小細胞肺癌病理演變前期miR-886-3P水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與小細胞肺癌早期病理演變有密切相關miR-886-3P的方法，包括以下步驟：(1)在雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。本發明的試劑盒和檢測方法可在RNA水平上檢測miR-886-3P表達量，比影像醫學和現有的臨床生化檢測指標更早期，能實現真正的癌變前期RNA水平篩查，同時，本發明的檢測方法簡單方便，成本低，便于縣區級醫院推廣應用。
【專利說明】小細胞肺癌病理演變前期miR-886-3P水平原位雜交檢測 試劑盒及檢測方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與小細胞肺癌病理演變RNA表達 改變（病理演變過程）的相關檢測技術。

【背景技術】
[0002] 根據國內外權威機構提供的資料，我國每年癌癥的新增人數260萬，死亡人數近 210萬，患者700多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數接近800萬，患者約有8400 多萬人，到2020年以上人數將翻一番，這是一組可怕的數字。癌癥診治成本越來越高，按癌 癥患者的年治療費用20萬（貧窮地區可能偏高，發達地區可能遠遠高出20萬），700多萬 患者，每年的花費是1. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有1萬億人民幣白白 消耗了。而且，癌癥患者大部分會在治療后不久死亡。因此，現有的臨床癌癥診治模式一定 要改變，本發明的創新點是提前做到預防性篩查，然后及時介入預防性調控和預防性治療， 做到基因水平癌癥的治未病。
[0003] 2005年美國衛生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了一個年度報告，對 1972年發起的抗癌大戰進行回顧，報告認為人類在抗癌大戰中是失敗，結論是癌癥死亡率 沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰失敗的幾個因素是：1.腫瘤細胞異質性（多態性）；2.腫 瘤細胞耐藥性；3.抗癌藥物設計思路不完善（動物模型設計不科學）等。同時，該報告中 亦提出應重新審視現有診治癌癥的措施。
[0004] 本發明人在長期研究中發現，導致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的 早期診斷。依照現有的臨床醫學影像（B超、CT、核磁共振成像等）及和其它生化（癌抗原、 癌胚抗原、糖類激素、細胞膜因子、細胞核因子、細胞流式技術）指標來診斷癌癥，都是腫瘤 形成后診斷，前者要有組織學變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋 放、或腫瘤的標記物。傳統臨床觀念認為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷， 這一概念值得認真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學性是不夠嚴謹的，從細胞學角 度來分析，1公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數遠不 止2億個腫瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程 相當長，可能是5年或10年、甚至是10年以上（特殊病例除外），很難證實的是在這個病理 演變過程中，腫塊是癌癥唯一的發生地和單獨的病灶，可能癌細胞早已遷移到其它組織或 器官生長。臨床研究早已證實，一旦形成腫塊的同時，其它癌細胞通過不同途徑遷移到其它 部位克隆生長，一旦切除原發灶后，其它器官復發灶或多發癌塊灶先后形成。因此，在臨床 上以2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹（有些病例，在發現原發病灶時， 同時發現轉移病灶，不在我們表述的內容中），其實這時已經是晚期診斷和晚期治療，這是 導致癌癥死亡率不降的真正原因。
[0005] 隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，為 了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預防癌癥，已取得長足進步。至今，我們已有可能 在基因的一級轉錄功能產物（mRNA水平或microRNA)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌 變前期或癌細胞形成（單克?。┣埃涂梢宰龅皆缙陬A測和篩查。
[0006] 微小核醣核酸（microRNA/miRNA)是一段長度約為22核苷酸的寡核醣核酸分子， 它們可以藉由調控mRNA來抑制轉譯作用或是造成mRNA的□解□□低基因的表現。近來有 許多研究發現，miRNA與癌癥具有高度的相關性。因此推論miRNA可能是癌化過程的一個 導因。到目前為止，在人體上有超過700個miRNA被發現，而大約有100左右的miRNA被 確認與人類癌癥具有相關性，這其中包含有食道癌、乳癌、血癌、肺癌、腦癌、肝癌、直腸結腸 癌、膠質細胞瘤、垂體瘤等多種腫瘤在食道癌細胞中，miR-17-92家族等microRNA在多種腫 瘤中表達上調。種miR-21在成膠質細胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、 胃癌等多惡性腫瘤中上調表達。
[0007] 雖然腫瘤組織microRNA表達譜與腫瘤發病及預后相關，但是檢測技術復雜、創傷 大，難以真正應用于臨床診斷。相比較而言，外周血血清較易獲得和檢測，臨床應用便捷，利 于推廣。血清中是否存在血清microRNA的表達譜與對應腫瘤組織microRNA表達譜關聯？ 2008年至今已報道多項血清microRNA與腫瘤關系的研究工作，為血清microRNA作為分子 標記應用于腫瘤的早期診斷和預后提供了工作基礎。
[0008] 但是，由于血清中microRNA的表達量較低，尋找一種靈敏度高、操作簡便且成本 低廉的檢測方法是目前血清microRNA應用于腫瘤臨床檢測亟待解決的問題。國際上多家 研究機構報告了 miR-886-3P與小細胞肺癌的生存密切相關，miR-886-3p低表達致小細胞 肺癌患者生存期縮短，易發生癌細胞轉移。
[0009] 本發明選擇多組臨床標本（肺癌病人、高危人群、正常對照）采用核酸原位雜交技 術和免疫組化方法對miR-886-3P與小細胞肺癌的早期預警進行檢測分析。
