來源于大豆的干旱誘導啟動子GmMYB363P及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了來源于大豆的干旱誘導啟動子GmMYB363P及其應用。GmMYB363P，是如下a）、b）或c）的DNA分子：a）核苷酸序列是SEQ?ID?No.1的DNA分子；b）與a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有啟動子功能的DNA分子；c）在高嚴謹條件下與a）或b）限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA分子。GmMYB363P為干旱誘導型啟動子。利用GmMYB363P可以使基因在干旱誘導條件下表達，因而避免了組成型啟動子過量表達帶來的負作用—產生大量的異源蛋白和有毒物質。
【專利說明】來源于大豆的干旱誘導啟動子GmMYB363P及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及來源于大豆的干旱誘導啟動子GmMYB363P及其應用。

【背景技術】
[0002] 啟動子（Promoter)是基因組基因的一個重要組成部分，它像"開關"一樣，在轉錄 水平上基本決定其控制下的編碼基因是否表達、何時表達、何處表達和表達強度。一般根據 啟動子作用方式和功能將其大體可以分為三大類：組成型啟動子、特異性啟動子和誘導型 啟動子。組成型啟動子（Constitutive promoter)是指能夠驅使其控制下的編碼基因在不 同器官和/或組織大體恒定表達的一類啟動子。它的特點是：受其控制的編碼基因的表達 具有持續性，但不具有時空特異性；RNA和蛋白質表達量相對恒定，不受外界因素的誘導。 誘導型啟動子（Inducible promoter)是指能夠響應某些特定的物理、化學和生物信號（統 稱為"誘導子"或"誘導因子")而驅動其控制的編碼基因大幅度地增加轉錄水平的一類啟動 子。誘導型啟動子常常根據其誘導信號來分類和命名，例如：真菌誘導啟動子、共生細菌誘 導啟動子、化學誘導啟動子、金屬離子誘導啟動子、光誘導啟動子、熱誘導啟動子和創傷誘 導啟動子等。器官和/或組織特異性啟動子（〇rgan-and/or Tissue-specific promoter), 能夠驅使其控制下的編碼基因僅僅在生物體的某一或某些特定的器官和/或組織，或者僅 僅在生長發育的某一或某些特定階段表達的一類基因。它的特征為，受其控制或調節的基 因表達具有明顯的時空性，并往往表現出發育調節的特性。例如，植物上的根特異性啟動 子、葉片特異性啟動子、花特異性啟動子、氣孔特異性啟動子、氣孔絨氈層特異性啟動子、花 粉特異性啟動子、果實特異性啟動子、種子特異性啟動子、胚乳特異性啟動子、棉花纖維特 異性啟動子和韌皮部特異性啟動子等等。
[0003] 在自然環境中，植物生長在開放的系統中，經常會遇到冷、熱、旱、澇、鹽堿、大氣 污染等不良環境的影響。不良環境作用于植物，將會引起植物體內發生一系列的生理代謝 反應，表現為代謝和生長的可逆性抑制，嚴重時甚至引起不可逆傷害，導致整個植株死亡。 在各種環境脅迫中，干旱、低溫、高熱和高鹽等非生物脅迫對植物的影響尤為突出，表現為 不同程度地對植物體內水分狀況的影響，因此又成為水分脅迫，是制約植物生長和農作物 產量的最主要非生物性逆境因子。植物在長期的進化中，逐漸形成了一系列應答逆境脅迫 的生理、代謝以及防御系統。從植物中克隆非生物逆境誘導啟動子將為提高植物對非生物 脅迫的抗性奠定物質基礎。


【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供植物受干旱誘導啟動子。
[0005] 本發明所提供的啟動子，名稱為GmMYB363P，來源于大豆，是如下a)、b)或c)的DNA 分子：
[0006] a)核苷酸序列是SEQ ID No. 1的DNA分子；
[0007] b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有啟動子功能的DNA 分子；
[0008] c)在高嚴謹條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA 分子。
[0009] 其中，SEQ ID No. 1由1384個核苷酸組成。
[0010] 上述75%或75%以上一致性，可為80%、85%、90%、95%以上的一致性。
[0011] 所述高嚴謹條件是指，將雜交膜置于預雜交液（〇. 25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2， 7%SDS)中，65°C預雜交30min ;棄預雜交液，加入雜交液（0. 25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2， 7%SDS，同位素標記的核苷酸片段)，65°C雜交12hr ;棄雜交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸 鈉緩沖液，PH7. 2, 5%SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ;加入洗膜液II (20mmol/L磷酸鈉緩沖 液，ρΗ7· 2,1%SDS)，65°C洗膜 30min。
[0012] 本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發明的啟動子核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分離得 到的啟動子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表達靶基因的啟動子活 性，均是衍生于本發明的核苷酸序列并且等同于本發明的序列。
