專利名稱：胰腺β細胞增殖的刺激的制作方法
技術領域：
本發明提供了一種與胰腺β細胞增殖和/或胰島素分泌相關的新型蛋白、編碼該蛋白的核酸和構建體以及包含該核酸和構建體的細胞。本發明還提供了 ΤΜΕΜ27蛋白的診斷學和治療學應用。
背景技術：
為了維持生理性生長和肥胖過程中的血糖量正常，胰腺β細胞增殖是一種重要的適應機制。越來越多的證據表明β細胞質量是動態的，并且在胰島素抵抗和妊娠過程中對胰島素分泌的要求有所增加，這可能引起β細胞質量迅速而明顯的變化。β細胞質量由β細胞生長(復制)和β細胞死亡(凋亡)之間的平衡來控制，然而，控制β細胞質量的因素的分子基礎仍有待闡明。理解β細胞質量是如何調控的，對于設計合理途徑以在胰島素抵抗狀態下防止胰腺β細胞損失以及擴充用于I型糖尿病中的移植的β細胞非常重要。在發育過程中，β細胞由胰腺祖細胞群產生。由祖細胞分化的β細胞是有絲分裂期后的，直接譜系示蹤研究表明祖細胞群在胚胎形成的整個過程中持續存在，以允許新β細胞的分化。在新生兒期，新β細胞通過分化的β細胞復制而形成，引起β細胞質量的巨大增加。除了在需求增加的條件下，成人期β細胞數量幾乎沒有增加。在妊娠過程中，在嚙齒動物和人類中，均觀察到β細胞顯著增殖。這是由于暴露于胎盤催乳素(PL)、催乳素(PRL)和生長激素(GH)的β細胞減數分裂活性增加。人們對病理性胰島素抵抗狀態下的生長刺激信號則理解得比較少。幾種胰島素抵抗和糖尿病的小鼠模型，例如ob/ob和db/db小鼠或者通過胰島素受體底物-1 (IRS-1)基因失活或胰島素受體和IRS-1的雙雜合(DH)敲除產生的突變小鼠，表現出顯著的胰島增殖。相反，IRS2功能的喪失則引起β細胞顯著減少和糖尿病。已知葡萄糖本身刺激β細胞復制，然而，多種上述小鼠模型在出現可檢測的高血糖癥之前，其總胰島質量已經增加了。而且，大多數情況下，所述增殖反應與高血糖癥水平沒有關系，暗示可能有不依賴于葡萄糖的因素促進胰島生長。發育過程中的內分泌胰腺生長依賴于多種轉錄因子，所述轉錄因子表現出高度特異的時空表達模式，其控制細胞分化機制。在早期胰腺發育過程中，內分泌祖細胞的細胞命運決策和分泌祖細胞分化成產生激素的胰島細胞，受到特異性轉錄因子順序表達的嚴密調控。這些因子的表達對于維持成人(成體)生命中的正常胰腺β細胞功能也非常重要。例如，幾種轉錄因子的突 變導致2型糖尿病的一個亞型，稱為青春晚期糖尿病(MODY)，其特征在于常染色體顯性遺傳、發病年齡早，且形成具有胰島素分泌累積性障礙的顯著高血糖癥。MODY最常見的形式由編碼肝細胞核因子(Tcfl)的基因突變引起。Tcfl功能喪失的突變小鼠以及轉基因小鼠(其表達胰腺β細胞中天然存在的顯性失活形式的人HNF-1 (P291fsinsC)),由于葡萄糖刺激的胰島素分泌障礙，表現出隨年齡累積的高血糖癥。這些小鼠表現出β細胞數量、增殖速率和胰腺胰島素含量的累積性減少。這些數據表明Tcf-1靶基因對于維持正常β細胞質量也是必需的，盡管其身份仍然未知。

發明內容
在一個具體實施方式
中，本發明提供一種分離的核酸，其包含編碼ΤΜΕΜ27蛋白的基因的調控區，其中所述調控區包含至少一個Tcfl蛋白的高親和力結合位點。在一個具體實施方式
中，所述調控區具有對應于或同源于SEQ ID NO:10或11的核酸序列。在另一個具體實施方式
中，所述結合位點包含對應于或同源于SEQ ID Ν0:12、13、14或15的核酸序列。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種細胞，或者在另外一個具體實施方式
中，提供包含本發明核酸的載體。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種分離的多肽，其包含ΤΜΕΜ27蛋白的分泌形式，其中所述多肽大小約25kDa，且包含對應于或同源于SEQ ID NO: 16的序列的N-末端片段。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種增加胰腺β細胞質量的方法，所述方法包括用ΤΜΕΜ27多肽接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞，且提供有利于β細胞增殖的條件。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種增加胰腺β細胞質量的方法，所述方法包括用編碼ΤΜΕΜ27多肽的核酸接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞，且提供有利于所述核酸表達的條件。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種改變患者新陳代謝的方法，所述方法包括用ΤΜΕΜ27多肽或編碼所述ΤΜΕΜ27多肽的核酸接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞。 在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種抑制、遏制或治療患者糖尿病的方法，所述方法包括用ΤΜΕΜ27多肽或編碼所述ΤΜΕΜ27多肽的核酸接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種估計患者胰島質量的方法，所述方法包括確定所述患者血清中ΤΜΕΜ27濃度的步驟以及將所述濃度與對照濃度進行比較的步驟。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種用于鑒定與ΤΜΕΜ27蛋白或其分泌形式相互作用的蛋白的方法，所述方法包括在足以促進所述多肽與所述感興趣分子之間特異性相互作用的條件下，用感興趣分子接觸ΤΜΕΜ27多肽一段時間，以及鑒定所述感興趣分子的步驟。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種增加胰腺β細胞質量的方法，所述方法包括用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞，并提供利于所述核酸表達的條件。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種改變患者新陳代謝的方法，所述方法包括用用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種抑制、遏制或治療患者糖尿病的方法，所述方法包括用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞。


圖1表明ΤΜΕΜ27的表達受Tcfl調控。(A)相比野生型小鼠對照，Tcfl+小鼠胰島中的ΤΜΕΜ27表達降低。用RT-PCR測定表達水平，GAPDH用作對照。(B)啟動子分析在人類調控區(SEQ ID NO:10)和小鼠調控區(SEQ ID NO:11)ΤΜΕΜ27基因上游預測了兩種保守的Tcf結合位點，位于相對于轉錄起始位點-60和-117的堿基對。將人類和小鼠啟動子序列進行比對，并將Tcf結合位點用藍色框起來。第二位點(紅框)表示推定的Pdx-1結合位點。加亮的序列(綠色)表示突變Tcf結合位點的位置。(C)HepG2細胞中的轉錄激活分析，該細胞用pcDNA3或pTcfUpCMV-β -半乳糖苷酶和利用815bp TMEM27小鼠啟動子的螢光素酶報告子基因進行轉染。Tcf結合位點在所述報告載體的啟動子序列中單獨發生突變，而MIN6細胞用載體pT271uc-wt、pT271uc_ml或pT271uc_m2進行轉染。將螢光素酶活性相對于β半乳糖苷酶活性進行標準化。每一個數值均代表8次獨立試驗的平均值。(D)利用針對Tcf結合位點I和2的寡核苷酸以及ΜΙΝ6的總細胞提取物進行的EMSA分析。競爭物表示50倍過剩、針對結合位點I和2的未標記雙鏈寡核苷酸。暗色(深色)楔子表示Tcfl與標記32ρ標記的探針之間的相互作用，亮色(淺色)楔子表示加入a -Tcfl抗體后該相互作用的抗體膠移動。Pdxl也結合于位點2,因為該相互作用可以通過抗-Pdxl抗體而變動。(Ε)ΜΙΝ6細胞中的ChIP分析證實了 Tcfl與ΤΜΕΜ27啟動子的體內相互作用。通過PCR擴增跨越結合位點I和2的150bp區域。該相互作用在不表達TMEM27的原代肝細胞中不存在。用于Tcfl的ChIP 通過擴增ApoM啟動子內跨越Tcfl結合位點的區域而進行驗證。圖2表明TMEM27在發育過程中的小鼠胰腺中表達。用抗Col_4、抗胰島素和抗胰高血糖素抗體對來自小鼠發育過程指定時間點的石蠟包埋胰腺組織進行免疫熒光。圖3表明TMEM27是N-糖基化蛋白且形成二聚體。(A)將MIN6細胞與量不斷增加的衣霉素一起孵育，衣霉素在天(門)冬酰胺殘基抑制糖基化作用。僅向細胞加入DMSO則無效應。(B)將MIN6細胞的上清與N-聚糖酶一起孵育。Western印跡中的分子量變動表示所述酶從分泌的TMEM27去除了糖部分。分泌蛋白用抗Col-3抗體進行檢測。(C)將MIN6細胞裂解物與PBS或交聯劑DTBP和BMH —起孵育。非還原條件下的SDS-PAGE和利用抗Col-4抗體的免疫印跡顯示有一個條帶的分子量為全長TMEM27分子量的2倍。在還原條件下，在PBS和DTBP處理的細胞裂解物中則僅檢測到單體。相反，由于BMH交聯不可逆，所以在BMH處理的樣品中，二聚體持續存在。圖4表明TMEM27從胰島的β細胞上切割并分泌。(A)在ΜΙΝ6細胞的Western印跡中，抗Col-4抗體檢測到TMEM27的兩個條帶。在過表達pTMEM27.V5_His的細胞中，25kDa條帶變得更加豐富。(B)來自(A)的細胞裂解物的免疫印跡用抗a-V5抗體進行檢測。在PTMEM27.V5-His轉染的細胞中，抗V5抗原表位的抗體也檢測到兩種條帶，在pcDNA3轉染的細胞中則未檢測到。(C)表示細胞系用pcDNA3或pTMEM27進行轉染，用抗Col_4在細胞裂解物的Western印跡中檢測到了全長蛋白。用抗Col_3則僅在MIN6細胞的上清中檢測到分泌蛋白。全長蛋白表達增加僅引起MIN6細胞中分泌蛋白的量增加。(D)分離小鼠胰島并孵育72小時。收集上清并將胰島轉移至裂解緩沖液中。在裂解物的Western印跡中用抗Col-4檢測到全長蛋白，在用相同體積上清上樣的進行的Western印跡中則用抗Col_3檢測到分泌蛋白。(E)MIN6細胞用針對GFP或TMEM27的siRNA進行電穿孔。在用si_TMEM27#l和#2進行電穿孔的細胞中，于電穿孔后48小時用抗Co 1-4檢測到TMEM27蛋白水平的降低。用來自相同細胞、體積相等的上清進行SDS-PAGE，用抗Col-3檢測到分泌蛋白的水平降低。(F)MIN6細胞用pcDNA3、pTMEM27或pTMEM27_HA進行電穿孔。通過利用抗Col_4抗體的細胞裂解物進行Western印跡，檢測到TMEM27過表達。來自相同細胞的上清用抗HA抗原表位的抗體進行Western印跡。圖5表明TMEM27定位于胰腺β細胞的小囊泡中和細胞膜上。㈧將ΜΙΝ6細胞用0.01 %皂角甙進行透化并用抗Col-4抗體進行染色。利用抗Col-3抗體進行免疫熒光顯微鏡檢查，給出了類似結果。(B)用抗Col-4抗體對MIN6細胞進行電子顯微鏡檢查，將TMEM27定位于小囊泡中。軛合于IOnm金顆粒的IgG用于檢測所述抗體。(C)利用與(B)中相同的方法，在與細胞膜融合過程中檢測到包含TMEM27的小囊泡。圖6表明TMEM27增加β細胞的體外復制。(A)在從ob/ob小鼠和野生型小鼠對照分離的胰島中，用半定量RT-PCR測定TMEM27的表達水平。GAPDH用作上樣對照。⑶在從轉基因aP-Srebplc小鼠及其野生型小鼠(同窩出生仔)對照中，如上測定TMEM27的表達水平。(C)從野生型和ob/ob小鼠分離的胰島數量和大小匹配，并在相同體積的培養基中孵育72小時。用抗Col-3檢測分泌蛋白。(D)MIN6細胞用針對螢光素酶或TMEM27的siRNA進行電穿孔。攝制20倍 放大的細胞代表圖像。電穿孔后48小時，將細胞用胰蛋白酶進行處理、用錐蟲藍染色并用血細胞計數器進行計數。每一個數值均代表6次獨立實驗的平均值。(E)MIN6細胞用pcDNA3或pTMEM27進行電穿孔，如上重復實驗。(F)MIN6細胞如所指定的進行電穿孔，通過[3H]胸苷摻入來測量細胞的復制。圖7表明，響應于胰腺β細胞中ΤΜΕΜ27表達增加而出現胰島質量增加。(A)在從RIP-TMEM27轉基因小鼠和野生型小鼠對照分離的胰島Western印跡中，用抗Col_4檢測到TMEM27表達增加。(B)將來自轉基因和對照動物(η = 3)的整個胰腺在石蠟中包埋，并針對胰島素進行染色。圖像代表每一種基因型在5倍放大的圖示。(C)利用Metamorph軟件對7 μ m切片中的胰島素染色進行定量。對每一個胰腺,均在距離大于200 μ m的切片中定量至少50個胰島。(D)將整個胰腺從轉基因和野生型小鼠(η = 3)上分離，并在酸/乙醇中均質化。胰島素含量相對于每個胰腺重量進行標準化。圖8表明ΤΜΕΜ27可以是絲氨酸和/或金屬蛋白酶的底物。相比于與佛波酯佛波(12-)-肉豆蘧酸(-13-)乙酸(PMA)或與ΒΒ94+ΡΜΑ—起孵育的ΜΙΝ6細胞，與絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶抑制劑ΒΒ94 —起孵育的ΜΙΝ6細胞具有較低水平抗體識別的已切割N末端。用抗V5(其標記ΤΜΕΜ27的C末端)抗體檢測的細胞，在所有小組中均表現出可比較的條帶。