[0010] 本發明人在研究中發現miR-886-3P在小細胞肺癌患者、癌癥高危人群（20年以上 煙齡）、正常對照人有明顯的表達量變化，將miR-886-3P作為早期篩查小細胞肺癌變前期 有非常重要的臨床診斷意義。miR-886-3P在小細胞肺癌變前期過程中低表達。他作于肺癌 癌變前期篩查、及小細胞肺癌治療后的復發、轉移預警也有非常重要的臨床意義。
[0011] 發明人在長期的研究中，得出了一種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床 診治模式一定要改變，不能只停留現在治已?。òl病后診治），要做到預防性診治，做到治 已病，只有這樣才能降低重大疾病的發病率和死亡率，降低社會成本和醫療成本。因此，發 明人在開發和生產重大疾病的RNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了 創新。特別是篩選臨床標本（正常人群、癌癥高危人群、腫瘤患者），突破了正常組織與腫瘤 組織比較的一貫性研發思路，來尋找和開發癌前變的RNA水平，與癌癥早期基因病理生理 學演變密切相關，而且臨床意義非常重要靶標，將臨床上腫瘤形成后診治模式變成腫瘤的 預防性診治，爭取了腫瘤診治的時間和空間，達到預防癌癥。
[0012] 目前，miR-886-3P表達譜檢測方法用Northern雜交、表達芯片、實時熒光定量PCR 和Solexa測序等分析技術，而這些方法多用于科研方面，不適應臨床應用，而檢測RNA比基 因分析更科學（DNA分析大部分在易感性的表象上，RNA是功能性體現），比蛋白分析更可靠 (本發明人長期研究中用雙標記技術發現，在細胞中RNA與蛋白翻譯、轉錄、表達有時候不 同步）。根據現有的文獻資料采用原位雜交技術和組化免疫方法檢測miR-886-3P水平表 達量的檢測技術及試劑盒未見報道。
[0013] 本發明人在針對創新性發明的要求，設計了（小細胞肺癌患者、高危人群、正 常對照）不同數據例組，用原位雜交技術進行檢測，結果表明以上小細胞肺癌癥病人 miR-886-3P低表達，高危人群有不同程度表達15-25%，正常對照都是高表達。表明 miR-886-3P小細胞肺癌變前期篩查的重要標志物。
[0014] 原位雜交技術（in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起 來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含 有特異序列、經過標記的核酸單鏈（即探針），在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈 即靶核酸發生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
[0015] 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（雖不明 確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子），探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探 針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加 以標記，以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常 用的同位素標記物有 3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優 點，但是由于放射性同位素對人和環境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同 位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是 極其靈敏的。
[0016] 根據所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、沖洗和 顯示。本發明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針（RNA)和檢測的靶RNA是采用堿基互 補（雜交互補）的原理，同時經過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結果沒 有影響。
[0017] 鑒于目前臨床上癌癥的診斷（影像醫學和生化指標物都是腫瘤形成后的診斷）是 晚期診斷，治療也是晚期治療，導致死亡率不降的醫治模式。本發明的初衷是想完善目前臨 床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預防性治未病，達到預防性診治，將目前影像醫學 手段和眾多生化標記物無法檢測到癌前變RNA水平量化改變技術，做了創新性的技術突 破，提供癌前變RNA水平篩查技術。使臨床上有了一項新的癌前變RNA水平真正早期篩查 的技術，為臨床癌癥的診治爭取時間和空間。
[0018] 綜上所述，本發明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交 檢測探針和標記物。其次，本發明還要提供上述試劑盒用于與小細胞肺癌變前期篩查及治 療后轉移早期預警相關的原位雜交檢測方法。


【發明內容】

[0019] 為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下：
[0020] 本發明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所 述的雜交探針分別具有序列表SEQ ID NO. 1所示序列號：NR_030583,核苷酸序列長度是 l〇bp，位于染色體5q31. 1"上。
[0021] 本發明試劑盒的一個優選方案是，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯 色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。 本發明試劑盒的一個優選方案是還包括雜交液。 本發明試劑盒的一個優選方案是還包括增強劑。 本發明試劑盒的一個優選方案是還包括顯色劑。
[0022] 本發明的癌變前期miR-886_3P篩查試劑盒應用價值在于，對肺癌癌變前期篩查， 及癌變后或治療后復發、轉移、擴散發生預警，進一步配合臨床治療。
[0023] 本發明還提供一種miR-886_3P原位雜交的檢測方法，包括以下步驟： (1) 在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物中待測 RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和 (2) 檢測所述雜交復合體。
