甲狀腺激素受體α基因作為山羊生長性狀遺傳標記及應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于山羊的遺傳標記制備【技術領域】，具體涉及一種與山羊生長性狀的分子標記及其應用。所述的分子標記由山羊TRα基因第六內含子序列克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。在序列表SEQIDNO：1所示序列的第230位堿基處有一個C230-T230的堿基突變，導致NdeI－RFLP多態性。本發明還公開了獲得上述分子標記的制備方法和多態性檢測方法的應用，為山羊的標記輔助選擇提供了新的遺傳標記。
【專利說明】甲狀腺激素受體CI基因作為山羊生長性狀遺傳標記及應 用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于山羊的分子標記制備【技術領域】，主要為山羊基因的克隆和作為 分子標記輔助選擇，即利用位于該基因第6內含子中的C230T變異位點來預測山羊不同基 因型個體的生長性狀。

【背景技術】
[0002] 傳統的家畜育種是根據一些表型性狀進行選擇，但這些表型性狀是由遺傳基因和 外界環境共同決定的，因此傳統育種在許多優良性狀的育種上不能起到決定性作用。另外， 某些性狀需要在性成熟或生長后進行測量，需要較長的周期。利用分子遺傳學方法，如SNP 標記和微衛星標記等方法可以從本質上改變性狀，克服傳統育種的不足。分子遺傳學方法 能在早期獲得數據，有利于縮短遺傳間隔；還可以通過基因的突變進行直接選擇，提高選擇 的準確性。分子標記輔助選擇前提是要找到對性狀有較大遺傳貢獻率的主效基因或標記， 通過對這些主效基因和標記的檢測和選擇決定育種方向。目前已發現許多這類與生產性狀 密切相關的主效基因和分子標記，將此類標記與傳統育種結合可增進家畜育種進程。
[0003] 甲狀腺激素TH (Thyroid Hormone)由甲狀腺分泌，有著廣泛的生物學作用，能調 節生物體的生長、發育、代謝（Yen 2001)。該激素有兩種形式：四碘甲腺原氨酸（T4)以及 三碘甲腺原氨酸（T3)。血液中 T4 占 98%，T3 占 2% (St Germain, Galton et al. 2009)， 但T3的生物活性約是T4的5倍，因此主要是T3發揮激素的作用（Therien and Blostein 2000)。甲狀腺素參與調節機體的基礎代謝，調節體溫，使機體能更好的適應外界環境，增強 動物的耐受性（Yen 2001)。甲狀腺激素能促進蛋白質和酶的生成，還能減少脂肪貯存，降 低血脂濃度，促進膽固醇的降解，增強小腸粘膜對葡萄糖和半乳糖的吸收，促進糖原的合成 (Pearce 2012)〇
[0004] 甲狀腺激素必須與其受體結合才能作用于靶細胞。甲狀腺激素受體TR (Thyroid Hormone receptor)基因編碼一個410個氨基酸的類固醇蛋白，屬于類固醇受體超家族。 TR分子有三個功能結構區：羧基端為其與激素、配體等蛋白的結合區；氨基端具有轉錄激 活功能，并能與相應抗體結合；DNA結合功能區介于前兩者間，是最保守的區域。TR的激素 反應原件HRE (hormone responsive element)能結合在特定的DNA序列（甲狀腺激素反應 原件)上調或抑制基因的表達（Power，Llewellyn et al. 2001);未結合甲狀腺激素的TR 與DNA結合，起抑制作用，當結合甲狀腺激素后構象改變，激活靶基因的轉錄。TR基因主要 包含TRa和TRP基因兩種，分別編碼TRa和TRP蛋白（O'Shea and Williams 2002)， 這兩種蛋白的結構主要在于氨基端的氨基酸結構不同。由于TRa和TRi3基因的選擇性剪 切或轉錄起始位置的不同而產生若干亞型（Shibusawa, Hollenberg et al. 2003)。TRa 的亞型主要作用為調節機體生長發育，維持甲狀腺的功能（Lazar 1993) ;TRi3的亞型主要 作用為增加對T3的敏感性，維持TH對促甲狀腺激素TSH (thyroid stimulating hormone) 的負反饋（Jones, Srinivas et al· 2003)。
[0005] 甲狀腺激素受體協助甲狀腺素發揮廣泛的作用。目前，在人、小鼠、魚類等物種上 已有報道關于甲狀腺激素受體基因結構，多態性等。Helena等的研究結果發現在人TRα基 因的第2外顯子、第3內含子、第5外顯子、第8內含子、第9外顯子的3'UTR區、第10外顯 子的 3'UTR 區處發現了 SNPs (Sorensen, van der Deure et al. 2008)，但是在山羊上還 未見TRa基因多態性的報道。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于克隆與山羊生長性狀相關的77?〃基因片段，尋找基因突變位 點，并建立相應的多態性檢測方法進行性狀關聯分析，為山羊的標記輔助選擇提供一種有 用的分子標記。
[0007] 本發明通過以下技術實現： 一種作為分子標記應用的與山羊生長性狀相關的況0"基因片段，全長為888bp，它的 核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。其中第154bp處有一個C230-T230的堿基突變， 導致Ndel PCR-RFLP多態性。
[0008] -種制備所述的與山羊生長性狀相關的77?〃基因片段的方法，按照以下步驟： 利用NCBI數據庫信息，在線比對牛、綿羊77?〃基因，在第6和7外顯子保守區設 計引物擴增山羊況〃基因第6內含子。提取山羊基因組DNA，利用引物（正向引物：5' GCCTTCAGCGAGTTTACCAA 3'，反向引物：5' CTTCCGTGTCATCCAGGTTA 3'）擴增第 6 內含子。提 取山羊基因組DNA，設計引物，PCR擴增、PCR產物純化和測序，獲得如序列表SEQ ID Ν0:1 所述的核苷酸序列。
[0009] 在本發明的實施例中 申請人:已將制備的與山羊生長性狀相關的ΤΤΡσ基因分子標 記應用山羊分子標記輔助育種的關聯分析中的應用。
[0010] 本發明的效果是：發現了一個與山羊生長性狀相關的分子標記，為山羊的分子標 記輔助選擇提供了一個新的分子標記。
[0011] 更詳細的技術方案請參見《【具體實施方式】》中的實施例。
[0012]

