專利名稱：用于同時(shí)檢測(cè)沙門菌枸櫞菌變形菌和愛德華菌的多重pcr引物及其設(shè)計(jì)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的檢測(cè)，尤其是涉及一種用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物及其設(shè)計(jì)方法。
背景技術(shù)：
沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌、遲緩愛德華菌均屬于腸桿菌科，可通過食物、傷口傳播。除了引起食物中毒還能引起人和動(dòng)物機(jī)體的多系統(tǒng)感染。沙門氏菌為腸桿菌 科細(xì)菌較早的成員，具有呼吸和發(fā)酵兩種代謝類型，存在于溫血及冷血?jiǎng)游矬w內(nèi)、食物和環(huán)境中，是一種常見的病原菌，可以引起傷寒、腸傷寒、胃腸炎和敗血癥等相關(guān)疾病。沙門菌的血清型很多，給鑒定帶來(lái)很大困難。沙門菌在自然界分布比較廣泛，在外界環(huán)境中能生存較久，在水和土壤中能生存數(shù)周到數(shù)月，在冰庫(kù)中甚至能存活半年以上。近年來(lái)，由于抗生素的濫用，該菌對(duì)氯霉素的耐藥菌株明顯增多，有的菌株對(duì)慶大霉素、卡那霉素、氨芐青霉素等也耐藥，這使得食品安全中對(duì)該菌的檢測(cè)投入了大量的人力物力。弗氏枸櫞酸桿菌，也被稱為弗氏朽1檬酸桿菌。曾被歸于埃希菌屬。朽1檬酸桿菌屬的細(xì)菌，具有如腸桿菌科的菌體、表面和鞭毛的相應(yīng)抗原，有研究表明，朽1檬酸桿菌中許多血清型的抗原與沙門菌屬和埃希菌屬的抗原有關(guān)，這個(gè)也給常規(guī)鑒定帶來(lái)了一定困難。弗氏枸櫞酸桿菌在自然界廣泛分布，是人和多種動(dòng)物包括哺乳類、鳥類、爬行類和兩棲類的腸道常在菌，常見于糞便和被糞便污染的地方，也常見于土壤、水體和食物中，所以該菌也列在了大腸菌群。作為環(huán)境和食品等的糞源污染的衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)指標(biāo)。該屬的細(xì)菌作為人的條件致病菌，看在社區(qū)或者醫(yī)院內(nèi)發(fā)生感染，大多數(shù)感染部位是尿路和呼吸道，還可引起敗血癥、腦膜炎、骨髓炎、中耳炎及心內(nèi)膜炎，在一定的數(shù)量下，還能引起食物中毒。對(duì)動(dòng)物的致病性有明確記述的主要是魚類，最近也有甲殼類和爬行類感染的報(bào)道，死亡率較高，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖影響不小，當(dāng)前分子生物學(xué)鑒定還局限于對(duì)該菌的16SrRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，時(shí)間周期太長(zhǎng)，無(wú)法應(yīng)用于日常監(jiān)測(cè)和檢測(cè)。奇異變形桿菌亦被稱作奇異桿菌，是變形桿菌屬中較早的成員，對(duì)人類可引起原發(fā)性或繼發(fā)性感染，也可以導(dǎo)致人類食物中毒，對(duì)動(dòng)物也有致病作用。該屬的細(xì)菌廣泛存在于自然界中，尤其以奇異變形桿菌更為常見，它是一種已被確定的病原菌，或是單獨(dú)或是與其他病原菌混合感染引起人的不同類型感染癥，也是人尿路感染的一種主要病原，有的菌株還引起食物中毒，在呼吸道、消化道以及燒傷創(chuàng)面感染中的檢出率也不斷增加，是一種常見的醫(yī)院感染菌。最重要的是，奇異變形桿菌能產(chǎn)生耐熱腸毒素，引起相應(yīng)的胃腸炎性食物中毒。遲緩愛德華菌在試愛德華均屬細(xì)菌中最早的成員，該菌能在特定條件下引起人的多種類型感染，也是魚類常見的病原細(xì)菌，廣泛存在于自然界中，此菌多從腹瀉病人的糞便中分離到，而在健康人群的糞便中是極少分離到的。遲緩愛德華菌還能引起人的腦膜炎、腹膜炎、菌血癥、敗血癥、皮膚軟組織感染，發(fā)生腸道感染的臨床表現(xiàn)類似沙門氏菌，雖然該菌被認(rèn)定為人、魚共染病原菌，但是主要發(fā)生在魚類，甲殼類也是常見宿主，對(duì)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大影響。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)沙門菌的檢測(cè)已經(jīng)有了相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，分為以下幾個(gè)過程:⑴前增菌；(2)選擇性增菌；(3)選擇性培養(yǎng)；(4)生化鑒定；(5)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。但國(guó)標(biāo)方法步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，重復(fù)性不好，且弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的檢測(cè)還沒有建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可靠、的檢測(cè)方法同時(shí)適用于這四種的檢測(cè)，彌補(bǔ)目前檢測(cè)方法的不足尤為重要。多重PCR技術(shù)的應(yīng)用，可大大減少檢測(cè)成本，可大大減少工作量，適應(yīng)于口岸快速檢測(cè)的需要，是一種準(zhǔn)確、可靠、科學(xué)的分子生物學(xué)方法。有鑒于此，盡快開發(fā)一種用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR勢(shì)在必行。