具體實施例方式在接下來的詳細描述中，為了提供對本發明的徹底理解，列出了大量特殊細節。然而，本領域的技術人員能理解本發明可以在無這些特殊細節的情況下實施。在其他實例中，為了使本發明清楚，未對公知的方法、步驟和組分進行詳細描述。在一個具體實施方式
中，本發明提供一種胰腺β細胞特異蛋白，其參與β細胞增殖和胰島素分泌。如本文所述，MODY常見形式由編碼肝細胞核因子(Tcfl)的基因突變引起。胰腺β細胞中Tcfl功能喪失的突變小鼠，由于葡萄糖刺激的胰島素分泌障礙，表現出隨年齡累積的高血糖癥。所述小鼠表現出β細胞數量、增殖速率和胰腺胰島素含量的累積性減少，表明Tcfl靶細胞對于維持正常β細胞質量也是必需的。Tcfl是ΤΜΕΜ27轉錄的直接激活齊U，如本文中所證實的。本文中顯示在胰腺發育過程中ΤΜΕΜ27在激素陽性細胞中表達，在成熟胰腺中則限于胰腺β細胞中表達。已表明ΤΜΕΜ27是一種糖蛋白，在胰腺中特異性切割并由β細胞釋放，且是體外和體內β細胞復制的刺激劑。在一個具體實施方式
中，本發明提供一種分離的核酸，其包含編碼ΤΜΕΜ27蛋白的基因的調控區，其中所述調控區包含Tcfl蛋白的至少一個高親和力結合位點。在一個具體實施方式
中，術語“調控區”指的是啟動子，其是一種DNA序列，在一個具體實施方式
中，其位于編碼序列的上游，對于基因的基礎轉錄和/或調控轉錄非常重要。在一個具體實施方式
中，該啟動子是內源性啟動子，包含Tcfl蛋白的至少一個高親和力結合位點。在一個具體實施方式
中，該啟動子是內源性啟動子的突變體，其包含至少一個Tcfl蛋白的高親和力結合位點。該啟動子序列中的突變可以增強Tcfl結合，或者在另一個具體實施方式
中延遲Tcfl解離，或者在另一個具體實施方式
中，通過任何途徑改變Tcfl與ΤΜΕΜ27啟動子的結合，從而影響其轉錄。在另一個具體實施方式
中，將根據得到的ΤΜΕΜ27表達水平來評估這 些突變體的啟動子強度。在一個具體實施方式
中，該調控區具有對應于或同源于SEQ ID NO: 10或11的核酸序列。用于本發明中的核酸可以通過本領域中公知的任何合成或重組方法而生成。核酸還可以利用本領域中已知的技術經修飾而改變生物物理學或生物學特性。例如，該核酸可以經修飾增加其對核酸酶的穩定性(例如，“末端加帽”)，或改良其親油性、溶解度或對互補序列的結合親和力。這些核酸可以包含載體、表達盒、啟動子序列、感興趣基因或其任何組
口 ο根據本發明所述的DNA也可以通過本領域中已知的方法化學合成。例如，所述DNA可以通過本領域中已知的方法全部或部分從四種核苷酸化學合成。這些方法包括Caruthers (1985)中描述的方法。DNA也可以通過制備重疊的雙鏈寡核苷酸、填補空缺并將末端連接在一起而合成(通常參見:Sambrook et al.(1989)和Glover et al.(1995))。表達該蛋白功能性同系物的DNA可以通過位點指導(Site-directed)的誘變作用由野生型 DNA 制備而得到(見例如 Zoller et al.(1982) ；Zoller (1983);和 Zoller (1984)；McPherson(1991))。得到的DNA可以通過本領域中已知的方法而擴增。一個恰當的方法是在 Saiki et al.(1988)、Mullis et al.、美國專利第 1，683，195 號和 Sambrook etal.(1989)中描述的聚合酶鏈式反應(PCR)法。在另一個具體實施方式
中，該Tcfl結合位點包含對應于或同源于SEQ ID NO:12,13、14或15的核酸序列。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種包含本發明核酸的細胞，或者在另外一個具體實施方式
中，提供包含本發明核酸的載體。在一個具體實施方式
中，術語“載體”指的是包含感興趣序列(其已經在該載體內亞克隆)的核酸構建體。為了產生根據本發明所述的載體，編碼TMEM27調控區的多核苷酸，(在一些具體實施方式
中，為TMEM27的編碼區，而在一些具體實施方式
中為其他感興趣序列)可以連接入市售的表達載體系統中，所述表達載體系統適于轉導/轉化真核或原核細胞以指導被轉導/轉化的細胞內重組產物的表達。應該理解，為了取代、復制或突變現存的啟動子或增強子序列和/或引入任何其他多核苷酸序列，例如編碼其他選擇標記物的序列或編碼報告子基因的序列，可以很容易通過通常使用的重組技術而改良這些市售載體系統。在另一個具體實施方式
中，根據本發明所述的載體可以進一步包括恰當的可選擇標記物。該載體可以進一步包括復制起始點，而且可以是穿梭載體，其既可以在原核細胞又可以在真核細胞中繁殖，或者該載體可以經構建促進其在選擇微生物基因組內整合。在其他具體實施方式
中，該載體可以為例如質粒、桿粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。在另一個具體實施方式
中，本發明提供包含本發明所述核酸和載體的脂質體。用于制備這種脂質體的方法在本領域中是公知的，正如在例如W096/18372、W093/24640、Mannino和 Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7):682_691、Rose 美國專利第 5，279，833 號；W091/06309，以及 Feigner et al.(1987) Proc.Natl.Acid.Sc1.USA84:7413-7414)中所描述的。在另一個具體實施方式
中，本發明提供分離的多肽，包含TMEM27蛋白的分泌形式，其中所述多肽大小約25kDa，且包含對應于或同源于下述序列的N末端片段:MLWLLFFLVTAIHAELCQPGAENAFKVRLSIRTALGDKAYAffDT NEEYLFKAMVAFSMRKVPNREATEISHVLLCNVTQRVSFffFVV TDPSKNHTLPAVEVQSAIRMNK`NRINNAFFLNDQTLEFLKIPSTL APPMDPSVPIWIIIFGVIFCIIIVAIALLILSGIffQRRRKNKEPSEVD DAEDKCENMITIENGIPSDPLDMKGGHINDAFMTEDERLTPL(SEQ ID NO:16)。在一個具體實施方式
中，該分泌形式包含142個氨基酸。在另一個具體實施方式
中該分泌形式包含N末端的100個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的105個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的110個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的115個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的120個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的125個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的130個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的135個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的140個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的122個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的127個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的117個氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中包含N末端的108個氨基酸。在一個具體實施方式
中，TMEM27蛋白具有的序列對應于或同源于一個NCBI’ sEntrez蛋白質數據庫中披露的序列，具有下列登陸號:NP_065651、AAH50606、AAHl5099,XP_416821、AAH49912或者AAH14317。在一個具體實施方式
中，本發明所述的多肽包含的氨基酸對應于TMEM27蛋白1-142位置的氨基酸，或者在另一個具體實施方式
中對應于其N末端片段，或者在另一個具體實施方式
中，對應于其同系物。在一個具體實施方式
中，任何情況下，術語“同源性”、“同系物”或“同源的”均表示所提到的序列，無論是氨基酸序列還是核酸序列，均表現出與指定序列至少70 %的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列至少72%的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列至少75%的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列至少77%的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列至少80%的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列至少82%的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列至少85%的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列至少87%的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列至少90%的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列至少92%的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列至少95%的一致性。在另一個具體實施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現出與指定序列95% -100%的一致性。類似地，如在本文中使用的，提到與一個特定序列的一致性既包括直接對應，也包括與該序列的同源性，如在本文中所定義的。在一個具體實施方式
中，術語“多肽”指的是蛋白，在另一個具體實施方式
中指的是蛋白片段，或者在另一個具體實施方式
中指的是一串氨基酸。在一個具體實施方式
中，在提到本發明的任何多肽時，提到“肽”或“多肽”，其意思既包括天然肽(降解產物、合成肽或重組肽)以及擬肽(通常是合成肽)，例如類肽和半類肽，其為肽類似物，可能含有(例如)修飾使得所述肽在體內更加穩定或者更易于滲入細胞內。這種修飾包括但不限于N末端、C末端或肽鍵修飾，后者包括但不限于主鏈修飾和殘基修飾，每一種均代表本發明一個另外的具體實施方式
。用于制備擬肽化合物的方法是本領域中公知，且在例如QuantitativeDrug Design, C.A.Ramsden Gd.，Chapterl7.2, F.Choplin Pergamon Press (1992)中進行了詳細說明。應該理解，通過任何途徑得到的天然或合成的任何氨基酸序列，只要表現出與本文中所描述多肽的序列、結構或功能同源性，均認為是本發明的一部分。在一個具體實施方式