[0013] 這里使用的術語"同源性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同源性"包括與本 發明的啟動子核苷酸序列具有優選地75%或更高，更優選地85%或更高，甚至更優選地90% 或更高，以及最優選地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或計算機軟件 進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同源性可以用百分比（％)表示，其可以 用來評價相關序列之間的同源性。
[0014] 含有GmMYB363P的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因細胞系也屬于本發明 的保護范圍。
[0015] 所述含有GmMYB363P的表達盒，是指能夠在宿主細胞中表達目的基因的DNA， 該DNA不但包括啟動所述目的基因的GmMYB363P，還可包括終止所述目的基因轉錄的 終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。所述轉錄終止子包括但不限于：農 桿菌胭脂堿合成酶終止子（N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、 豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子（參見，例如：0dell等人（I985) Nature 313:810 ;Rosenberg 等人（1987)Gene, 56:125 ;Guerineau 等人（1991)Mol. Gen. Genet, 262:141;Proudfoot(1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人 Genes Dev.，5:141;Mogen 等人（1990)卩13拉〇611，2:1261以11111'〇6等人（1990)66116,91:151;83113(1等人（1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res.，15:9627)。
[0016] 所述的含有GmMYB363P的重組載體具體可為用SEQ ID No. 1的第1-1384位所示 的啟動子GmMYB363P替換pCAMBIA-1301的Hind III和Bgl II之間片段得到的⑶S基因重 組表達載體pCAMBIA-1301-GmMYB363P-⑶S。所述重組微生物具體可為細菌，酵母，藻和 真菌。其中，細菌可來自埃希氏菌屬（Escherichia),歐文氏菌（Erwinia),根癌農桿菌屬 (Agrobacterium)、黃桿菌屬（Flavobacterium)，產喊菌屬（Alcaligenes)，假單胞菌屬 (Pseudomonas),芽胞桿菌屬（Bacillus)等。所述的轉基因細胞系不包括動物和植物的繁 殖材料。
[0017] 本發明中，攜帶有GmMYB363P的植物表達載體可通過使用包含但不限于Ti質粒、 Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化 植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。
[0018] 擴增GmMYB363P全長或其任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。
[0019] 實驗證明，GmMYB363P可在4%分子量為6000的聚乙二醇（PEG6000)水溶液模擬的 干旱脅迫誘導下啟動目的基因在的表達。
[0020] GmMYB363P可用于培育轉基因植物，該轉基因植物在干旱脅迫誘導下能增加目的 基因的表達量。
[0021] 上述應用中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，如大豆。
[0022] 所述轉基因植物理解為不僅包含將目的基因轉化目的植物得到的第一代轉基因 植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規育種技術 將該基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業品種中。所述轉基因植物包括種子、 愈傷組織、完整植株和細胞。
[0023] 本發明的GmMYB363P為干旱誘導型啟動子。利用GmMYB363P可以使基因在干旱誘 導條件下表達，因而避免了組成型啟動子過量表達帶來的負作用一產生大量的異源蛋白和 有毒物質。本發明的GmMYB363P對通過目的基因在干旱脅迫下的高表達來提高轉基因植物 耐旱性有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為植物表達載體pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S示意圖。
[0025] 圖中，GmMYB363promoter 表示 GmMYB363P。
[0026] 圖2為轉pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根在水中或4%PEG6000水溶液中培 養12小時后的GUS染色圖。
[0027] 圖2中，左圖為轉pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根在水中培養12小時后的 ⑶S染色圖；右圖為轉pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根在4%PEG6000水溶液中培養 12小時后的GUS染色圖。

【具體實施方式】
[0028] 下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。