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,簡(jiǎn)稱PCR)是一種體外快速擴(kuò)增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時(shí)內(nèi)可使目的基因片段擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)個(gè)拷貝的分子生物學(xué)技術(shù)。一個(gè)反應(yīng)常有25 35個(gè)循環(huán)，一個(gè)循環(huán)包含3個(gè)步驟，首先使模板DNA雙鏈在94 95°C變性為單鏈，然后在較低溫度下，使引物與模板結(jié)合，接著在引物的引導(dǎo)及Taq酶的作用下，于72°C合成模板DNA互補(bǔ)鏈。可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。一般PCR僅應(yīng)用一對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段。多重PCR，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一 PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑盒操作過程與一般PCR相同。多重PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上加以改造，于一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加多對(duì)特異性引物，針對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)。多重PCR在一次反應(yīng)中就能同時(shí)擴(kuò)增一個(gè)基因的多個(gè)靶序列。多重 PCR 最先是在 1988 年就被 Chamberlain (Chamberlain JS.Deletion screeningof the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[J].Nucleic Acids Research，1988，16:11141-11156)所提出，在這短短 22 個(gè)年頭之內(nèi)，它已經(jīng)在DNA檢測(cè)的多個(gè)領(lǐng)域得到成功的應(yīng)用。具體包括檢測(cè)基因突變、缺失等多態(tài)，定量PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR。Henegariu在1997年設(shè)計(jì)出了多重PCR步步優(yōu)化協(xié)議，指導(dǎo)怎樣多重PCR的反應(yīng)體系。但是多重PCR最大的問題還是存在于引物的設(shè)計(jì)上。和一般PCR相比較，多重PCR在同一 PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)病原的基因片段，一次完成多個(gè)模板的擴(kuò)增。多重PCR的系統(tǒng)性主要體現(xiàn)在它能夠根據(jù)需求一次性擴(kuò)增出所有的相關(guān)基因，將大大節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。多重PCR檢測(cè)技術(shù)在一次反應(yīng)中就能同時(shí)擴(kuò)增一個(gè)模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)。以其快速、高效，特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)，在食品病原微生物、非致病微生物及環(huán)境微生物檢測(cè)中具有重要作用；但多重PCR在提高食品微生物檢測(cè)靈敏度、去除食品抑制因子的干擾，提高衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)及加強(qiáng)技術(shù)人員水平上仍有許多問題需要解決。多重PCR改進(jìn)技術(shù)簡(jiǎn)化了食品微 生物檢測(cè)過程、縮短檢測(cè)時(shí)間、降低檢測(cè)成本同時(shí)提高了食品微生物檢測(cè)的靈敏度；但是多重PCR的改進(jìn)技術(shù)也存在一定問題。未來(lái)的研究主要集中在改進(jìn)樣品前處理技術(shù)、去除食品抑制因子干擾，其次是多重PCR與其它技術(shù)的整合應(yīng)用，如多重PCR與變性梯度凝膠電泳、基因芯片、熒光探針定量技術(shù)、免疫磁珠吸附等技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，進(jìn)一步提高食品微生物檢測(cè)的靈敏度、可重復(fù)性，實(shí)現(xiàn)大批量食品檢測(cè)、復(fù)雜樣品基質(zhì)中的多種微生物的有效檢測(cè)、食品微生物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，必將在未來(lái)食品微生物檢測(cè)中有非常好的應(yīng)用前景。PCR是一種模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程的技術(shù)，由于具有快速、特異和敏感等特點(diǎn)，近年來(lái)在豬病診斷上得到廣泛應(yīng)用。多重PCR是一種特殊PCR形式，比單一 PCR反應(yīng)更快捷、更節(jié)約，其最突出的特點(diǎn)，即一次PCR反應(yīng)，可同時(shí)檢測(cè)、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和很高的使用價(jià)值。