中，在提到任何核酸序列時，術語“同源性”均表示候選序列中的核苷酸與相應的天然核酸序列核苷酸一致的百分比。同源性可以利用本領域中詳細描述的方法通過用于序列比對的計算機算法來確定。例如，核酸或氨基酸序列同源性的計算機算法分析可以包括利用任何數量的可用軟件包，如 BLAST、DOMAIN、BEAUTY (BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT 和 TREMBL包。另一種確定核酸同源性的方法是通過確定候選序列的雜交作用，其方法在本領域中已經詳細描述過(見例如 “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B.D.，andHiggins S., Eds.(1985) ；Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A LaboratoryManual, (Volumesl-3)Cold Spring Harbor Press, N.Y.;以及 Ausubel et al., 1989，Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and WileyInterscience, N.Y.)。例如，對編碼天然半胱天冬酶肽的DNA的互補物，雜交方法可以在中度到嚴格條件下實施。 雜交條件為例如在一種溶液中42°C孵育過夜，該溶液中含有:10-20 % 甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl、15mM 枸櫞酸鈉)、50mM 磷酸鈉(PH7.6)、5XDenhardtJ s液、10%硫酸葡聚糖以及20 μ g/ml變性的剪切鮭精DNA。在另一個具體實施方式
中，本發明提供特異性識別本發明所述多肽的抗體。這樣一種抗體的生產在本領域中是公知的，可以包括如Harlow and Lane, Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York, 1988 中描述的方法。在一個具體實施方式
中，這種抗體可以包含功能片段，其為本領域中技術人員所熟知，且可以通過抗體的蛋白水解或者通過編碼該片段的DNA在E.coli或哺乳動物細胞(例如中華倉鼠卵巢細胞培養物或其他蛋白表達系統)內表達而制備。在另一個具體實施方式
中，本發明提供包含本發明所述細胞、多肽、抗體、核酸和載體的組合物。特定組合物制劑的有效劑量和給藥方法可以根據特定應用而不同。劑量可以作為(例如)所采用載體類型和給藥途徑的函數而變動。在另一個具體實施方式
中，本發明提供包含本發明所述核酸、載體或多肽的細胞。在一個具體實施方式
中，該細胞為原核細胞，或在另一個具體實施方式
中，所述細胞為真核細胞。細胞可以為任何能夠表達本發明所述分離的核酸和/或載體的細胞，如本領域中技術人員已知的。在一個具體實施方式
中，細胞可以過表達本發明所述的多肽。在另一個具體實施方式
中，細胞響應本發明所述的多肽。在一個具體實施方式
中，所述細胞是胰腺β細胞或可能分化為胰腺β細胞的細胞。在一個具體實施方式
中，所述細胞一旦暴露于ΤΜΕΜ27(在一個具體實施方式
中，其為全長蛋白，或者在另一個具體實施方式
中，其為已切割的分泌形式)就出現增殖，或者在另一個具體實施方式
中分泌胰島素，或者在另一個具體實施方式
中，既增殖又分泌胰島素。在一個具體實施方式
中，所述細胞是終末分化的，或者在另一個具體實施方式
中為不分裂的。在另一個具體實施方式
中，所述細胞是分裂的。在一個具體實施方式
中，本發明提供核酸、載體、多肽、細胞以及包含上述物質的組合物，在另一個具體實施方式
中，其可能經配制用于口服給藥，在另一個具體實施方式
中經配制用于局部給藥，例如通過氣霧劑、肌內或經皮膚給藥或者通過腸胃外應用。根據給藥方法的不同，組合物可以以多種單位劑量形式給藥。恰當的單位劑量形式包括但不限于粉齊 、片劑、丸劑、膠囊、錠劑、栓劑等。經皮膚給藥可以通過應用能夠允許活性化合物滲入皮膚的膏狀物、沖洗劑、凝膠等而實現。腸胃外給藥途徑包括但不限于電注射或直接注射例如直接注射入中樞靜脈輸血導管、靜脈內、肌內、腹膜內、皮內或皮下注射。本文中證實ΤΜΕΜ27在新生兒和成人胰腺的胰島β細胞內表達(圖2)，且發現ΤΜΕΜ27蛋白的N末端切割產物被分泌(圖4)。β細胞系響應于ΤΜΕΜ27而增殖(圖6)，由于所述轉基因的表達，過表達該蛋白的轉基因小鼠表現為β細胞質量增加(圖7)。在一個具體實施方式
中，本發明提供一種增加胰腺β細胞質量的方法，其中所述方法包括用ΤΜΕΜ27多肽接觸細胞。根據本發明所述的這個方面，且在一個具體實施方式
中，所述細胞是胰腺β細胞，或者所述細胞可以經誘導變成胰腺β細胞，并提供利于β細胞增殖的條件。

在一個具體實施方式
中，術語“接觸細胞”指的是細胞暴露于本發明所述的肽、核酸或組合物。細胞可以與本發明所述的化合物和組合物直接接觸，或者通過本領域中已詳細描述的方法間接暴露。例如，在體外培養基中生長的細胞，其中所述培養基用本發明所述的多肽、核酸、載體或組合物加以補充，為一種接觸細胞方法的實例，且認為是本發明的一部分。在另一個具體實施方式
中，接觸細胞可以包括任何對患者的給藥途徑，例如將本發明所述的肽、核酸、載體或組合物通過口服或腸胃外給予患者，其中給藥使得體內特定部位中的體內細胞暴露于這些物質。在一個具體實施方式
中，所述被接觸細胞是原代培養物。在一個具體實施方式
中，“原代培養物”表示允許從組織中分離的多種不同細胞類型相互作用的混合細胞群。例如，胰腺導管細胞的原代培養物可以允許間充質細胞和上皮細胞之間的相互作用。在另一個具體實施方式
中，原代培養物可以為從組織中分離的純化細胞群。在一個具體實施方式
中，所述原代培養物可以對一種特殊(細胞)群進行富集。在一個具體實施方式
中，富集可以包括通過本領域中公知的方式進行細胞分選，例如熒光激活細胞分類術(FACS)，用于例如表達特定細胞表面標記物的細胞群，或者在另一個具體實施方式
中，用于無特定標記物的細胞表面表達的細胞群。在另一個具體實施方式
中，可以采用磁分離法，或者在另一個具體實施方式
中，可采用密度離心法如聚蔗糖-泛影葡胺或蔗糖梯度分離法。在一個具體實施方式
中，根據本發明方法所述的被接觸細胞是干細胞或祖細胞。術語“祖細胞”作為“干細胞”的同義詞使用，在一些具體實施方式
中指的是能夠增殖并產生更多祖細胞的未分化細胞，所述祖細胞具有產生大量母細胞的能力，母細胞又能產生分化的或可分化的子細胞。在一個具體實施方式
中，術語祖細胞或干細胞指的是無顯著特點的母細胞，其后代(子代)常常可以通過分化(例如通過獲得徹底個體化特征)而向不同方向而特殊化，如在胚胎細胞和組織的漸進性多樣化中所發生的。細胞分化是一種復雜過程，通常通過多次細胞分裂而發生。分化的細胞可以起源于多潛能細胞，其本身來自多潛能細胞，等等。應該理解任何這種細胞均可用于本發明所述的方法，或者包含本發明所述的細胞。這種能力可以是天生的，或者可以在用多種因子治療后人工誘導，兩種方案之一均可認為是所述細胞的具體實施方式
，其可根據本發明所述的方法而使用，或者包含本發明所述的細胞。在一個具體實施方 式中，本發明所述的細胞以及用于本發明所述方法的細胞來源于胰腺，或者可分化為胰腺細胞。在一個具體實施方式
中，術語“胰腺”通常指的是橫向位于胃后、脾和十二指腸之間的大、伸長、總狀分枝的腺體。在一個具體實施方式
中，根據本發明所述的細胞可以包括組織切片或整個組織，其包括本文中所述的多肽、核酸、載體或組合物。在另一個具體實施方式
中，根據本發明所述的方法包括器官培養物，或者在另一個具體實施方式
中，包括組織切片或組織片段，其包含感興趣細胞群。在一個具體實施方式
中，使用胰島作為該細胞并用于本發明的方法中。在一個具體實施方式
中，所述細胞是β細胞，可構成胰島細胞的60-80%，和/或可用于本發明所述的方法中。在一個具體實施方式
中，所述細胞是胰腺祖細胞。在一個具體實施方式
中，術語“胰腺祖細胞”指的是可以分化為胰腺譜系細胞的細胞，例如能產生通常由胰腺細胞產生的激素或酶的細胞。例如，可以引起胰腺祖細胞至少部分分化為α、β、Υ或δ胰島細胞或者具外分泌命運的細胞。本發明所述的胰腺祖細胞也可以在給予患者前在能夠促進細胞增殖和分化的條件下培養。這些條件包括培養細胞允許體外增殖和融合，這時，所述細胞可以經制備形成假胰島狀聚集體或簇，并分泌胰島素、胰高血糖素和/或生長抑素。在一個具體實施方式
中，本發明所述的細胞以及用于本發明所述方法的細胞，可以為基本純化的細胞群。在一個具體實施方式
中，術語“基本純化的”指的是一群細胞，相對于整個細胞群，其至少約65%，或者在另一個具體實施方式
中至少約70%，或者在另一個具體實施方式
中至少約75%，或者在另一個具體實施方式
中至少約85%，或者在另一個具體實施方式
中至少約90%，或者在另一個具體實施方式
中至少約95%為純化的。
可以采用多種技術從組織獲得細胞(分化和未分化的)懸浮液，構成本發明所述細胞和/或用于本發明所述方法。在一些具體實施方式
中，分離操作是那些盡可能少地引起細胞死亡的操作。例如，所述細胞可以通過機械方式從分離塊樣品中取出，例如用移液管機械剝離。在其他情況下，可能從整個分離塊或其一部分解離祖細胞，例如通過酶消化該分離塊，隨后根據特定細胞標記物分離激活的祖細胞群，例如利用親和力分離技術或熒光激活細胞術(FACS)。細胞可以通過離心從液體樣品例如血液中獲得。通常，所述組織可利用任何恰當方法制備，例如通過輕柔挑撥離體組織或通過用膠原酶(例如膠原酶A)消化離體組織，借助于(為了闡明)通過導管滲透或例如將剝離組織在含有恰當pH和張力強度的緩沖液的膠原酶中的簡單孵育。可選地，隨后所述制備的組織可以利用恰當的方法和材料濃縮，例如通過聚蔗糖梯度離心來濃縮(或者部分純化)。濃縮的組織隨后重懸于任何恰當的容器中，例如玻璃或塑料組織培養器皿中。在某些具體實施方式
中，所述樣品胰腺組織可允許形成融合的單層培養物，NACs可形成自該培養物。在其他優選的具體實施方式
中，所述細胞懸浮液置于非黏附的培養容器中，且形成祖細胞球。在一個具體實施方式
中，所述細胞起源的組織可以為成人組織或胎兒組織或任何發育階段的組織。而且，所述方法可以用相對小量的初始材料實施。因此，無需處死或嚴重傷害供體，即可獲得供體的小組織樣品。本發明的祖細胞可以擴增，且隨后從組織樣品分離。在某些具體實施方式
中，可以用生長因子或包含生長因子(例如有絲分裂生長因子)的組合物接觸培養物，例如，所述生長因子選自由IGF-1、IGF-1I, LIF、TGFa、TGF3、bFGF、aFGF、HGF或Hedgehog組成的組。在其他具體實施方式
中，所述生長因子是TGF β超家族的成員。在一些具體實施方式
中，根據本發明所述的方法包含如本文所述將組合物給予患者，其中所述組合物可以包含本發明的細胞、多肽、核酸和/或載體，還包括本文所述的任何添加劑，包含例如糖尿病療法、生長因子、cAMP增強劑等。在一些具體實施方式
中，所述細胞或培養物中的細胞用cAMP增強劑(或者包含cAMP增強劑的組合物)接觸，例如8-(4-氯苯硫代)-阿糖腺苷-3’:5’_環-一憐酸(鹽)(CPT-cAMP)(參見例如 Koike Prog.Neuro-Psychopharmaco1.and Biol.Psychiat.1695-106 (1992))、CPT-cAMP、福斯高林、丁酸鈉、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和霍亂毒素(見 Martin et al.J.Neurobiol.231205-1220 (1992))以及8-溴-cAMP、二丁酰 cAMP 和二辛酰 cAMP (例如，見 Rydel et al.PNAS85:1257 (1988))。在一些具體實施方式
中，所述細胞或培養物中的細胞用類固醇或皮質類固醇(或者包含類固醇或皮質類固醇的組合物)接觸，例如氫化可的松、脫氧氫化可的松、氟氫可的松、去氫氫化可的松、甲基去氫氫化可的松、去氫可的松、氟羥潑尼松龍、地塞米松、倍他米松和對氟米松。一般參見，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed.,pp.1239-1267 和 2497-2506, Berkow et al.，eds.，Rahway N.J.，1987)。現在存在多種組織培養基適于培養來自動物包括人的組織。在一些具體實施方式
