專利名稱：單抗介導的納米金斑點滲濾法檢測ibrv的試紙條的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，具體地說是一種抗牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體及單抗介導的納米金斑點滲濾法檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的試紙條。
背景技術：
牛傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR)是由牛皰疫病毒I型(BHV-1)引起的一種病毒性傳染病。BHV-1屬皰疹病毒科，目前已知的有3個亞型:BHV1型、BHV2a、BHV2b型，但大多數學者認為只有一個血清型。該病最初在歐洲發生，20世紀30年代隨著牛的輸出而傳到美國，Mille (1955)在美國首次報道了該病，Madin等(1956)分離到了該病病毒，1964年Hurk首先確認引起本病的病毒歸屬于皰疫病毒。目前該病廣泛分布于世界各地，對肥育率、產奶量和繁殖影響極大，是引起養牛業重大經濟損失的疾病之
O目前IBR診斷分為二大類，病原學檢測和血清學檢測。病原學診斷包括:
1、病原分離鑒定；主要是分離培養病毒，將細胞培養的上清液與IBRV陽性血清或單克隆抗體(McAb)進行中和試驗。也可采用免疫熒光或免疫過氧化物酶試驗測定IBRV抗原。2、直接免疫熒光試驗:將從鼻、眼或生殖道采集的棉拭子直接涂抹于蓋玻片上，或者離心取細胞沉淀滴在載玻片上，病理組織樣品可做冰凍切片，進行免疫熒光直接法檢測。該方法優點是較為快速，缺點是敏感性不高，非特異性反應相對較多。3.核酸檢測:a.聚合酶鏈式反應(PCR)，常用于PCR擴增的目的片段有TK、gB、gC和gD等基因；b.實時熒光PCR診斷，敏感性比常規PCR高IO3 IO4倍，適用于進出境牛傳染性鼻氣管炎感染的快速病原檢測。c.核酸探針雜交技術:Southern Blot雜交試驗是一種比較敏感的檢測IBRV DNA的方法，Pandita (1995)和Xia等(1995)報道了用斑點雜交法檢測IBRV。吳時友等(1998)報道的資料認為該方法的檢測敏感性達到了可檢出IOpg的IBRV DNA，具有相當高的靈敏度和特異性。據報道，用生物素制備的改良型探針，代替了32P,彌補放射性同位素探針半衰期短、對人體健康有害的弊端，可應用于檢測牛精液中IBRVDNA，也取得了很好的結果，探針可在_20°C保存一年以上，有利于推廣使用。血清學診斷:
IBRV感染后常呈隱性感染，鑒定動物的感染狀態采用血清學檢查是非常實用且十分有價值的方法。抗體陽性動物除體內保有從初乳中獲得母源抗體的犢牛和滅活疫苗免疫的牛之外均可認為是病毒攜帶者和潛在的間歇性排毒者，是重要的傳染源。1.病毒中和試驗(國際貿易指定實驗):病毒中和試驗被OIE指定為國際貿易試驗方法之一，該方法是測定免疫血清是否具有中 和病毒的能力。以病毒經不同稀釋度的免疫血清中和后對細胞的感染力強弱為特征，得出該待檢血清的中和效價。該方法被認為是血清抗體檢測最經典、最標準的方法。通常的做法是固定病毒稀釋血清法，用100 TCID5tl測定倍比稀釋的血清中和指數，血清(陽性對照血清、陰性對照血清、待檢血清)均須56°C，30min滅活，用于國際貿易檢疫時病毒血清孵育時間采用24h來提高敏感性。由于IBRV目前認為只有I個血清型，用I個已知標準毒株進行血清中和試驗就可以做出確診。但該方法存在操作復雜、試驗周期長缺點，另外，對操作人員的操作熟練程度要求較高。2.酶聯免疫吸附試驗(國際貿易指定實驗):目前在大批量動物進出境檢疫時首選的方法是ELISA，被推廣使用主要包括間接ELISA和阻斷ELISA。ELISA方法因具有簡便、快速、準確優點，為目前檢測IBRV主要選取方法之一，而且市場上已有多種商品化ELISA試劑盒，還可適用于檢測牛奶中的gE糖蛋白抗體，但是，由于ELISA標準程序尚未建立，目前使用的ELISA試劑盒，多數為各自實驗室自行建立自行使用，普遍尚未在國家參考實驗室進行質量評估，缺乏足夠的數據支持。霍烽等(2006)對國產試劑盒與中和試驗的對比試驗，發現主要存在有重復性差、敏感性不一致、與中和試驗結果符合率變化大等問題。由此可見，出現假陽性或假陰性的幾率較大，很難確保檢疫質量，若使用進口的試劑盒價格高，檢疫成本相應增高。3.間接血凝試驗:常采用微量凝集法來檢測被檢血清中的抗體，是一種較為簡便、快速、實用的實驗室診斷方法。程國富(1996)成功地利用間接血凝試驗對IBR單克隆抗體進行篩選。但該方法受諸多客觀因素限制，如最佳致敏抗原的選擇、濃度要求，綿羊紅細胞的致敏、PH值、溫度和抗原抗體作用時間等，這些因素不夠恒定，均對檢測結果準確性有較大影響。4.瓊脂免疫擴散試驗:可用已知的IBR抗原檢查被檢血清中的沉淀抗體的存在，該方法簡單適用，成本較低，但由于其敏感性較低，只有當感染牛抗體呈現很高滴度才能檢出，應用價值受到限制。

5.間接免疫熒光試驗:建立間接免疫熒光試驗可檢查流產胎兒牛體內的特異性抗體，而且與血清中和試驗進行比較。但是檢測對象與范圍有限，未能得到推廣應用。此外還有對流免疫電泳、微量補體結合試驗等報道。單抗介導的斑點納米金滲濾法是80年代發展起來的固相標記免疫檢測法，最初以酶作為標記物，1989年發展了以膠體金為標記物用于檢測艾滋病病毒抗體的滲濾試驗，確立了 DIGFA的基本技術。其原理是以微孔濾膜為載體包被已知抗原或抗體，加入待檢標本后，經濾膜的毛細虹吸作用使標本中的抗體(或抗原)與膜上包被的抗原(或抗體)結合，再通過與膠體金結合形成復合物而出現肉眼可見的粉紅色斑點。膠體金金顆粒對蛋白質有很強的吸附功能，可與毒素、糖蛋白、酶、抗生素等多種物質共價結合，使其成為免疫反應的優良標記物。目前已廣泛應用于醫學臨床診斷。此法簡便快速、特異敏感，可在現場應用，幾分鐘或十幾分鐘就可用肉眼觀察到結果。由于IBRV具有潛伏感染性，自然感染牛的中和抗體在感染后15d左右滴度達到高峰，可持續I個 2個月，隨后逐漸下降，有些牛最低值可能降到零，此時轉變在潛伏期感染，此后，一旦受到應激因素刺激，體內的病毒量又增殖，抗體滴度再度上升，并向外排毒，如此反復呈現波浪式起伏，因此，即便通過中和試驗或ELISA法檢測牛群IBR抗體呈陰性反應結果，仍難以確認牛群的IBRV感染狀態。