多重PCR技術(shù)的應(yīng)用，可大大減少檢測(cè)成本，可大大減少工作量，適應(yīng)于口岸快速檢測(cè)的需要，是一種準(zhǔn)確、可靠、科學(xué)的分子生物學(xué)方法。有鑒于此，盡快開發(fā)一種用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR勢(shì)在必行。這對(duì)于加強(qiáng)進(jìn)出口水產(chǎn)品中弧菌的快速檢驗(yàn)檢疫、水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的調(diào)查和防治、無(wú)公害水產(chǎn)品檢測(cè)和生產(chǎn)以及水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)等方面都具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決快速檢測(cè)進(jìn)出口水生動(dòng)物及其產(chǎn)品中的沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌，提供一種用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物及其設(shè)計(jì)方法，所述用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物在同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的應(yīng)用中具有簡(jiǎn)單、靈敏、快速、特異的優(yōu)點(diǎn)。所述用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物為:
S.spp.Fl:5，-GCCGGTAAACTACACGATGA-3，；S.spp.Rl:5，-GAGTTACTGAACCAACAGCT-3，；C.freu.Fl:5’ -AACATAGCGATGGACAACTGA-3’ ；C.freu.Rl:5，-TTAGCAAAAATTTAAGCCGGT-3，；P.mira.Fl:5’ -TTTATCAATAGCCTCAAACCCT-3’ ；P.mira.Rl:5，-TGCGTCACCCTCTAACTCATCC-3，；E.tarda.Fl:5’ -CTGGGCAAGTATCCGACCTC-3’ ；E.tarda.Rl:5’ -GGTAACCGTATCGGCGTAAG-3’。其中，S.spp.為沙門氏菌的英文縮寫，C.freu.為弗氏枸櫞酸桿菌的英文縮寫，P.mira.為奇異變形桿菌的英文縮寫，E.tarda.為遲緩愛德華菌的英文縮寫；S.spp.Fl和S.spp.Rl為根據(jù)沙門氏菌FimA基因設(shè)計(jì)的上游引物Fl和下游引物Rl ；C.freu.Fl和C.freu.Rl為根據(jù)弗氏枸櫞酸桿菌Idh基因設(shè)計(jì)的上游引物Fl和下游引物Rl; P.mira.Fl和P.mira.Rl為根據(jù)奇異變形桿菌IdsC基因設(shè)計(jì)的上游引物Fl和下游引物Rl ；E.tarda.Fl和E.tarda.Rl為根據(jù)遲緩愛德華菌FimA基因設(shè)計(jì)的上游引物Fl和下游引物Rl ;所述沙門氏菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為526bp，弗氏枸櫞酸桿菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為161bp，奇異變形桿菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為396bp，遲緩愛德華菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為330bp。所述用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物的設(shè)計(jì)方法，包括以下步驟:步驟1，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數(shù)為20 24個(gè)，引物組合的熔解溫度Tm值為52 62°C，引物組合的GC%為40% 60% ；步驟2，對(duì)引物組合中的引物進(jìn)行篩選，保留不能合成引物二聚體的引物；步驟3，判斷所保留引物的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)劣狀態(tài)，將步驟2所述保留不能合成引物二聚體的引物的GC%和堿基數(shù)進(jìn)行比較，選取GC含量高的判斷為競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)優(yōu)勢(shì)引物，進(jìn)行步驟5 ；否則判斷為競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)劣勢(shì)引物，進(jìn)行步驟4 ；

步驟4，再次篩選競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)劣的引物，具體步驟為:重復(fù)步驟2，對(duì)所保留的引物按照步驟3進(jìn)行再次判斷； 步驟5，利用PCR方法對(duì)競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)優(yōu)弓I物進(jìn)行擴(kuò)增。在步驟I中，所述所用的引物設(shè)計(jì)軟件為Primer Premier5.0,所述多重PCR引物組合的熔解溫度Tm值為60°C。在步驟2中，所述對(duì)引物組合中的引物進(jìn)行篩選的具體步驟可為:對(duì)所用的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選擴(kuò)增效果最好的引物組合；所述不能形成引物二聚體的引物的堿基數(shù)目為20 24。