中，組織培養基可以為簡單培養基，例如Dulbecco’s必需基本培養基(DMEM)。在另一個具體實施方式
中，細胞、組織等在含有5% FBS的Isobecco’ s改良MEM細胞培養基中培養。在另一個具體實施方式
中，細胞、組織等在無血清的情況下長期維持。在本發明的一些具體實施方式
中，所述生長因子或其他有絲分裂劑未包括在用于體外維持培養物的原代培養基中，但隨后可用來引起不同細胞(例如祖細胞)群增殖。在另一個具體實施方式
中，干細胞由于其在缺乏對培養表面的黏附時仍能夠生長的能力，因而可以直接或間接富集。在一些具體實施方式
中，干細胞在懸浮液中自由浮動，而不與培養容器表面或相接觸的其他細胞或材料形成固定或半固定接觸。在一個具體實施方式
中，根據本發明所述的細胞用于(且本發明所述方法提供可移植細胞源)其分化子代的祖細胞群形式中，或者在另一個具體實施方式
中，受體細胞可用來產生胰腺細胞培養物以得到并純化分泌因子，例如TMEM27的分泌形式。在另一個具體實施方式
中，培養的細胞可以作為胰島素源而提供。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種增加胰腺β細胞質量的方法，所述方法包含用編碼ΤΜΕΜ27多肽的核酸接觸細胞，所述細胞是胰腺β細胞或者可以經誘導變成胰腺β細胞的細胞，以及提供有利于所述核酸表達的條件。在一個具體實施方式
中，β細胞質量增加通過增加β細胞增殖而實現。在一個具體實施方式
中，β細胞質量增加是由于祖細胞分化成β細胞系增加。在一個具體實施方式
中，β細胞質量增加指的是細胞轉換或死亡減少。在另一個具體實施方式
中，β細胞質量增加指的是上述具體實施方式
的任何組合。細胞增殖可 以通過本領域中公知的任何數量的方法來確定，如本文中所例示的，例如通過測定吸收標記的底物，例如氚標記胸苷，正如本領域中技術人員已知的。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種改變患者體內新陳代謝的方法，所述方法包括用ΤΜΕΜ27多肽或編碼所述ΤΜΕΜ27多肽的核酸接觸細胞，所述細胞是胰腺β細胞或者可以經誘導變成胰腺β細胞的細胞。在一個具體實施方式
中，改變新陳代謝指的是增加新陳代謝，而在另一個具體實施方式
中，其指的是減少新陳代謝。在一個具體實施方式
中，葡萄糖代謝被改變。在一個具體實施方式
中，所述細胞在體外或離體進行接觸。在另一個具體實施方式
中，所述細胞在體內接觸。在另一個具體實施方式
中，所述細胞是干細胞或祖細胞。在另一個具體實施方式
中，所述細胞從患糖尿病或易患糖尿病的患者中分離。在一個具體實施方式
中，所述方法包括將接觸過的細胞給予所述患者的步驟,例如離體細胞治療。在一個具體實施方式
中，給予患者的細胞相對所述患者是自體同源的，或者在另一個具體實施方式
中，相對所述患者是同種異體的。在一個具體實施方式
中，所述細胞用ΤΜΕΜ27多肽進行接觸，所述多肽包括全長蛋白或其片段。在一個具體實施方式
中，所述片段包含ΤΜΕΜ27蛋白的分泌形式。在另一個具體實施方式
中，所述分泌形式大小約25kDa，包含TMEM27蛋白的氨基酸1-142，或其片段，或其同源的序列。在一個具體實施方式
中，所述細胞還可以用蛋白酶抑制劑進行接觸。在一個具體實施方式
中，蛋白酶抑制劑是遏制、防止、減少、延緩，或以任何方式改變蛋白酶活性或表達或二者的分子。
在一個具體實施方式
中,所述蛋白酶抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)、金屬蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、硫代蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、蘇氨酸蛋白酶抑制劑、門冬氨酸蛋白酶抑制劑或其組合。在一個具體實施方式
中，蛋白酶抑制劑是(H0NH-C0CH2CH2C0-FA-NH2)、(OA-Hy ；順式-9-油酸酰基-N-羥酰胺；油酰-N-氫化環酰胺)，、{N-[ [ (4，5- 二氫-5-硫代-1，3，4_噻二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸甲酯}、{0-[[[4，5-二氫-5-硫代-1，3，4_噻二唑-2-基)氨基]羰基]氨基]-((2-吡啶基)哌嗪基-(S)-苯丙烷酰胺}、{(2R)-2-[(4-二苯磺酰)氨基]-3-苯丙酸}、{(2R)-[(4-二苯磺酰)氨基]-N-羥基-3-苯丙酰胺}、H-Cysl-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-CyslO-OH, (SB-3CT)、(Ac-RCGVPD-NH2 ;基質溶解素-1抑制劑)、[N-異丁基-N-(4-甲氧苯磺酰)_甘氨酰異羥肟酸；NNGH] {N-[[4，5-二氫-5-硫代-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸}、{a-[[[4，5-二氫-5-硫代-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基]_羰基]氨基]-N-(環己基甲基)-(S)-苯丙酰胺}、4_ 二苯呋喃2 φ -基-4-肟基-丁酸、[4- ( 4φ -聯苯)-4-肟基-丁酸]、{(3R)-(+)-[2-(4-甲氧基苯磺酰)-l，2，3，4-四氫異喹啉-3-異羥肟酸鹽]}、{(3S) - (-) -[2- (4-甲氧基苯磺酰)-1，2，3，4-四氫異喹啉3-異羥肟酸酯]}、[N-羥基-1-(4-甲氧苯基)磺酰-4-(4- 二苯羰基)哌嗪-2-羧酰胺]、[N-輕基-1-(4-甲氧苯基)磺酰-4芐氧羰基哌嗪-2-羧酰胺]、(1，10-二氮菲一水合物)、馬馬司他、普啉司他、坦諾司他、新伐司他、唑來膦酸或其組合。在一個具體實施方式
中，所述抑制劑是α 1-抗胰蛋白酶、α 1_抗胰凝乳蛋白酶、α 2-抗血纖維蛋白酶(在一個具體實施方式
中，其為纖維蛋白溶解作用的抑制劑)、抗纖維蛋白酶(在一個具體實施方式
中，其為血液凝固抑制劑，特別是因子X、因子IX和凝血酵素)、補體I抑制劑、神經絲氨酸蛋白酶抑制劑(Neuroserpin,在一個具體實施方式
中,其在一些家族形式的癡呆中發生突變)、纖溶酶原激活劑抑制劑I和2(在一個具體實施方式
中，其為纖維蛋白溶解作用抑制劑)、蛋白Z相關的蛋白酶抑制劑(ZPI，在一個具體實施方式
中是滅活因子Xa和因子XIa)或其組合。在另一個具體 實施方式中，所述蛋白酶抑制劑是亮肽酶素、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟化氫氯化物(AEBSF)、抑酞酶、抑糜酶素、抗纖維蛋白酶II1、3，4-二氯異香豆素、L-1-氯-3-[4-甲苯磺酰基-氨基]-7-氨基-2-庚酮-HCl (TLCK)、TPCK、氟磷酸異丙酯(DIFP)、抗痛素、4-脒基苯甲基磺酰-氟-HCl (APMSF)、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、3，4_ 二氯異香豆素(DCI)、α-對甲苯磺酰氟、BB94、α 2-巨球蛋白或其組合。在一個具體實施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是EDTA、釩、鑰酸鹽、1，10-二氮菲、磷酸阿米酮、抑氨肽酶素、抑氨肽酶素b、放線酰胺素、抑二肽素、BB94、α 2-巨球蛋白或其組
八
口 ο在一個具體實施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是N-己基順丁烯二酰亞胺、亮肽酶素、L-反式環氧-琥珀酰-亮氨酰-氨基-(4-胍基)_ 丁烷(Ε-64)、抑糜酶素、抗痛素、α 2-巨球蛋白、PMSF, PEFABL0C或其組合。在一個具體實施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是胃蛋白酶抑制劑Α、α 2-巨球蛋白、或其組合。在另一個具體實施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是ΒΒ94或巴馬司他，在一個具體實施方式
中，其為絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑。在一個具體實施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是可逆的，而在另一個具體實施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是不可逆的。在另一個具體實施方式
中，所述細胞可以用PKC抑制劑進行接觸，在一個具體實施方式
中，其為沙芬戈(L-蘇-二氫(神經)鞘氨醇)、Ro-U Ro32-0432 (雙吲哚馬來酰亞胺叔胺)、UCN-Ol (7-0H-十字孢堿)、Flavopiridol (L86-8275，一種黃酮類抗癌新藥)、苔蘚抑素I (大環內酯)、雙吲哚馬來酰亞胺1、InSolution 雙吲哚馬來酰亞胺1、氫氯化物、雙吲哚馬來酰亞胺I1、雙吲哚馬來酰亞胺II1、氫氯化物、雙吲哚馬來酰亞胺抑制劑Set、雙吲哚馬來酰亞胺IV、雙吲哚馬來酰亞胺V、鈣感光蛋白C、支孢樣支孢霉(Cladosporiumcladosporioides)、心臟毒素、黑頸眼鏡蛇(Naja nigricollis)、氯化白屈菜紅堿、地喹氯銨、逆沒食子酸、二水化物、G6976、InSolution G6976、G6983、G7874、氫氯化物、H-7、氟安定、Iso-H-7、氟安定、HBDDE> Hispidin、金絲桃蒽酮、K_252a、諾卡(氏)土壤菌屬(Nocardiopsis sp.)、InSolution K_252a、諾卡(氏)土壤菌屬(Nocardiopsis sp.)、K_252b、諾卡(氏)土壤菌屬(Nocardiopsis sp.)、K_252c、蜂毒素、NGIC-1、根皮素、云杉鞣酚、PKCbII/EGFR抑制劑、星孢菌素(staurosprorine)、N_苯甲酰PKCb抑制劑、硫酸多粘菌素B、蛋白激酶C抑制劑20-28、細胞可滲透的、豆蘧酰化、蛋白激酶C抑制劑肽19-31、蛋白激酶C抑制劑肽19-36、蛋白激酶C抑制劑組合、蛋白激酶C抑制劑、EGF-R片段651-658、豆蘧酰化、蛋白激酶(；易位抑制劑肽、蛋白激酶(；易位抑制劑肽、陰性對照、蛋白激酶Cz假底物抑制劑肽、蛋白激酶Cz假底物抑制劑肽、豆蘧酰化、蛋白激酶Ch假底物抑制劑肽、豆蘧酰化、蛋白激酶Cq假底物抑制劑肽、蛋白激酶Cq假底物抑制劑肽、豆蘧酰化、假金絲桃素、Ro31-7549,固定的，Ro-31-7549、Ro-31-8220、InSolution Ro-31-8220、Ro-31-8425、Ro-32-0432、楸毒素、沙芬戈、桑吉瓦霉素、Scytonemin( 一種色素)、林氏藻(Lyngbyasp.)、絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑組合、D-紅-神經鞘氨醇、二氫、D-紅-神經鞘氨醇、自由堿基、牛腦、D-紅-神經鞘氨醇、自由堿基、高純度、D-紅-神經鞘氨醇、N, N- 二甲基-、星孢菌素(staurosprorine)、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)、枸櫞酸他莫昔芬、他莫昔芬、4-羥基_、(Z-)、TER14687、琥珀酸維生素E或者能夠抑制蛋白激酶C表達的反義核苷酸。在一個具體實施方式
中，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶。在一個具體實施方式
中，半胱氨酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶、鈣蛋白酶和溶酶體組織蛋白酶。在一個具體實施方式
中，門冬氨酸 蛋白酶包括胃蛋白酶和凝乳酶。在一個具體實施方式
中，金屬蛋白酶包括嗜熱菌蛋白酶和羧肽酶A。在一個具體實施方式
中，根據本發明所述的組合物和/或方法可以包含使用如本文所述抑制劑的任何組合。在另一個具體實施方式