【專利附圖】

【附圖說明】 序列表SEQ ID Ν0:1，山羊77?σ基因第6內含子序列。
[0013] 圖1 :山羊77PO·基因第6內含子C230T突變位點測序圖。
[0014] 圖2 :山羊77PO·基因第6內含子C230T突變位點Nde I限制性酶切瓊脂糖凝膠電 泳圖。
[0015] 圖3 :是本發明所擴增得到的山羊77?〃基因第6內含子核苷酸序列，片段大小為 888bp，圖中陰影部分是外顯子序列。方框內所顯示的是堿基突變。
[0016] 具體實施方案 實施例1 :山羊77PO·基因片段的獲得及多態性檢測 利用NCBI數據庫信息，在線比對牛、綿羊77?〃基因，在第6和7外顯子保守區設計引 物擴增山羊ΤΤΡσ基因第6內含子。正向引物：5' GCCTTCAGCGAGTTTACCAA 3'，反向引物：5' CTTCCGTGTCATCCAGGTTA 3' 。
[0017] 選取6個基因組DNA樣品（南江黃羊和藏山羊各3個)，以其基因組DNA為模板，利 用上訴引物，進行PCR反應。反應體系：2XMaster Mix Taq酶25 PL，cDNA 4 μ?，上游引物 (1〇μΜ)1.5 μ?，下游引物（1〇μΜ)1.5 PL，ddH20 18 μ?。PCR 反應程序：95 °C 預變性 5min; 然后94°C變性30s，61. 2°C，退火30s，72°C延伸45s，循環35次；最后再72°C延伸lOmin。 取4PL產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測，將含有單一目的條帶的PCR產物送至英濰捷基(上海)貿 易公司測序。測序結果與牛的相應序列比對，發現相似性較高，證明擴增得到的即為山羊 基因第6內含子序列。利用Sequencher4. 6和Chromas軟件分別對測序得到的6條序 列進行比對分析，找到突變位點C230T。根據序列突變位點信息，選用Nde I限制性內切酶 對6個山羊血液DNA樣品PCR產物進行酶切基因分型。酶切反應為限制性內切酶Nde I 1 PL，10XBuffer H 2PL，PCR 產物 5PL，ddH20 12μ?; 37°C恒溫水浴 1 h。酶切后電泳檢測， 取酶切產物8 μ L，用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。如圖2所示，電泳結果只有一條888bp 帶為CC基因型，電泳結果有888bp、230bp和658bp三條帶為CT基因型。
[0018] 實施例2 :分子標記在不同山羊群中的多態分布 檢測發現C230T位點在南江黃羊、內蒙古絨山羊、藏山羊三個品種中均有兩種基因型 CC和CT，其中CC基因型均為優勢基因型。該位點在三個品種中均處于Hardy-Weinberg平 衡狀態，在南疆黃羊、內蒙古絨山羊中處于低密度多態（PIC〈0. 25)，在藏山羊群體中處于中 度多態（0. 25〈PIC〈0. 5)。如下表： 表1三個山羊品種77?〇基因C230T位點的基因型(等位基因）頻率與遺傳特性

【權利要求】
1. 一種作為分子標記應用的與山羊生長性狀相關TRα基因片段，它的核苷酸序列如 序列表SEQ ID NO :1所述。
2. 根據權利要求1所述的基因片段，其特征在于：在序列表SEQ ID NO :1所述的第 230bp處有一個C230-T230的堿基突變，導致Ndel PCR-RFLP多態性。
3. 檢測權利要求1所述遺傳標記的正、反向引物的DNA序列如下所示： 正向引物：5' GCCTTCAGCGAGITTACCAA 3' 反向引物：5' CTTCCGTGTCATCCAGGTTA 3'。
4. 制備如權利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步驟：利用NCBI數據庫信 息，在線比對牛、綿羊TRa基因，在第6和7外顯子保守區設計引物擴增山羊TRa基因第6 內含子，提取山羊基因組DNA，設計引物，PCR擴增、PCR產物純化和測序，獲得如序列表SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列。
5. 權利要求2所述的遺傳標記在山羊不同生長階段的體重、體長、體高和胸圍以及初 生重生長性狀關聯分析中應用。
【文檔編號】C12N15/10GK104099336SQ201310111237
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月2日 優先權日:2013年4月2日
【發明者】王林杰, 張紅平, 李利, 仲濤, 王艷, 薛科, 周中強 申請人:四川農業大學