在步驟5中，所述PCR方法的變性溫度可94°C，退火溫度可為60°C，延伸溫度可72。。。本發(fā)明的有益效果如下:采用本發(fā)明建立的多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的方法，具有操作簡(jiǎn)便、快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，只需一個(gè)PCR反應(yīng)就可同時(shí)檢測(cè)出沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌，通過應(yīng)用該方法對(duì)肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品等50份樣品的檢測(cè)，同時(shí)與常規(guī)方法檢測(cè)進(jìn)行比較。多重PCR方法檢測(cè)出I份沙門氏菌陽(yáng)性，與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果完全吻合。本發(fā)明可大大加快沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的檢測(cè)。采用本發(fā)明多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的方法，具有簡(jiǎn)單、靈敏、快速、特異等優(yōu)點(diǎn)，在食品衛(wèi)生安全、公共衛(wèi)生安全及口岸衛(wèi)生檢疫中都有重要意義。可應(yīng)用于日常食品中四種細(xì)菌的快速檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用于口岸部門進(jìn)出口食品中四種細(xì)菌的快速驗(yàn)放以及突發(fā)食物中毒事件的應(yīng)急反應(yīng)。目前未見國(guó)內(nèi)外利用該技術(shù)檢測(cè)食品中沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的報(bào)道。該技術(shù)可用于食品中這4種細(xì)菌的污染情況調(diào)查，可有效預(yù)防和控制相關(guān)食源性疾病的發(fā)生，有助于建設(shè)食品安全檢測(cè)與食品安全監(jiān)管，打造食品“放心工程”，有利于快速查找食品安全中毒事件的原因，符合科技發(fā)展規(guī)劃倡導(dǎo)的食品質(zhì)量與安全控制精神，讓人們吃上健康食物，建設(shè)和諧社會(huì)。


圖1為多重PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化。在圖1中，M，DL1500 ；I, 58°C ;2，59°C ;3，60°C ；4,61°C ；5,62°C ；6,63°C ；7,64°C ;8，65°C。圖2 為多重 PCR 引物體積優(yōu)化。在圖 2 中，M，DL1500 ;l，0.8yL;2，1.0yL;3，1.2yL;4,1.4yL;5,1.6yL;6,1.8yL;7,2.0yL;8,2.2yL。圖3為多重PCR反應(yīng)鎂離子優(yōu)化。在圖3中，M，DL1500 ;1，1.25μ L ;2，1.5μ L ;3，1.75yL;4,2.0yL;5,2.5yL。圖4 為多重 PCR 體系 dNTP 優(yōu)化。在圖 4 中，M，DL1500 ;1，1.0 μ L ;2，1.5 μ L ;3，2.0yL;4，2.5yL;5，3.0yL;6，3.5yL。圖5為多重PCR體系靈敏度試驗(yàn)。在圖5中，M，DL1500 ；1:陰性對(duì)照；2 6:模
板核酸IO1 IO6倍稀釋。圖6為多重PCR引物特異性試驗(yàn)。在圖6中，M，DL1500 ;1，沙門氏菌；2，弗氏枸櫞酸桿菌；3，奇異變形桿菌；4，遲緩愛德華菌；5，綠膿桿菌；6:大腸桿菌；7，溶藻弧菌；8，副溶血弧菌；9，陰溝腸桿菌。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但附圖和具體實(shí)施例不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的限定。所述用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物的設(shè)計(jì)方法，包括以下步驟:a)利用Pr imer Premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)同時(shí)擴(kuò)增沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重引物組合；b)篩選多重引物組合中PCR檢測(cè)沙門氏菌的引物；c)篩選多重引物組合中PCR檢測(cè)弗氏枸櫞酸桿菌的引物；d)篩選多重引物組合中PCR檢測(cè)奇異變形桿菌的引物；e)篩選多重引物組合中PCR檢測(cè)遲緩愛德華菌的引物f)篩選多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的引物組合。在步驟a)中，所涉及的引物為參照GenBank上發(fā)表(S.spp.FimA為GenBankM18283, C.freu.1dh 為 GenBank DQ991236.1,P.mira.1dsC 為 GenBank EU635876, E.tarda.FimA為GenBank AF491964)的沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的基因序列，應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)的同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的特異性引物組合。