中，還可以用Tcfl蛋白或編碼所述Tcfl蛋白的核酸接觸所述細胞。在一個具體實施方式
中，所述Tcfl蛋白可以具有氨基酸序列，其同源于或就是NCBI’ s 基因庫中列出的序列，登陸號:CAI59577、P15257、P22361、P20823、NP_033353、NP_036801、NP_739570 或 NP_000536。在另一個具體實施方式
中，本發明提供了一種增加胰腺β細胞質量的方法，該方法包括用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑接觸β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞，其中所述細胞表達或經可誘導表達ΤΜΕΜ27，并提供利于β細胞增殖的條件。在另一個具體實施方式
中，本發明提供了一種改變患者體內新陳代謝的方法，所述方法包含用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞，其中所述細胞表達或可經誘導表達ΤΜΕΜ27。在另一個具體實施方式
中，本發明提供了一種抑制、遏制或治療患者糖尿病的方法，所述方法包括用ΤΜΕΜ27多肽或編碼所述ΤΜΕΜ27多肽的核酸接觸細胞，所述細胞是胰腺β細胞或者所述細胞可以經誘導變成胰腺β細胞。在另一個具體實施方式
中，本發明提供了一種抑制、遏制或治療患者糖尿病的方法，所述方法包括用一種蛋白酶抑制劑(用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑)接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞，其中所述細胞表達或可經誘導表達ΤΜΕΜ27。在一個具體實施方式
中，“治療”既指治療性療法又指預防性措施，其中目標是預防或減輕如上文中所描述的靶病理疾患或病癥。因此，在一個具體實施方式
中，治療可以包括遏制、抑制、預防、治療或其組合。因此，在一個具體實施方式
中，“治療”指的尤其是增加時間以持續進展、加快緩解、誘導緩解、促進緩解、加快恢復、增加替代治療的效果或降低對替代治療的耐受性，或其組合。在一個具體實施方式
中，“遏制”或“抑制”指的尤其是延緩癥狀出現、預防疾病復發、減少復發發作的次數或頻率、延長癥狀性發作之間的潛伏期、降低癥狀的嚴重程度、降低急性發作的嚴重程度、減少癥狀的數目、減少疾病相關癥狀的發生率、減少癥狀潛伏期、緩解癥狀、減少繼發癥狀、減少繼發感染、延長患者存活期，或其組合。在一個具體實施方式
中，癥狀是原發的，而在另一個具體實施方式
中，癥狀是繼發的。在一個具體實施方式
中，“原發”指的是作為糖尿病直接結果的癥狀，而在一個具體實施方式
中，“繼發”指的是癥狀起源于原發性原因或是原發性原因的結果。在一個具體實施方式
中，用于本發明中的化合物治療原發或繼發癥狀或者與糖尿病相關的繼發并發癥。在另一個具體實施方式
中，“癥狀”可以是`疾病或病理狀態的任何臨床表現，在一個具體實施方式
中，其是糖尿病，包括尿頻、過度口渴、劇烈饑餓、不尋常體重減輕、疲勞加重、易激惹、視力模糊、低胰島素水平、高血糖或高尿糖水平，或者其組合。在一個具體實施方式
中，術語“糖尿病”指的是一種原發性的哺乳動物患者的疾病，或者在另一個具體實施方式
中是指繼發性糖尿病，或者在另一個具體實施方式
中是指I型NIDDM-暫時，或者在另一個具體實施方式
中是指I型IDDM，或者在另一個具體實施方式
中是指2型IDDM-暫時，或者在另一個具體實施方式
中是指2型NIDDM，或者在另一個具體實施方式
中是指2型M0DY,其表現可能如在Harrison’s Internal Medicine, 14th ed.1998中所述的。根據本發明的這個方面，且在一個具體實施方式
中，所述患者是胰島素抵抗的，或者在另一個具體實施方式
中，所述患者是低胰島素血癥型。在另一個具體實施方式
中，所述患者易患糖尿病。在另一個具體實施方式
中，所述患者患有青春晚期糖尿病(MODY)。在另一個具體實施方式
中，作為組合治療的一部分，根據本發明所述的方法可以進一步包括將其他糖尿病藥劑給予所述患者的步驟。在一個具體實施方式
中，所述糖尿病藥劑可以包括磺酰脲類、瘦素(Ieptin，來普汀)、氯茴苯酸、雙胍、噻唑烷二酮類、α-糖苷酶抑制劑或其組合。在另一個具體實施方式
中，根據本發明所述的方法可以進一步包括給予患者GLP-1受體拮抗劑，或者在另一個具體實施方式
中，用GLP-1受體拮抗劑接觸患者體內的細胞。在一個具體實施方式
中，所述GLP-1拮抗劑可以包括天然存在的肽例如GLP-1、exendin-3和exendin-4(見例如美國專利第5，424，286號；美國專利第5，705，483號；美國專利第5，977，071號；美國專利第5，670，360號；美國專利第5，614，492號)、GLP-1類似物或變異體(見例如美國專利第5，545，618號和美國專利第5，981，488號)和小分子類似物。GLP-1受體拮抗劑可以如美國專利第5，981，488號中所述檢測其活性。在另一個具體實施方式
中，根據本發明所述的方法可以進一步包括rox-1或pyy，或者編碼PDX-1或PYY的核酸。應該理解本文中描述的關于本發明所述細胞、組合物、多肽、核酸或載體的任何具體實施方式
，均可以用于本發明所述的方法中，均可認為是本發明的具體實施方式
。在一個具體實施方式
中，本發明提供一種估計患者體內胰島質量的方法，所述方法包括確定所述患者血清中TMEM27濃度的步驟以及將該濃度與對照濃度進行比較的步驟。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種用于估計高胰島素血癥、血內胰島素不足、糖尿病或對用于上述病癥治療的療法的反應的診斷工具和/或方法。在一個具體實施方式
中，TMEM27作為生物標記物，其在特定體液(例如在血清、血漿或尿中)中的濃度是高胰島素血癥、血內胰島素不足或明顯(frank)糖尿病的函數。在一個具體實施方式
中，TMEM27的分泌形式是生物標記物。根據本發明的這個方面，且在一個具體實施方式
中，診斷方法可以是通過標準檢測法例如ELISA試驗確定TMEM27蛋白或其片段、分泌形式的水平。在一個具體實施方式
中，疾病嚴重性作為多肽表達的函數而診斷。在另一個具體實施方式
中，多肽表達的變化，無論是蛋白質還是RNA水平，可以是(在另一個具體實施方式
中)對治療(例如本文中提供的治療 方法)反應的函數。在另一個具體實施方式
中，表達的相對變化可以作為本發明所述核酸或載體遞送的函數，其可以代表本發明的一種療法。在一個具體實施方式
中，本發明所述的方法可以利用本發明的抗體或抗體片段、或者包含該抗體或抗體片段的組合物。一種含有本發明所述抗體、核酸、載體、細胞和/或組合物的試劑盒也包括在本發明之內。在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種用于鑒定與TMEM27蛋白或其分泌形式相互作用的蛋白的方法，所述方法包含一個步驟，即在足以促進所述多肽與所述感興趣分子之間特異性相互作用的條件下，用感興趣分子接觸TMEM27多肽一段時間以及鑒定所述感興趣分子。在一個具體實施方式
中，TMEM27可以作為激素發揮作用，一個相互作用蛋白可以包含對激素發生反應的未鑒定受體。在一個具體實施方式
中，所述相互作用蛋白可以包含與患者體內新陳代謝途徑有關的已知受體。在一個具體實施方式
中，這些篩查方法在本領域中是公知的，且可以包含在用于凝膠電泳的變性和非變性條件下、利用化學交聯劑或其他分子方法例如利用酵母2雜交系統時，直接或間接評估例如兩種分析之間的相互作用。應該理解，確定本發明所述TMEM27蛋白的相互作用蛋白的任何方法均可以實現，且認為是本發明的一部分，包括鑒定相互作用蛋白以及在本文描述的條件下鑒定這個相互作用蛋白的作用，例如積極的新陳代謝效應，例如其對于增強胰腺β細胞質量的效應，或在另一種具體實施方式
中，有害的新陳代謝效應，例如形成高胰島素血癥。接下來將提供材料、方法和實施例用于舉例說明目的，作為實施本發明的方式，而非出于限制的目的。實施例材料和方法:動物:所有的動物模型均在動物研究中心實驗室(Laboratory of Animal ResearchCenter, LARC, Rockefeller大學的一個無病原體動物實驗室)中飼養。所述動物均維持12小時的明/暗周期并用標準的嚙齒類動物食物飼養。在從3周齡的小鼠分離的DNA上通過PCR進行突變小鼠的基因型測定。抗體:對兩種肽:抗-Col-3:VQSAIRKNRNRINSAFFLD (SEQ ID NO:1)和抗-Co1-4:GIPCDPLDMKGGHINDGFLT(SEQ ID NO:2)進行合成并加工至純度> 90%，軛合于KLH，用于兔的免疫(Betyl實驗室，得克薩斯)。將抗血清進行親和力純化并通過western印記和免疫組織化進行檢測。親和力純化抗血清用于所有研究。其他用于免疫印記和免疫組織化的抗體從下列來源獲得:抗胰島素(Linco)、抗胰高血糖素(Linco)、抗-V5 (Invitrogen)、羅丹明紅軛合的驢抗幾內亞豬(Jackson實驗室)、愛力生(Alexa)488驢抗兔(MolecularProbes)。細胞培養將MIN6細胞用含有25mM葡萄糖、15%胎牛血清和5.5mM的2-巰基乙醇的DMEM培養基進行培養。INS-1 細胞用含有25mM葡萄糖、5%胎牛血清和IOmM Hepes pH7.4的RPMI1640進行培養。將H印G2細胞用含有25mM葡萄糖、10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養。瞬時轉染和螢蟲素酶分析在瞬時轉染中，用于H印G2細胞的Fugene試劑(Roche)以及用于MIN6細胞的Lipofectamine2000 (Invitrogen)根據生產商的指導而使用。每個35mm平皿中加入0.5 μ g的螢光素酶報告子構建體、表達載體和CMV-LacZ。通過相應的β半乳糖苷酶活性對螢光素酶的轉染效率進行標準化[AlamJ.，Cook, J.L.:Reporter genes:Application to thestudy of mammalian gene transcription.Anal.Biochem.188:245-254,1990]。為了得到螢光素酶構建體，將815bp的啟動子區域克隆于螢光素酶啟動子的上游，與Tcfl表達載體共表達。TMEM27啟動子序列(小鼠)如下:atgtcattgcacccaatgactttaacgctcagtccttggataccccacatgtgagacggttgtaaccactgtaaggatttgagaaataatcagggagcctagctcacagtaagtagttcttagtcattgttaaatagttgcgctgaacaatgttgtcactagcactgtgtagcaacttaactaaatgacaggttcttagcagttctagccccttttaaagggttagcattcatttcttcctagtggcaccaggacagagcactgttcagggaaggtatcaccatcaccatcaccatcaccatcgtcatcaccatcaccatcgtcatcacccaatgatcatcatctccagcgtgaggctttatatcattaatgttgagttttagacagtagccagatcttagagtttaacctagccatcctctagttgggaattgttaaccaaccaacagtctaggaagtcttgttccctttactctccagaggtgaaaaaggagttatatttgtttactaagtatggtagcctgtctttgaatcagattggttagcctgaaagggcacaaagattatgccaaagaaaactccatgctctccacgtttagcttaaccaaacaactacaggaggcaggtgggaggcttctgattgtgtcagctcaggaaacattcttatgaggtagagtttgaggaagaacccactaacctgcttctcaaatagattttcgtaaataactgacaggggatggttcgcttctatggacgtattaacccaactgatgggcgttaattattaaaccttttagatggtggctcgctgattt(SEQ ID NO:17).