[0029] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0030] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0031] 大豆南農1138-2 (由南京農業大學國家大豆改良中心提供，公眾可從中國科學院 遺傳與發育生物學研究所獲得，以重復本申請的實驗，記載在文獻w. K. Zhang，Y. J. Wang，G. Z. Luo, J. S. Zhang, C. Y. He, X. L. Wu, J. Y. Gai, S. Y. Chen, QTL mapping of ten agronomic traits on the soybean (Glycine max L Merr.) genetic map and their association with EST markers，Theor.Appl. Genet，2004, 108:1131-1139)。
[0032] 大豆科豐 1 號（Glycine max L· Merr. Kefeng 1)記載在胃.1(.211&叫，￥.<1.他叫，6· Z. Luo, J. S. Zhang, C. Y. He, X. L. Wu, J. Y. Gai, S. Y. Chen, QTL mapping of ten agronomic traits on the soybean (Glycine max L Merr.) genetic map and their association with EST markers，Theor. Appl. Genet，2004, 108:1131-1139 中，公眾可以從中國科學院遺 傳與發育生物學研究所獲得，以重復本申請的實驗。
[0033] 植物表達載體 pCAMBIA-1301，記載于 Zheng SJ, et al.，Molecular characterization of transgenic shallots(Allium cepa L.)by adaptor ligation PCR(AL-PCR)and sequencing of genomic DNA flanking T-DNA borders, Transgenic Res. 2001，10(3) : 237-45。
[0034] 發根農桿菌 K599 記載在 Attila Kereszt, et al.，Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology, Nature Protocols, 2007, 2(4)，549-552)中，公眾可從Peter M Gressnon教授，The University of Queensland, St Lucia, Queensland4072, Australia獲得，或經Peter M Gressnon教授同意 (書面同意書）后由中科院遺傳與發育生物學研究所獲得，以重復本申請的實驗。
[0035] 實施例1、干旱誘導啟動子GmMYB363P的克隆及轉基因載體的構建
[0036] 一、干旱誘導啟動子GmMYB363P的克隆
[0037] 發明人將大豆南農1138-2基因組進行了 99X測序和拼接，構建了基因組物理圖 譜。根據測序數據，獲得了啟動子GmMYB363P區域序列，據此，設計了啟動子GmMYB363P序 列的克隆引物，正向引物中含有Hind III識別序列，反向引物中含有BamH I識別序列：
[0038] 正向：5, -AAGCTTATCTACCACGGAGACAA-3' ；
[0039] 反向：5, -GGATCCGGATCTATCTTTGCCTT-3'。
[0040] 用上述引物以大豆南農1138-2的基因組DNA為模板，擴增得到1384bp的擴增產 物，將該PCR擴增產物與pMD18-T克隆載體連接后測序。將測序結果表明含有SEQ ID No. 1 的第1-1384位所示的DNA分子的重組載體命名為pMD18-T-GmMYB363P。其中，SEQ ID No. 1 由1384個核苷酸組成，為啟動子GmMYB363P的核苷酸序列。
[0041] 二、重組表達載體的構建
[0042] 由于BamH I的酶切識別位點為5' G~GATCC3'，而Bgl II的酶切識別位 點為5' A~GATCT 3'，因此上述兩個酶切片段可連接。Hind III和BamH I雙酶切 pMD18-T-GmMYB363P，回收 GmMYB363P 片段并與 Hind III和 Bgl II 酶切后的 pCAMBIA-1301 (GenBank:AF234297. 1)植物表達載體連接，得到由啟動子GmMYB363P啟動⑶S基因轉錄的 重組表達載體 pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S。經測序證實，pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S為用SEQ ID No. 1的第1-1384位所示的啟動子GmMYB363P替換pCAMBIA-1301的Hindlll 和Bgl II之間片段得到的⑶S基因重組表達載體。
[0043] 實施例2、利用啟動子GmMYB363P培育轉基因大豆
[0044] 運用發根農桿菌介導轉基因毛狀根方法，將pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S轉化 到發根農桿菌K599中。
[0045] 發根農桿菌侵染法根據Attila Kereszt等方法（Attila Kereszt, et al. , Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology, Nature Protocols, 2007, 2 (4)，549-552)進行，該方法獲得的新生毛狀根多 于96%均為轉基因毛狀根。
[0046] 具體操作如下：