在步驟b)、c)、d)和e)中，經(jīng)過篩選，得出沙門氏菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為526bp，弗氏枸櫞酸桿菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為161bp，奇異變形桿菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為396bp，遲緩愛德華菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為330bp ;具體引物序列如下:S.spp.Fl:5，-GCCGGTAAACTACACGATGA-3，；S.spp.Rl:5，-GAGTTACTGAACCAACAGCT-3，；C.freu.Fl:5，-AACATAGCGATGGACAACTGA-3，；C.freu.Rl:5’ -TTAGCAAAAATTTAAGCCGGT-3’ ；
P.mira.Fl:5，-TTTATCAATAGCCTCAAACCCT-3，；P.mira.Rl:5，-TGCGTCACCCTCTAACTCATCC-3，；E.tarda.Fl:5，-CTGGGCAAGTATCCGACCTC-3，；E.tarda.Rl:5，-GGTAACCGTATCGGCGTAAG-3，。在步驟f)中，多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌方法最佳反應(yīng)條件的測(cè)定，分別利用4對(duì)引物進(jìn)行4種細(xì)菌多重PCR方法最佳退火溫度、引物濃度、dNTP濃度、Mg2+濃度、模板濃度等的測(cè)定，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重PCR方法最佳循環(huán)次數(shù)的測(cè)定；多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌方法的反應(yīng)體系為12.5 μ L，具體如下:10XPCR Bufferl.25 μ L,25mmol/L MgCl22 μ L, IOmmoI/L dNTP2.5 μ L，20 μ mol/L的四種細(xì)菌的上下游引物混合物添加量依次為沙門氏菌0.72 μ L，弗氏枸櫞酸桿菌0.21 μ L，奇異變形桿菌0.21 μ L，遲緩愛德華菌 0.54 μ L, 5u/ μ L Taq 酶 0.075 μ L, ddH200.995 μ L，4 種細(xì)菌的 DNA 模板各 I μ L。擴(kuò)增條件為 94°C 4min ；94°C 35s, 60°C 40s, 72°C 40s35 循環(huán)；72°C 7min。1、摸索細(xì)菌模板提取方法參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》采用傳統(tǒng)方法(酚-氯仿提取法)、直接菌體加入法、反復(fù)凍融法、熱裂解法和試劑盒提取法5種方法分別對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行提取，并將提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，選出最佳提取方法。其中試劑盒提取法、熱裂解法和傳統(tǒng)提取法提取效果相同，并且在這5種提取方法中，這3種提取方法效果較好。但是傳統(tǒng)方法操作較為煩瑣，熱裂解法提取的DNA純度太低，因此最終選擇試劑盒提取法為最佳提取方法。2、多重PCR —步法技術(shù)同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌方法的建立將沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌菌株分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，按商業(yè)化試劑盒提取法制備菌體DNA模板溶液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為 12.5 μ L，具體如下:10XPCR Bufferl.25 μ L, 25mmol/L MgCl22 μ L,10mmol/LdNTP2.5 μ L, 20 μ mol/L的四種細(xì)菌的上下游引物混合物添加量依次為沙門氏菌
0.72 μ L，弗氏枸櫞酸桿菌0.21 μ L，奇異變形桿菌0.21 μ L，遲緩愛德華菌0.54 μ L，5u/ μ LTaq 酶 0.075 μ L，ddH200.995 μ L，4 種細(xì)菌的 DNA 模板各 I μ L。擴(kuò)增條件為 94°C 4min ；94°C 35s, 60°C 40s, 72°C 40s35 循環(huán)；72°C 7min。取 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 5 μ L 進(jìn)行瓊脂糖(3%)電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。3、多重PCR—步法最佳反應(yīng)條件的摸索分別利用4對(duì)引物進(jìn)行4種細(xì)菌多重PCR方法最佳退火溫度、引物濃度、dNTP濃度、Mg2+濃度的測(cè)定，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重PCR方法最佳循環(huán)次數(shù)的測(cè)定。結(jié)果測(cè)得多重PCR—步法，退火溫度以60°C最佳，見圖1 ;引物加入梯度為0.8 μ L、l.0 μ L、l.2 μ L、l.4 μ L、l.6 μ L、l.8 μ L、2.0 μ L、