此外，TMEM27啟動子的Tcfl位點選擇性突變，分別稱為Ml和M2啟動子序列，如下:TMEM27-M1啟動子序列(小鼠):atgtcattgcacccaatgactttaacgctcagtccttggataccccacatgtgagacggttgtaaccactgtaaggatttgagaaataatcagggagcctagctcacagtaagtagttcttagtcattgttaaatagttgcgctgaacaatgttgtcactagcactgtgtagcaacttaactaaatgacaggttcttagcagttctagccccttttaaagggttagcattcatttcttcctagtggcaccaggacagagcactgttcagggaaggtatcaccatcaccatcaccatcaccatcgtcatcaccatcaccatcgtcatcacccaatgatcatcatctccagcgtgaggctttatatcattaatgttgagttttagacagtagccagatcttagagtttaacctagccatcctctagttgggaattgttaaccaaccaacagtctaggaagtcttgttccctttactctccagaggtgaaaaaggagttatatttgtttcctaagtatggtagcctgtctttgaatcagattggttagcctgaaagggcacaaagattatgccaaagaaaactccatgctctccacgtttagcttaaccaaacaactacaggaggcaggtgggaggcttctgattgtgtcagctcaggaaacattcttatgaggtagagtttgaggaagaacccactaacctgcttctcaaatagattttcgtaaataacactgaggggatggttcgcttctatggacgtattaacccaactgatgggcgttaattattaaaccttttagatggtggctcgctgattt(SEQ ID NO:18)TMEM27-M2啟動子序列(小鼠):atgtcattgcacccaatgactttaacgctcagtccttggataccccacatgtgagacggttgtaaccactgtaaggatttgagaaataatcaggggagcctagctcacagtaagtagttcttagtcattgttaaatagttgcgctgaacaatgttgtcactagcactgtgtagcaacttaactaaatgacaggttcttagcagttctagccccttttaaagggttagcattcatttcttcctagtggcaccaggacagagcactgttcagggaaggtatcaccatcaccatcaccatcaccatcgtcatcaccatcaccatcgtccatcacccaatgatcatcatctccagcgtgaggctttatatcattaatgttgagttttagacagtagccagatcttagagtttaacctagccatcctctagttgggaattgttaaccaaccaacagtctaggaagtcttgttccctttactctccagaggtgaaaaaggagttatatttgtttcctaagtatggtagcctgtctttgaatcagattggttagcctgaaagggcacaaagattatgccaaagaaaactccatgctctccacgtttagcttaaccaaacaactacaggaggcaggtgggaggcttctgattgtgtcagctcaggaaacattcttatgaggtagagtttgaggaagaacccactaacctgcttctcaaatagattttcgtaaataactgacaggggatggttcgcttctatggacgtattaacccaactgatgggccaatattattaaaccttttagatggtggctcgctgattt(SEQ ID NO: 19).
細胞裂解物中的蛋白交聯當MIN6細胞在6孔板中生長至90%融合時，收集MIN6細胞并重懸于反應緩沖液和試劑中，體積50μ 1，4°C孵育2小時。通過加入50mM Tris pH7.4置于冰上10分鐘而終止反應。然后用PBS洗滌細胞，并在蛋白酶抑制劑存在的情況下在RIPA緩沖液中4°C裂解15分鐘。細胞裂解物以10，OOOx g離心5分鐘，對上清進行還原和非還原的SDS-PAGE隨后進行免疫印跡。交聯試劑和緩沖液:BMH(Pierce)溶解于DMSO中，并在PBS中孵育，而DTBP (Pierce)溶解于水中，并在0.2M三乙醇胺(pH8.0)中孵育。N-糖基化的抑制和酶切將表達pV5-TMEM27的MIN6細胞用溶解于DMSO的指定濃度的衣霉素(Sigma)以及單獨的DMSO在37°C孵育12 小時。隨后細胞裂解物進行SDS-PAGE并用抗V5抗體進行免疫印跡。用重組酶N聯聚糖酶(Prozyme，San Leandro，CA)將完整的N聯聚糖從TMEM27的分泌部分除去。MIN6細胞和胰島的上清在20mM磷酸鈉pH7.5,0.1 % SDS和50mM的β -巰基乙醇中通過100°C加熱5分鐘而變性。將NP-40加至終濃度0.75%，將反應混合物與N聯聚糖酶37°C孵育3小時。電泳遷移率變動分析(E M S A )和染色質免疫共沉淀(ChIP)在結合緩沖液(20mMHepes pH7.9、150mM NaClUmM DTT)中，對 IOyg 總細胞提取物進行EMSA分析。總細胞提取物與32P標記的雙鏈寡核苷酸探針一起孵育，所述探針在TMEM27啟動子上含有野生型或突變型HNF-1結合位點(序列分別為:5’ -GGAGATTTTCGTAAATAACTGACA-3’ (SEQ ID NO:3)、5’ -GGGCGTTAATTATTAAACCTTTTA-3’ (SEQ ID NO:4)和 5’ -GGGCAGAGATT A T TAAACCTTTTA-3’ (SEQ ID NO:5))。利用抗 Tcf-1 抗體(GenekaBiotechnology Inc.，Montreal, Canada)實施抗體膠移動(supershift)。利用來自 C57/B6小鼠或MIN6細胞的分離的原代肝細胞和ChIP分析試劑盒(Upstate Cell SignalingSolutions, Lake Placid, NY),按照生產商的流程進行ChIP分析。Tcfl與抗HNF-1 α抗體一起沉淀，且 DNA 利用引物 X 和 y (序列:5’ -ACAGGAGGCAGGTGGGAGGCTTCT-3’ ) (SEQ IDNO:6)和(5’ -CCCGGATTAGGGTATCGGAGAA-3’) (SEQ ID NO:7)來擴增。用于 apoM 的引物是5’ -GGGCTCAGCTTTCCTCCTA-3’ (SEQ ID NO:8)和 5’ -CTCCGCCTTAACTGTTCTCTGATG-3’ (SEQID NO:9)。總細胞提取物制備MIN6細胞在150mm組織培養皿中生長至90%融合。將細胞在冰冷卻的PBS中洗滌一次，并刮進3ml PBS中。將細胞4000x g離心4分鐘并重懸于2倍體積的高鹽提取緩沖液(400mM KCl、20mM Tris ρΗ7.5、20%甘油、2禮 DTTUX 完全 TM 蛋白酶抑制劑(BoehringerMannheim)和20 μ g/ml抑酞酶)中。細胞裂解通過凍融而實現，通過16，OOOx g于4°C離心10分鐘而除去細胞碎片。激素測定

利用酸乙醇(10%冰醋酸溶于無水乙醇中)從胰腺中提取胰島素和胰高血糖素，聲波處理10分鐘、12，OOOx g于4°C離心2次，每次10分鐘。收集上清并儲存于_20°C以便通過敏感的胰島素或胰高血糖素RIA試劑盒(Linco Research)測定胰島素。胰島和RNA的分離胰島從6-8周齡的小鼠上分離。我們利用膠原酶消化并通過葡聚糖梯度進行差速離心。隨后利用TRIzoI試劑(Gibco-BRL)根據生產商的說明提取總RNA。污染的基因組DNA根據每5 μ I的RNA利用I μ I無RNA酶的DNase-1 (即，胰脫氧核糖核酸酶)(Boehringer)而除去。胰島形態測定法將胰腺在低聚甲醛中固定，并如上所示進行胰島素和胰高血糖素的染色。切取貫穿整個胰腺的切片(7 μ m)，每第六張切片用作形態學分析。利用共聚焦激光掃描顯微鏡(Zeiss LSM510, Germany)掃描至少288張不重疊的圖像(像素尺寸為0.88 μ m)。在本研究中測定的參數利用Metamorph軟件包(Universal Imaging Corporation, PA)中的整合的形態學測定分析工具進行測定。由用胰島素或胰高血糖素染色的細胞所覆蓋的區域可利用大小大于3倍像素的著色物體進行整合。RT-PCR