發明內容
本發明的目的是，提供一種抗牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株。
抗牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，保藏編號為:CGMCCN0.6253 ；
抗牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體，它是由上述的雜交瘤細胞株分泌的。本發明的另一個目的是提供一種單抗介導的納米金斑點滲濾法檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的試紙條。單抗介導的納米金斑點滲濾法檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的試紙條，它包括:金標抗體、兔抗鼠二抗、兔抗IBRV多克隆抗體,所述的金標抗體為膠體金標記前述的抗牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體
所述的兔抗IBRV多克隆抗體的濃度為15Pg/mL。本發明提供了抗牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，用其分泌的單克隆抗體作為金標抗體，兔抗鼠二抗作為檢測的質控孔、兔抗IBRV的抗體檢測孔組成的單抗介導的納米金斑點滲濾法檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的試紙條，檢測下限為IOOTCID5q左右，與病毒分離相當，具有較高敏感性；用試紙條方法和PCR方法共同檢測已知的246份樣品，結果試紙條陽性檢出率為2.44%，PCR陽性檢出率為3.25%，兩者陰性檢出符合率為99.17%，說明自制試紙條與PCR有較高的符合率；與^0^、牛赤羽病(BAD)、牛流行熱(BEV)、茨城病(IDV)等四種病毒樣品無交叉反應。用本明的試紙條重復檢測5次同一樣品，5次檢測結果均一致，表明重復性強；操作時不需要特殊試驗條件，肉眼易于判斷結果，適宜在廣大基層單位推廣和應用。
具體實施例方式實施例1
1、用MDBK細胞增殖牛傳染性鼻氣管炎病毒Bartha Nu/67株(本室保存)，蔗糖梯度離心法純化濃縮后的病毒。取少量經磷鎢酸負染后，在電鏡下觀察到具有典型皰疹病毒特征的牛傳染性鼻氣管炎病毒。測定蛋白含量后，最終稀釋成20(^g/100mL，加入等量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑制成免疫抗原；
選擇4-6周齡雌性Balb/c小鼠16只(購自長春生物制品有限公司)，分成免疫組與對照組兩組，8只/組，用免疫抗原進行首免，二免、三免使用弗氏不完全佐劑制備的疫苗進行免疫注射，最后一次免疫于融合前3天進行加強，具體免疫程序如表I ;每次免疫前進行剪尾采血，分離血清并用ELISA方法監測小鼠的免疫抗體水平。測定的OD值，選擇平均值最高的小鼠進行融合。I組第3只、第6只小鼠適合用于融合；
表1免疫程序
權利要求
1.抗牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，保藏編號為=CGMCCN0.6253。
2.抗牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體，它是由保藏編號為=CGMCCN0.6253的雜交瘤細胞株分泌的。
3.單抗介導的納米金斑點滲濾法檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的試紙條，它包括:金標抗體、兔抗鼠二抗、兔抗IBRV多克隆抗體,所述的金標抗體為膠體金標記保藏編號為:CGMCC N0.6253的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。
4.根據權利要求3所述的單抗介導的納米金斑點滲濾法檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的試紙條， 其特征在于:所述的兔抗IBRV多克隆抗體的濃度為15呢/mL。
全文摘要
本發明公開了單抗介導的納米金斑點滲濾法檢測IBRV的試紙條，它是用抗牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體作為金標抗體、兔抗鼠二抗作為檢測的質控孔、兔抗IBRV的抗體檢測孔組成的單抗介導的納米金斑點滲濾法檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的試紙條，檢測下限為100TCID50左右，與病毒分離相當，具有較高敏感性；與PCR方法檢測的陰性檢出符合率為99.17%，和BVDV、牛赤羽病(BAD)、牛流行熱(BEV)、茨城病(IDV)病毒樣品無交叉反應；重復檢測50次，結果均一致，表明重復性強；操作時不需要特殊試驗條件，肉眼易于判斷結果，適合在廣大基層單位推廣和應用。
文檔編號C12N5/20GK103146651SQ201310029169
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者孟日增, 石建平, 宋戰昀, 孟慶峰, 肖成蕊, 蔡陽 申請人:中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局