2.2 μ L，最終確定各引物組分濃度如下:沙門氏菌上下游引物添加量為0.72 μ L ;弗氏枸櫞酸桿菌上下游引物添加量為0.2 1 μ L ;奇異變形桿菌上下游引物添加量為0.21 μ L ;遲緩愛德華菌上下游引物添加量為0.54 μ L，見圖2 ;多重PCR—步法鎂離子濃度為在12.5μ L的反應(yīng)體系中，設(shè)計(jì)25mM Mg2+梯度為1.25、1.5、1.75,2.0、2.25 μ L通過比較，最終選擇2.0 μ L為最佳添加量，見圖3 ；2.5mmol/L dNTP 的劑量 25mM Mg2+梯度為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μ L，最終選
擇2.5 μ L作為最佳添加量，見圖4。4、多重PCR—步法靈敏度檢測(cè)取37°C培養(yǎng)18h的沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌菌液做10倍梯度稀釋，稀釋至10_7，各稀釋度菌液平板計(jì)數(shù)參照國(guó)標(biāo)法(GB/T4789.2-2003)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，四種目的菌的個(gè)數(shù)為沙門氏菌:8.9X108cfU/ml，弗氏枸櫞酸桿菌:
7.2X108cfu/ml,奇異變形桿菌:5.7X 108cfu/ml,遲緩愛德華菌:6.4X 108cfu/ml。選擇提取效果較好的方法提取各個(gè)不同稀釋度的菌體DNA模板，然后用優(yōu)化好的PCR體系進(jìn)行靈敏度的檢測(cè)。從結(jié)果中可知，體系的檢測(cè)靈敏度為:沙門氏菌89cfu，弗氏枸櫞酸桿菌7cfu,奇異變形桿菌57cfu，遲緩愛德華菌6cfu。見圖5。5、多重PCR—步法特異性測(cè)定

分別對(duì)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌、遲緩愛德華菌、大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、陰溝腸桿菌進(jìn)行DNA提取，利用所選擇的最佳條件分別進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)其特異性。結(jié)果9個(gè)菌株中只有沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，分別在161bp、330bp、396bp、526bp有4條擴(kuò)增帶，說(shuō)明本研究建立的方法特異性好。見圖6。6、多重PCR—步法穩(wěn)定性測(cè)定按照以上摸索的最優(yōu)條件將除模板以外的PCR反應(yīng)體系混合后分裝，放-20°C中凍存，按照最佳反應(yīng)條件定期取出檢測(cè)。檢測(cè)期間將預(yù)先混合好的PCR混合物放置-20°C條件下保存1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)月仍能擴(kuò)增出和現(xiàn)配的？0 混合物一樣清晰的條帶，通過一年的檢測(cè)可以看出該試劑的穩(wěn)定性較好，至少能保持一年以上。7、多重PCR —步法臨床檢測(cè)肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品等50份樣品，用多重PCR技術(shù)檢測(cè)，同時(shí)與常規(guī)方法檢測(cè)進(jìn)行比較。PCR檢測(cè)出I份樣品為沙門氏菌陽(yáng)性，與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果完全吻合 ο可以理解，很多細(xì)節(jié)的變化是可能的，但這并不因此違背本發(fā)明的范圍和精神，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對(duì)其所做的適當(dāng)變化，皆應(yīng)視為不脫離本發(fā)明專利的范疇。
權(quán)利要求
1.用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物，其特征在于為:S.spp.Fl:5’ -GCCGGTAAACTACACGATGA-3’ ；S.spp.Rl:5，-GAGTTACTGAACCAACAGCT-3’ ；C.freu.Fl:5’ -AACATAGCGATGGACAACTGA-3’ ；C.freu.Rl:5’ -TTAGCAAAAATTTAAGCCGGT-3’ ；P.mira.Fl:5’ -TTTATCAATAGCCTCAAACCCT-3’ ；P.mira.Rl:5’ -TGCGTCACCCTCTAACTCATCC-3’ ；E.tarda.Fl:5’ -CTGGGCAAGTATCCGACCTC-3’ ；E.tarda.Rl:5’ -GGTAACCGTATCGGCGTAAG-3’ ； 其中，S.spp.為沙門氏 菌的英文縮寫，C.freu.為弗氏枸櫞酸桿菌的英文縮寫，P.mira.為奇異變形桿菌的英文縮寫，E.tarda.為遲緩愛德華菌的英文縮寫； S.spp.Fl和S.spp.Rl為根據(jù)沙門氏菌FimA基因設(shè)計(jì)的上游引物Fl和下游引物Rl ；C.freu.Fl和C.freu.Rl為根據(jù)弗氏枸櫞酸桿菌Idh基因設(shè)計(jì)的上游引物Fl和下游引物R1；P.mira.Fl和P.mira.Rl為根據(jù)奇異變形桿菌IdsC基因設(shè)計(jì)的上游引物Fl和下游引物Rl ；E.tarda.Fl和E.tarda.Rl為根據(jù)遲緩愛德華菌FimA基因設(shè)計(jì)的上游引物Fl和下游引物Rl ; 所述沙門氏菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為526bp，弗氏枸櫞酸桿菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為161bp，奇異變形桿菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為396bp，遲緩愛德華菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為330bp。