[0024] 本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的可形成穩定雜交復合體的條件為： 核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16-24小時。
[0025] 本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的底物選用人的血液白細胞標本或 其它器官組織細胞標本。更優選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自小細 胞肺癌患者、小細胞肺癌高危人群、健康正常人群。
[0026] 本發明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合，以miR-886_3P 為檢測對象，合成探針是miR-886-3P雜交互補序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或 組織細胞中RNA的表達量。原位雜交技術的顯示方法能提供miR-886-3P的半定量或定量 表達程度判定。根據雜交后免疫組化顯色判定以上RNA的表達量，正常人miR-886-3P高表 達，即大量顯色，miR-886-3P在小細胞肺癌病人和高危人群都是低表達，與正常對照有顯著 差異，該基因的表達量比正常人表達量都低。
[0027] 本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括： 1) .將待測標本放入反應槽中； 2) .儀器自動棄去液體，自動加消化液； 3) .儀器自動棄去液體，自動后固定； 4) .儀器自動棄去液體，自動預雜交（42°C ); 5) .儀器自動棄去液體，自動清洗； 6) .儀器自動棄去液體，自動雜交（42°C ); 7) .儀器自動棄去液體，自動清洗； 8) ·儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養（室溫）； 9) .儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色； 10) .取出封片鏡檢。
[0028] 本發明的一個優選實施例的方案是：以miR-886_3P合成的核酸探針用地高辛標 記（地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優點，還克服了 生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點），將該雜交探針與 人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察RNA的 存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的RNA的表達量。 本發明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的 miR-886-3P表達量，用來確定小細胞肺癌病理演變前期的RNA變化量，預警肺癌癌變是否 發生及小細胞肺癌患者治療后是否復發、轉移的預測。因為miR-886-3P在正常人中高表 達，如果miR-886-3P表達量降低，說明有患癌的風險，或者癌變已發生，或癌癥病人術后已 經復發、轉移，從而獲得癌癥的診斷信息。
[0029] -個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。
[0030] 本發明具有如下有益效果： 本發明的臨床意義是更早期跟蹤檢測肺癌癌變發生和病理演變過程中miR-886-3P表 達量的變化，預警小細胞肺癌發生、發展趨勢。
[0031] 本發明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測與肺癌標志物，以及影像醫學檢查有顯著 不同。本發明可以在RNA水平檢測miR-886-3P異常表達，在影像醫學檢查未發現占位性癌 病灶復發之前，癌癥生化指標未產生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上基因表 達異常的信息采集，給臨床肺癌患者一個真正的早期預警以及治療后轉移復發及早預測。 這樣才有可能實施肺癌的早期篩查、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治小細胞 肺癌惡疾。
[0032] 此外，本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發明的檢測 方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。 附圖的簡單說明
[0032] 圖1是本發明miR-886- 3P原位雜交實施例圖（核酸原位雜交技術流程圖）。
[0033] 圖2是本發明實施例中小細胞肺癌病人miR-886_3P表達圖片。
[0034] 圖3是高危人群圖片
[0035] 圖4是本發明實施例中正常人miR-886-3P表達圖片。

【具體實施方式】
[0036] 下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應該理解，下面的實施例用于說明 而非限定本
【發明內容】
，任何形式上的改變或變通將落入本發明的保護范圍。
[0037] 實施例1 按照常規方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以miR-886-3P設計的 雜交探針、標記物、說明書，其中： 本實施例的探針標記物選用地高辛。
[0038] 試劑盒雜交液組成： 消化液 100 μι/管 1管/盒 無色透明液體 保護液 iOOuL/管 1管/盒 無色透明液體 預雜交液 1300 μ L/管 2管/盒 無色透明液體 正義雜交液 1〇μ?/管 1管/盒 無色透明液體 反義雜交液 10uL/管 1管/盒 無色透明液體 封閉液 1000 μι/管 1管/盒 無色透明液體 堿性磷酸酶抗體1 u L/管 1管/盒 無色透明液體 顯色劑A 175 μ L/管 1管/盒 黃色液體 顯色劑Β 320 μ L/管 1管/盒 無色透明液體 淺黃色或無色透明液 緩沖液I 90mL/瓶 1瓶/盒 體 淺黃色或無色透明液 緩沖液II 80mL/瓶 1瓶/盒 體 淺黃色或無色透明液 緩沖液III 20mL/瓶 3瓶/盒 體 淺黃色或無色透明液 緩沖液IV 90mL/瓶 1瓶/盒 體 固定液 90mL/瓶 1瓶/盒 無色透明液體 陽性對照標本 6片/盒 配制試劑使用濃度 1) .將10X緩沖液I用三蒸水按1 : 10稀釋成IX緩沖液I ; 2) .將20X緩沖液II用三蒸水按1 : 10稀釋成2X緩沖液II ; 按1 : 100稀釋成0.2X緩沖液II;按1 : 200稀釋成0.1 X緩沖液II; 3) .將10X緩沖液III用三蒸水按1 : 10稀釋成IX緩沖液III ; 4) . 10 X緩沖液IV用三蒸水按1 : 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10mL，力口 水至100mL既可）。