利用TRIZOL 試劑(Invitrogen)提取總 RNA，并用 5U 無 RNA 酶的 DNase-1 (Ambion)處理IOyg的RNA。利用Moloney白血病病毒逆轉錄酶，用dNTP和隨機六聚體引物(Invitrogen)合成cDNA。如前所述,在[a -32p] dCTP和Taq聚合酶存在的情況下,cDNA提供利用特異引物的 PCR 的模板[Shih DQ, Screenan S,Munoz KN, Philipson L, Pontoglio M,Yaniv M,Polonsky KS,Stoffel Μ.(2001) Loss of HNF-1 alpha function in mice leadsto abnormal expression of genes involved in pancreatic islet development andmetabolism.Diabetes50:2472-80]。免疫印跡和免疫組織化學用SDS-PAGE (4-15% )分離細胞溶質蛋白提取物并利用電印跡將其轉移至硝基纖維膜(Schleicher&Schuell)上；用抗 Col3 和抗 Col4 血清(I: 500)檢測 TMEM27。將膜與第一抗體于4°C孵育過夜。含第二抗體的孵育液置于室溫I小時。通過從樣品緩沖液中去除DTT而實施非還原的SDS-PAGE。將MIN6細胞鋪于涂覆載玻片(Nalge Nunc Int.)上，并用4%的低聚甲醛于4°C固定20分鐘。載玻片在含3%正常驢血清的0.01%皂苷/PBS中室溫孵育30分鐘，加入抗Col3和抗Col4(l: 20)后，4°C過夜。加入第二抗體后，置于室溫30分鐘。將胰腺于4%低聚甲醛中4 °C固定4小時，并在石蠟中包埋。切取7 μ m切片，脫蠟后，通過將載玻片在0.0lM枸櫞酸鈉pH6.0進行微波處理而暴露抗原。將切片在0.1%Triton-X-1OO中進行透化處理，并在3%正常驢血清/PBS中孵育30分鐘。如上，染色完成。電鏡研究將Min6細胞在4%低聚甲醛和0.02%戊二醛/0.1M 二砷酸鹽緩沖液ρΗ7.4中固定2小時。所述細胞用PBS進行洗滌并在10%明膠中包埋，如上再次固定。細胞沉淀利用2.3Μ蔗糖溶液在PBS中進行冷凍保護，并將樣品儲存于液氮中直至使用(Tokuyasu，K.T.1973.J.Cell.Bi0.57-551-565)。在Reichert-Jung FC-4E冰凍超薄切片機中利用玻璃刀切取冷凍超薄切片。切片在聚乙烯醇縮甲醒-碳(Formvar-carbon)包被的鎳格上收集，用I %的BSA-PBS封閉并用抗Col4 (I: 10稀釋液)孵育。用PBS洗滌2次，每次15分鐘而終止孵育。隨后將切片與羊抗兔IgG —起孵育,所述IgG軛合于IOnm金顆粒(AmershamLife Science, Arlington Heights, IL)。對所述鎮格進行加工處理并按照 Griffiths etal.1983.Methods Enzymo1.96:466-485 進行染色。胸苷摻入研究將[3H]胸苷摻入在24孔培養板(5X104細胞/孔)中如下進行分析。電穿孔后48小時，將細胞在生長抑制培養基(0.5% FCS)中孵育24小時，隨后在正常生長培養基中再孵育24小時。在所述孵育過程的最后4個小時，加入0.25 μ Ci/孔的[3H]甲基胸苷(PerkinElmer)。孵育完成后，將細胞用冰預冷的PBS沖洗2次，并與10%三氯醋酸(TCA)于冰上孵育20分鐘。用10% TCA洗滌后，將細胞在0.2M NaOH/1 % SDS中室溫溶解10分鐘。TCA不溶性物質用0.2M HCl中和，并用液體閃爍計數器確定其反射性。RNA 干擾人工siRNA 由 Dharmacon Research (Lafayette, CO)合成。siRNA 針對小鼠TMEM27 (NM_020626)、PCI/3 (NM_013628)、PC2 (NM_008792)、弗林蛋白酶(NM_011046)和羧肽酶E(NM_013494)序列而設計。將3 μ g每一種siRNA/Ι X IO6細胞電穿孔入MIN6細胞內。
統計分析結果以均值土SD給出。利用學生氏t檢驗實施統計分析，在0.05的水平拒絕零假設。實施例1:Tcfl調控一種新蛋白在胰腺β細胞中的表達為了鑒定胰腺β細胞中的促有絲分裂因子，利用Affymetrix 寡核苷酸表達試驗比較分離的Tcfl+野生型同胞小鼠胰島中的基因表達。該試驗鑒定出一種編碼經膜跨膜蛋白(TMEM27)的基因，其表現出Tcfl+小鼠的表達水平相比于對照降低了 16倍。該結果在獨立組動物中通過RT-PCR得到了確認(圖1a)。為了研究Tcfl是否為TMEM27轉錄的直接激活劑，對TMEM27啟動子進行了分析，在其調控區鑒定了兩種保守的高親和力結合位點(圖lb)。人類上游調控區(SEQ ID NO:10)和小鼠上游調控區(SEQ ID NO:11)包含Tcf結合位點，起始于在人類和小鼠分別為約-117至約_102(SEQ ID NO:12和SEQ ID NO: 13)和-62 至約-47 (SEQ ID NO:14 和 SEQ ID NO:15)。將815bp的啟動子區域(SEQ ID NO: 17)克隆于螢光素酶啟動子的上游，與Tcfl表達載體共表達。Tcfl與TMEM27啟動子的瞬時共轉染引起螢光素酶活性5倍以上的激活(圖1c)。如果將TMEM27啟動子中的每一個Tcfl位點選擇性突變，則轉錄激活作用降低70-80% (圖lc)。凝膠電泳遷移率變動分析(EMSA)檢測DNA/蛋白復合物，該分析利用包含Tcf結合位點的雙鏈32P標記的寡核苷酸和MIN6細胞提取物(圖1d)。通過利用未標記寡核苷酸的競爭性分析以及進一步利用特異性抗Tcfl抗血清變動所述DNA-Tcf I復合物，而確定結合于這些位點的蛋白的特異性(圖1d)。為了確定Tcfl是否直接增加TMEM27的表達，進行了染色質免疫共沉淀(ChIP)。Tcfl結合于MIN6細胞的TMEM27啟動子中的結合位點，但在不表達TMEM27的肝細胞內則無結合(圖1e)。這些數據確定了體內Tcfl結合位點的功能性，表明Tcfl對于胰腺β細胞中ΤΜΕΜ27的表達是必需的。

實施例2:ΤΜΕΜ27表達在胰腺發育過程中受到調控免疫組織化學分析表示了小鼠胰腺發育過程中的ΤΜΕΜ27表達模式。在新生兒和成人胰腺中，ΤΜΕΜ27表達限于胰島的β細胞。在胰腺發育過程中，當激素(主要是胰高血糖素陽性細胞)表現出陽性時，ΤΜΕΜ27在最早期表達。在胚胎期的Ell.5和Ε12.5，ΤΜΕΜ27表達位于表達胰高血糖素和胰島素的細胞中。在內分泌細胞擴充的高峰期(從胚胎期13.5-18.5)，ΤΜΕΜ27主要與胰高血糖素共存，直至出生前(Ε18.5)，此時其在胰島素陽性細胞內也可檢測到。在新生兒和成人胰腺中，在胰島α細胞內不再能檢測到ΤΜΕΜ27，其表達局限于β細胞(圖2)。實施例3:ΤΜΕΜ27是一種N聯糖蛋白，在體內形成二聚體ΤΜΕΜ27包含兩種預測的N-糖基化位點，分別在氨基酸殘基76和93。用衣霉素處理ΜΙΝ6細胞，衣霉素抑制N-糖基化。細胞在衣霉素濃度不斷增高的條件下孵育，制備蛋白提取物并用SDS-PAGE和免疫印跡進行分析。用衣霉素處理后，出現兩條帶的電泳遷移率增大，而高分子量蛋白消失(圖3a)。該結果在體外分析中利用N-聚糖酶得到確認，N-聚糖酶是一種釋放完整N聯聚糖的酶。用Western印跡分析與該酶一起孵育的MIN6細胞提取物，表現出類似于衣霉素處理的結果(圖3b)。進行化學交聯試驗，檢測TMEM27蛋白是否以多聚體存在。MIN6細胞提取物在兩種不同交聯劑存在的情況下進行孵育:BMH(雙馬來酰亞胺己烷)，其是一種能透過膜的不可切割的化合物，以及DTBP( 二甲基3-3’二硫代丙酸鹽)，其是一種能透過膜、可在SDS-PAGE分析(在還原和非還原條件下實施)前被切割的化合物。非還原western印跡出現一條帶，正好為還原條件下western印跡中TMEM蛋白分子量的二倍。用BMH處理的細胞提取物在還原和非還原印跡中均表現為二聚體蛋白。然而，在DTBP存在時，還原條件下所述蛋白二聚體消失(圖3b)。該結果與內源性表達TMEM27的MIN6細胞以及由TMEM27表達載體瞬時轉染的N2A細胞中的結果類似(數據未示出)。綜上，這些數據表明所述TMEM27蛋白是N-糖基化的，且以二聚體存在。實施例4:TMEM27在胰腺β細胞中加工并從其分泌人們預測ΤΜΕΜ27是跨膜蛋白，具有N末端細胞外結構域。分別生成了兩種由該蛋白細胞外和細胞內結構域識別肽的抗體(a -Col-3和a -Col-4)。在western印跡試驗中，α -Co1-4在ΜΙΝ6細胞的總細胞裂解物中檢測到兩條帶(圖4a)。分子量較高的條帶對應于糖基化全長蛋白的預測分子量。較低條帶25kD)也是特異性的，因為其可以在用表達C末端V5-Tag融合蛋白和抗V5抗體的載體(p-TMEM27.V5-His)轉染后在細胞裂解物中用western印跡檢測到(圖4b)。為了確定該25kD條帶是否代表TMEM27切割形式的C末端部分，以及/或者其是否被分泌的，用a-Col-3抗體對來自不同細胞系(包括神經元N2A細胞、!fepG2細胞、Hek293細胞和起源于腎收集管并表現出TMEM27的內源性表達的M-1細胞)的上清進行了檢測。將細胞在無血清培養基中培養48小時 ,利用a-Col-3通過western印跡進行檢測,在同源β細胞系ΜΙΝ6和INSlE中檢測到 一條對應于 25kD蛋白的條帶(圖4c，數據未示出)。在與分離的小鼠胰島一起孵育的培養基中也檢測到公認的切割和分泌蛋白(圖4d)。有趣的是，盡管細胞裂解物中強表達全長蛋白，在用TMEM27表達載體(P-TMEM27)瞬時轉染的非β細胞系的培養基中，卻無法在western印跡分析中檢測到該條帶。相反，在MIN6和INSlE細胞中過表達TMEM27導致各自培養基中分泌蛋白的量增力口。siRNA介導的TMEM27蛋白水平降低與MIN6細胞上清中TMEM27的分泌形式水平下降有關系(圖4e)。最后，為了無可辯駁的證實TMEM27的N末端部分從β細胞切割并分泌，構建了一個表達載體(ΡΗΑ-ΤΜΕΜ27)，其中在ΤΜΕΜ27蛋白的氨基酸殘基39和40之間插入9個氨基酸的HA-抗原表位標簽，用該載體轉染的ΜΙΝ6細胞分泌一種蛋白，可用抗HA抗體檢測，大小類似于上清中的蛋白。該蛋白在對照細胞或在表達未加標簽蛋白的細胞中未被檢測到(圖4f)。綜上，這些數據表明TMEM27是一種β細胞特異的、切割的和分泌的跨膜蛋白。實施例5:ΤΜΕΜ27定位于胰島素分泌顆粒和細胞膜中采用抗Col-3和抗Col—4抗體的免疫熒光研究表明TMEM27定位于胰腺β細胞中。將ΜΙΝ6細胞在載玻片上培養、固定、透化并用第一抗體處理。可在細胞膜上以及核周區室和粒子內檢測到特異性染色(圖5a)。該結果與TMEM27定位于胰島素分泌粒子內以及通過這些小囊泡運輸至細胞膜相一致。使用免疫金標記的抗Col-4抗體的電鏡研究表明TMEM27定位于胰島素分泌顆粒內部(圖5b)。納米金(nanogold)顆粒與細胞膜相連,與小囊泡/膜融合事件相鄰(圖5c)，表明TMEM27是與胰島素分泌顆粒共定位的細胞膜蛋白。實施例6:0b/0b胰島中TMEM27表達增加以及體外β細胞復制增強評估ob/ob和aP2-Srebp_lc轉基因小鼠的肥大胰島中的TMEM27表達，以確定相比于對照的相對表達。分離6-8周齡小鼠的胰島，并與其野生型同胞小鼠胰島的基因表達水平加以比較。在半定量RT-PCR分析中，發現ob/ob和aP2-Srebp-lc胰島中TMEM27水平相比于對照值分別增加2.1倍和1.7倍(圖6a和6b)。