2.如權(quán)利要求1所述用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于包括以下步驟: 步驟1，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數(shù)為20 24個(gè)，引物組合的熔解溫度Tm值為52 62 °C，引物組合的GC%為40% 60% ； 步驟2，對(duì)引物組合中的引物進(jìn)行篩選，保留不能合成引物二聚體的引物； 步驟3，判斷所保留引物的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)劣狀態(tài)，將步驟2所述保留不能合成引物二聚體的引物的GC%和堿基數(shù)進(jìn)行比較，選取GC含量高的判斷為競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)優(yōu)勢(shì)引物，進(jìn)行步驟5 ;否則判斷為競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)劣勢(shì)引物，進(jìn)行步驟4 ; 步驟4，再次篩選競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)劣的引物，具體步驟為:重復(fù)步驟2，對(duì)所保留的引物按照步驟3進(jìn)行再次判斷； 步驟5，利用PCR方法對(duì)競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)優(yōu)引物進(jìn)行擴(kuò)增。
3.如權(quán)利要求2所述用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟I中，所述所用的引物設(shè)計(jì)軟件為Primer Premier5.0o
4.如權(quán)利要求2所述用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟I中，所述多重PCR引物組合的熔解溫度Tm值為60°C。
5.如權(quán)利要求2所述用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟2中，所述對(duì)引物組合中的引物進(jìn)行篩選的具體步驟為:對(duì)所用的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選擴(kuò)增效果最好的引物組合。
6.如權(quán)利要求2所述用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟2中，所述不能形成引物二聚體的引物的堿基數(shù)目為20 24。
7.如權(quán)利要求2所述用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌和遲緩愛德華菌的多重PCR引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于在步驟5中，所述PCR方法的變性溫度940C，退火溫度為60°C ，延伸溫度72°C。
全文摘要
用于同時(shí)檢測(cè)沙門菌枸櫞菌變形菌和愛德華菌的多重PCR引物及其設(shè)計(jì)方法，涉及沙門氏菌等的檢測(cè)。沙門氏菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段為526bp，弗氏枸櫞酸桿菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段為161bp，奇異變形桿菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段為396bp，遲緩愛德華菌引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段為330bp。1設(shè)計(jì)多重PCR引物組合；2對(duì)引物組合中的引物進(jìn)行篩選，保留不能合成引物二聚體的引物；3判斷所保留引物的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)劣狀態(tài)，將步驟2保留不能合成引物二聚體的引物的GC%和堿基數(shù)進(jìn)行比較，選取GC含量高的判斷為競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)優(yōu)勢(shì)引物，轉(zhuǎn)步驟5；否則轉(zhuǎn)步驟4；4再次篩選競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)劣的引物；5對(duì)競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)優(yōu)引物擴(kuò)增。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103146827SQ201310072599
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
發(fā)明者陳瓊, 孔繁德, 徐淑菲, 趙冉, 周昱, 楊濤, 陳永鋒, 連玉華 申請(qǐng)人:廈門市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)測(cè)試中心, 廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心