[0039] 實施例2 應用核酸原位雜交檢測方法對各組血液標本miR-886-3P表達量的實施過程： 1) .取待測標本兩張； 2) .在玻璃缸里加入消化液（消化液100yL加 IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度）50ml，37°C水浴預熱10min，放進16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗5min ; 3) .用0. 2%的保護液（保護液lml加1 X緩沖液I，99ml即為使用濃度）洗10min，三 蒸水洗5min (以上過程都在玻璃缸進行），取出玻片，讓其自然干燥； 4) .將玻片放入保濕盒內，加預雜交液25 μ L/片（加在有細胞的地方），蓋上蓋玻片， 蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中3h以上； 5) .取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內，用70^^90^^95 %的乙醇各洗 2min，取出，自然干燥； 6) .將玻片放入保濕盒內，一張加正義雜交液25 μ L/片，另一張加反義雜交液25 μ L/ 片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ; 7) .取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內： 在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min ; 在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min ; 在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ; 8) .用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥； 9) .將玻片放入保濕盒內，加0. 5%封閉液（1ml封閉液加5mllX緩沖液III) 100 μ L/ 片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。（此步驟不需加蓋玻片）； 10) .取出玻片，用IX緩沖液ΠΙ洗30s，自然干燥； 11) .將玻片放入保濕盒內，加 X-AP抗體（取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入 1.811111\緩沖液111)10(^17片，蓋緊保濕盒在室溫下作用3〇1^11，時間不能過長，否則會 產生假陽性（此步驟不需加蓋玻片）； 12) .取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min; 13) .用1 X緩沖液IV洗2min，加顯色劑（顯色劑A73. 3 μ L，顯色劑B157. 5 μ L加到 30mLl X緩沖液IV中，混勻），室溫避光16h到18h以上； 14) .用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的IX緩沖液I混勻）封片鏡檢。
[0040] 本發明的核酸原位雜交檢測方法將目的基因用地高辛標記，成為RNA核酸探針， 將探針與人體白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下 觀察RNA的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的RNA的表達量。
[0041] 肺癌病人20名，高危人群（煙齡20年以上）20名，正常對照組20名。抽所有待 檢人的外周血3-5毫升（分離白細胞）做原位雜交。結果表示，所有肺癌患者miR-886-3P 表達量低，細胞染色淺；高危人群表達也是稍低表達，小數染色；正常對照組miR-886-3P表 達量高，細胞大多數染色，具體結果見圖2、圖3、圖4。

【權利要求】
1. 一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針分 別具有序列表SEQ ID N0:NR_030583所示的序列。
2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質、化學發光 或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6. -種miR-886-3P基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 在權利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物 中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和 (2) 檢測所述雜交復合體。
7. 如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩定雜交復合體的條件 為：核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16-24小時。
8. 如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細胞標本。
9. 如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液標本（癌癥、高危人群、正常 人標本）。
10. 如權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述包括臨床上的小細胞肺癌的高危 人群癌前病理演變過程，以及小細胞肺癌經治療后的復發和轉移病理演變過程。
【文檔編號】C12Q1/68GK104140998SQ201310167921
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月9日 優先權日:2013年5月9日
【發明者】張云福, 裘建英, 裘霖, 張玉麗 申請人:嘉興瑞康生物科技有限公司