[0047] 1)首先將含有⑶S基因的pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S，通過電擊法導入發根 農桿菌K599中，得到重組農桿菌。提取重組農桿菌的質粒，用PCR方法鑒定重組農桿菌中 所含啟動子GmMYB363P，所用引物為
[0048] 正向：5' -AAGCTTATCTACCACGGAGACAA-3' ；
[0049] 反向：5, -GGATCCGGATCTATCTTTGCCTT-3，。
[0050] 將鑒定結果表明含有SEQ ID No. 1的第1-1384位所示的啟動子GmMYB363P的重 組農桿菌命名為K599/GmMYB363P。
[0051] 2)大豆科豐1號種子播種于蛭石中，待長出2片真葉待用。
[0052] 3)在含有50mg/L卡那霉素的LB固體培養基中劃線活化K599/GmMYB363P，挑單菌 落在含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中搖菌過夜，得到K599/GmMYB363P發根農桿菌 菌液。
[0053] 4)用步驟3)得到的K599/GmMYB363P發根農桿菌菌液，用注射器接種6天含兩片 真葉的步驟2)獲得的大豆幼苗，保濕生長：光照16小時，溫度25°C，濕度50%。2周后，長 出毛狀根。
[0054] 當毛狀根長度為5 - 10厘米時，剪去老根，新的毛狀根即為轉化的根，可進一步用 于鑒定。
[0055] 將新的轉pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根分為兩組，每組10根，一組 置于水中培養，一組置于4%PEG6000水溶液中，12小時后分別進行⑶S染色。將毛狀根 直接放在下列染色液：50!111似?04?!17.2水溶液，21111乂1111(3,0.511111^^(0幻 6，&11(1 0.5mM K4Fe (CN)6中，37°C過夜，毛狀根經系列濃度70、50、30%乙醇洗(脫色），之后 放在重蒸水中，觀察，結果如圖2所示，可以看出，經GUS染色表明在水中培養12小時的 轉pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根顯示⑶S染色較淺，表明GmMYB363P啟動子驅 動⑶S基因的表達較弱；而在4%PEG6000水溶液處理12小時后，GmMYB363P啟動子受誘 導，驅動⑶S基因的表達，因此轉基因毛狀根經染色后呈現明顯的深藍色。按照Cote等 方法（Cote C et al. , An improved MUG fluorescent assay for the determination of the GUS activity within transgenic tissue of woody plants, Plant Cell R印·，2003, 21 (6)，619-624)對水中培養 12 小時的轉 pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S 毛狀根和在4%PEG6000水溶液處理12小時的轉pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀 根進行GUS基因表達的熒光定量分析，結果顯示在4%PEG6000水溶液培養12小時的轉 pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S 毛狀根的⑶S 活性值為 287±20nmol 4-MU mirT1!!^1 蛋白， 水中培養12小時的轉pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根的⑶S活性值為64± 13nmol 4-MU 蛋白，⑶S基因的表達在PEG模擬的干旱脅迫情況下是水中（正常情況）的 4. 5倍。上述結果表明啟動子GmMYB363P受干旱誘導。
[0056] 聚乙二醇6000 (PEG6000)是親水性大分子，具有很強的吸水性，可以使植物失水， 造成干旱脅迫。所以本實施例采用PEG6000來模擬干旱。
【權利要求】
1. 如下a)、b)或C)的DNA分子： a) 核苷酸序列是SEQ ID No. 1的DNA分子； b) 與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有啟動子功能的DNA分 子； c) 在高嚴謹條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA分子。
2. 含有權利要求1所述DNA分子的表達盒。
3. 含有權利要求1所述DNA分子的重組載體，或含有權利要求2所述表達盒的重組載 體。
4. 含有權利要求1所述DNA分子的重組微生物、含有權利要求2所述表達盒的重組微 生物、或含有權利要求3所述重組載體的重組微生物。
5. 含有權利要求1所述DNA分子的轉基因細胞系、含有權利要求2所述表達盒的轉基 因細胞系、或含有權利要求3所述重組載體的轉基因細胞系。
6. 擴增權利要求1所述的DNA分子全長或其任一片段的引物對。
7. 權利要求1所述的DNA分子作為啟動子的應用。
8. 權利要求1所述的DNA分子在干旱脅迫誘導下啟動目的基因在植物中表達的應用。
9. 權利要求1所述的DNA分子在培育轉基因植物中的應用。
10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于：所述轉基因植物為轉基因大豆。
【文檔編號】C12N15/113GK104152454SQ201310174327
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月13日 優先權日:2013年5月13日
【發明者】張勁松, 陳受宜, 李擎天, 馬彪, 劉云峰, 張萬科, 林晴, 何鍶潔 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所