純化得到了一株高效降解纖維素的細菌；經鑒定為門多薩假單孢菌；將門多薩假單孢菌接入含有200mgCMC的培養基中，在120rpm、30°C的條件下搖床培養7d，酶活性達97IU ;本發明門多薩假單孢菌產生的纖維素酶對纖維素具有很強的降解作用。與現有的纖維素降解菌株相比，門多薩假單孢菌是從東北地區的自然環境中篩選獲得的，屬于環境中的土著菌，對外界環境的耐受性更強，且不會污染環境。在農作物秸桿堆肥中具有較高的實用價值。


圖1為本發明門多薩假單孢菌的單菌落圖片；
圖2為門多薩假單孢菌的革蘭氏染色顯微鏡圖片；
圖3為通過門多薩假單孢菌和相近菌株16SrDNA的基因序列進行同源性Blast比對時構建的系統發育樹圖片。
具體實施例方式實施例1纖維素降解菌株篩選
(1)從東北地區的樹林中雜草地土樣以及腐殖的樹葉、腐爛秸桿、放牛場中腐敗的牛糞、天然堆慪肥料采集樣品；將新鮮樣品用生理鹽水富集；
(2)將富集后的混合菌液靜置0.5h，取上清作KT1-KT7的稀釋度，每個梯度在選擇性培養基(選擇性培養基為:羧甲基纖維素(CMOlOg/ L, ( NH4) 2S04 4g/ L, KH2PO4 2g/L, MgSO4.7H20 0.5 g/ L,蛋白胨 I g/ L,瓊脂 18 g/ L, pH 6.5 7.0 中涂布，30°C下恒溫培養72h，剛果紅染色篩選出透明圈較大的單一菌落，編號，再多次劃線培養，多次純化以得到純種菌株，將分離后的菌種接到斜面上，4°C保存進行后續實驗。獲得了多株纖維素降解菌，其中在放牛場的腐敗牛糞中采集的，編號為N”-1株，于2012年10月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.6711，保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101。對N”-l菌株進行革蘭氏染色和顯微鏡觀察。觀察菌株的菌落形態，菌落呈白色，表面呈現半濕潤狀態，菌落大而扁平、呈花形形狀、邊緣呈鋸齒狀，生長迅速，革蘭氏染色后用顯微鏡觀察發現，菌株為桿菌，呈陰性，見圖1、2。實施例2 N”-1菌株的生理生化鑒定
參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰細菌系統鑒定手冊》對門多薩假單孢菌N”-1株進行生理生化鑒定，其鑒定結果見表1，菌株的接觸酶、V-P、M.R、反硝化等反應呈陰性，能使淀粉水解、使明膠液化、精氨酸雙水解，能利用丙二酸、檸檬酸，屬于葡萄糖發酵型菌株、最聞耐鹽性為7%。

表I N’’-1的生理生化測定結果
權利要求
1.一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌菌株，它的保藏編號為CGMCC N0.6711。
2.權利要求1所述的一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌菌株，它的16SrDNA的基因序列，如序列表SEQ ID N0.1所示。
3.—種生產纖維素酶的方法，它包括:將權利要求1所述的一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌菌株，在CMC+可溶性淀粉0.3%、蛋白胨+酵母粉1%、NaCl 0.5%、pH 7.4 7.8的培養基中， 溫度30°C，培養，按常規方法提取纖維素酶。
全文摘要
本發明公開了一株高效降解纖維素的門多薩假單孢菌，是借助生物技術的手段，從東北地區的樹林中雜草地土樣以及腐殖的樹葉、腐爛秸稈、放牛場中腐敗的牛糞、天然堆漚肥料采集樣品，經過菌種富集、分離純化得到的；經鑒定為門多薩假單孢桿菌；將門多薩假單孢桿菌接入含有200mgCMC的培養基中，在120rpm、30℃的條件下搖床培養7d，酶活性達97IU；本發明門多薩假單孢桿菌產生的纖維素酶對纖維素具有很強的降解作用。與現有的纖維素降解菌株相比，門多薩假單孢桿菌是從東北地區的自然環境中篩選獲得的，屬于環境中的土著菌，對外界環境的耐受性更強，且不會污染環境。在農作物秸稈堆肥中具有較高的實用價值。
文檔編號C12R1/38GK103114057SQ20131002657
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月19日 優先權日2013年1月19日
發明者王丕武, 張建峰, 侯紅燕, 王剛, 龐思娜, 王靜, 付永平, 曲靜, 劉德生, 劉智穎 申請人:吉林農業大學