專利名稱：一種測量端粒絕對長度的方法
技術領域：
本發明涉及生命科學領域，具體地說涉及一種測量端粒絕對長度的方法。
背景技術：
端粒是核蛋白結構，冠在染色體末端。它是由長六聚體序列(TTAGGG)組成。完整的端粒結構和它重復的六聚體序列保護染色體末端的退化，對維持基因組的穩定起到了至關重要的作用。端粒的六聚體序列(TTAGGG)的數量會隨著細胞的每一次分裂而減少，導致在生物體的整個生命過程中，端粒長度在不停地縮短。端粒長度的縮短會造成端粒末端的融合，染色體的不穩定，因而成為包括肺癌，乳腺癌，結腸癌，前列腺癌，白血病等多種癌癥的原因。端粒長度的縮短也是導致衰老的一個重要因素。研究表明包括心理和生理上的壓力，抽煙，肥胖等都可加速端粒長度的縮短。測量端粒的長度和監測端粒長度的動態變化在健康群體和疾病的發展上越來越引起人們的關注。隨著干細胞開始廣泛用于臨床實踐，越來越多的研究表明端粒的長度還是用來監測干細胞質量，預測干細胞在體內成活時間的一個重要指標之一。目前有很多方法可以用來測量端粒的長短，例如(I)通過DNA與端粒序列probe的雜交，利用Southern blot技術進行末端限制性片段分析(Terminal RestrictionFragment (TRF) analysis) ; (2)流式細胞儀法；(3)原位雜交；(4)實時定量PCR等。除了TRF方法，其他方法都有一個同樣的弊病——只能測量端粒的相對長度，而TRF方法需要較大量的DNA。端粒絕對長度是先建立標準曲線，端?；诖擞嬎愠?；相對長度是通過與對照的基因如看家基因的表達量相比較而得到的結果。目前關于端粒絕對長度的測量方法未見報道。

發明內容
發明目的:本發 明的目的是提供一種準確、省時、DNA底物消耗少、重復性強的測量端粒絕對長度的方法。技術方案:為了實現上述發明目的，本發明的一種測量端粒絕對長度的方法包括:(I)從血樣中提取基因組DNA，用分光光度儀測量DNA濃度，稀釋到20ng，于4°C保存備用；(2)建立端粒長度標準曲線:將具有14個重復序列TTAGGG的84mer oligo按濃度梯度稀釋，通過qPCR反應獲得端粒長度標準曲線，
對應不_濃度的端粒K =iHil￡Lx S4(I),式(I)中，cT表示84mer oligo的摩爾濃度，MQlig。表示84mer oligo的分子量；
(3)建立二倍體基因組拷貝數量的標準曲線:將單拷貝基因36B4按與所述步驟(2)相同的濃度梯度稀釋，通過qPCR反應獲得
二倍體基因組拷貝數量的標準曲線，
權利要求
1.一種測量端粒絕對長度的方法，其特征在于包括: (1)從血樣中提取基因組DNA，用分光光度儀測量DNA濃度，稀釋至20ng，于4°C保存備用； (2)建立端粒長度標準曲線: 將具有14個重復序列TTAGGG的84mer oligo按濃度梯度稀釋，通過qPCR反應獲得端粒長度標準曲線，
2.根據權利要求1所述的一種測量端粒絕對長度的方法，其特征在于: 所述qPCR反應體系為:
3.根據權利要求2所述的一種測量端粒絕對長度的方法，其特征在于: 所述上游引物包括分別用于端粒和36B4的qPCR的上游引物tel Fv-Cggtttgtttgggtttgggtttgggtttgggtttgggtt-S' ^ 36B4F:5’ -CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’ 所述下游引物包括分別用于端粒和36B4的qPCR的下游引物tel R:5’-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3’，或 36B4R:5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3，。
4.根據權利要求1或2所述的一種測量端粒絕對長度的方法，其特征在于:所有PCR反應底物通過添加PBR322質粒DNA使其保持在20ng。
全文摘要
本發明公開了一種測量端粒絕對長度的方法，通過應用oligomer standard可以測量出端粒的絕對長度，而不是相對長度。這是與已發表的實時定量PCR方法相比最大的不同。本發明的測量方法可重復性強，所需的DNA底物少，省時準確，更適用于臨床檢測端粒長度，監測它的動態變化，達到預測疾病發展和衰老的指標之一?？蛇M一步用于對植入前胚胎和干細胞質量進行研究。
文檔編號C12Q1/68GK103233071SQ20131015270
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月27日 優先權日2013年4月27日
發明者白麗君, 金星亮 申請人:南京優而生物科技發展有限公司