此外，相比于野生型同胞小鼠的大小匹配的胰島，來自ob/obb和aP2_Srebp_lc小鼠的胰島分泌入培養基中的已切割TMEM27顯著增加(圖6c，數據未顯示)。為了確定TMEM27是否刺激胰腺β細胞復制，評估了ΤΜΕΜ27表達對ΜΙΝ6細胞復制的效應。細胞用質粒ρΤΜΕΜ27或靶向ΤΜΕΜ27的siRNA進行電穿孔。細胞復制則通過細胞計數及電穿孔后48h測定[3H]胸苷摻入來評估(圖6d-g)。相比于pcDNA3轉染的細胞，用pTMEM27轉染的MIN6細胞表現為約5倍過表達，并在平板接種(plating)后48小時，表現出[3H]胸苷摻入增加約3倍，且細胞密度增加(圖6e、g)。相反，在siRNA處理后，蛋白質表達降低的MIN6細胞表現出[3H]胸苷摻入和細胞密度的顯著降低(圖6d、f)。此外，未觀察到細胞中的凋亡隨TMEM27表達增高或降低而發生變化(數據未顯示)，表明其表達不影響細胞死亡。這些結果表明TMEM27調節MIN6細胞中的細胞增殖。實施例7:胰島中表達TMEM27的轉基因小鼠表現為胰`島肥大胰腺β細胞特異的轉基因小鼠通過原核微注射載體構建體而產生，該構建體中，鼠TMEM27cDNA處于鼠胰島素啟動子的控制之下。RT-PCR和免疫印跡分析表明相比于野生型同胞小鼠，轉基因小鼠中ΤΜΕΜ27的表達增加4倍(圖7Α)。通過胰島形態測定學研究8-12周齡轉基因動物的胰島質量。轉基因小鼠表現為胰島形態學正常(根據利用胰島素/胰高血糖素共染色的免疫組織化學)，但相比于野生型同胞小鼠，胰島質量增加約2倍(圖7Β和7C)。所述胰島質量的增加通過測定轉基因小鼠和野生型小鼠的總胰島素含量而進一步確證。在過表達ΤΜΕΜ27的轉基因小鼠中，總胰島素含量也顯著增加(圖7D)。空腹和餐后血漿葡萄糖和胰島素水平在轉基因和對照小鼠中相似，表明轉基因小鼠中的胰腺β細胞在葡萄糖感應方面并不具有較大異常(數據未顯示)。綜上，這些數據表明ΤΜΕΜ27在體內調節胰島生長。實施例8:ΒΒ94 抑制 ΤΜΕΜ27 脫落胰腺β細胞系ΜΙΝ6用含有25mM葡萄糖、15%胎牛血清和5.5 μ M2-巰基乙醇的DMEM培養基進行培養。將ΜΙΝ6細胞以50%融合鋪于12孔板中，孵育24小時。用OPT1-MEM(Invitrogen)洗滌細胞，并用DMSO或蛋白酶抑制劑ΒΒ94 (I μ Μ)在OPT1-MEM中于37 0C 孵育 15 分鐘。上述孵育后，用 DMSO、PMA (SigmaP8139)、BB94 或者 PMA+BB94 在 OPT1-MEM中孵育2小時。每一種上清均收集30 μ I用于SDS-PAGE。用識別ΤΜΕΜ27Ν末端(已切割部分)的抗ΤΜΕΜ27抗體實施免疫印跡(圖8)。利用抗V5抗體(其識別ΤΜΕΜ27的C末端(細胞內)部分)的免疫印跡用作對照，表明PMA和BB94不改變TMEM27的表達水平(圖8)。BB94 (而非PMA)降低TMEM27N末端的表達水平(圖8)，但不改變TMEM27C末端的表達水平。因為BB94是一種已知的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的抑制劑，這可以表明TMEM27是一種屬于絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶家族的蛋白酶的底物。盡管本文中已經舉例說明并描述了本發明的某些特征，對于本領域中的普通技術人員來說，還可以進行多種變化、替代、改變和等同。因此，應該理解附加的權利要求涵蓋所有這些落入本發明真實 精神的改變和變化。
權利要求
1.一種增加胰腺β細胞質量的方法，所述方法包括用絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶抑制劑接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞，其中所述細胞表達或可經誘導表達ΤΜΕΜ27，并提供利于β細胞增殖的條件。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是ΒΒ94、(H0NH-C0CH2CH2C0-FA-NH2)、(ΟΑ-Hy;順式-9-油酸酰基-N-羥酰胺；油酰-N-氫化環酰胺)、{Ν_[ [ (4，5- 二氫-5-硫代-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸甲酯}、{ α - [[[4，5- 二氫-5-硫代-1，3, 4_噻二唑-2-基)氨基]擬基]氨基]-((2_卩比唳基)哌嗪基—(S)-苯丙烷酰胺}、{(2R) -2- [ (4- 二苯磺酰)氨基]-3-苯丙酸}、{(2R) - [ (4- 二苯橫酸)氨基]-Ν_ 輕基-3-苯丙酸胺} 'H-Cysl-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys10-0H、(SB-3CT)、(Ac-RCGVPD-NH2;基質溶解素-1 抑制劑)、[N-異丁基-N-(4-甲氧苯磺酰)-甘氨酰異羥肟酸；NNGH] {N- [ [4，5- 二氫-5-硫代-1，3，4-噻二唑_2_基)氨基]-羰基]-L-苯丙氨酸}、{a- [ [ [4，5- 二氫-5-硫代-1，3，4-噻二唑_2_基)氨基]-羰基]]氨基]-N-(環己基甲基)-⑶-苯丙酰胺、4-二苯呋喃-2φ-基-4-肟基-丁酸、[4-(4φ-聯苯基)-4-肟基-丁酸]、{(3R)-(+)-[2-(4-甲氧基苯磺酰)-1,2, 3，4-四氫異喹啉3-異羥肟酸酯]}、{(3S) - (-) - [2- (4-甲氧基苯磺酰)-1，2，3，4-四氫異喹啉3-異羥肟酸酯]}、[N-羥基-1- (4-甲氧苯基)磺酰-4- (4-聯苯羰基)哌嗪-2-羧酰胺]、[N-羥基-1- (4-甲氧苯基)磺酰-4-芐氧羰基哌嗪-2-羧酰胺]、(1，10-二氮菲一水合物)、馬馬司他、普啉司他、坦諾司他、新伐司他、唑來膦酸，或其組合。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94。
4.一種改變患者體內新陳代謝的方法，所述方法包括用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制劑接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞，其中所述細胞表達或可經誘導表達ΤΜΕΜ27。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是ΒΒ94、(H0NH-C0CH2CH2C0-FA-NH2)、(ΟΑ-Hy;順式-9-油酸酰基-N-羥酰胺；油酰-N-氫化環酰胺)、{Ν_[ [ (4，5- 二氫-5-硫代-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸甲酯}、{ α _[[[4, 5- 二氫-5-硫代-1，3, 4-噻二唑-2-基)氨基]擬基]氨基]-((2_卩比唳)哌嗪基_⑶-苯丙燒酰胺1、{(2R) -2-[ (4- 二苯磺酉先)氨基]-3_苯丙酸}、{(2R) -[ (4- 二苯橫酸)氨基]-Ν_ 輕基-3-苯丙酸胺}、H-Cysl-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cysl0-0Η、(SB-3CT)、(Ac-RCGVPD-NH2;基質溶解素-1 抑制劑)、[N-異丁基-N-(4-甲氧苯磺酰)-甘氨酰異羥肟酸；NNGH] {N- [ [4，5- 二氫-5-硫代-1，3，4-噻二唑_2_基)氨基]-羰基]-L-苯丙氨酸}、{a- [ [ [4，5- 二氫-5-硫代-1，3，4-噻二唑_2_基)氨基]-羰基]]氨基]-N-(環己基甲基)-(S)-苯丙酰胺、4-二苯呋喃-2 Cp-基-4-肟基-丁酸、[4-(4φ聯苯基)-4-肟基-丁酸]、{(3R) - (+) - [2- (4-甲氧基苯磺酰)-1，2，3，4-四氫異喹啉3-異羥肟酸酯]}、{(3S) - (-) - [2- (4-甲氧基苯磺酰)-1，2，3，4-四氫異喹啉_3_異羥肟酸酯]}、[N-羥基-1- (4-甲氧苯基)磺酰-4- (4- 二苯羰基)哌嗪-2-羧酰胺]、[N-羥基-1- (4-甲氧苯基)磺酰-4芐氧羰基哌嗪-2-羧酰胺]、(1，10- 二氮菲一水合物)、馬馬司他、普啉司他、坦諾司他、新伐司他、唑來膦酸，或其組合。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是ΒΒ94。
7.一種抑制、遏制或治療患者糖尿病的方法，所述方法包括用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制劑接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞，其中所述細胞表達或可經誘導表達ΤΜΕΜ27。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是ΒΒ94或其組合。
9.根據 權利要求8所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是ΒΒ94。
全文摘要
本發明涉及胰腺β細胞增殖的刺激。本發明涉及一種增加胰腺β細胞質量的方法，所述方法包括用絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶抑制劑接觸胰腺β細胞或可經誘導變成胰腺β細胞的細胞，其中所述細胞表達或可經誘導表達TMEM27，并提供利于β細胞增殖的條件。本發明提供一種多肽TMEM27及其分泌形式、編碼該多肽的核酸和構建體以及包含該核酸和構建體的細胞。所述TMEM27蛋白在胰腺發育早期階段的激素陽性細胞和成熟胰腺中的胰腺β細胞內表達，其表達促進胰腺β細胞復制和胰島質量增加。本申請中還描述了該蛋白在診斷學和治療學中的應用。
文檔編號C12N5/071GK103173402SQ20131004466
公開日2013年6月26日 申請日期2006年6月7日 優先權日2005年6月7日
發明者馬庫斯·施托費爾, 皮納爾·阿克珀納爾 申請人:洛克菲勒大學