專利名稱：表達疏綿狀嗜熱絲胞菌脂肪酶突變體的酵母工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程，具體地說，是以疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)脂肪酶LGY工程菌GS-LGY為出發(fā)菌株，通過定向進化方法篩選到一株表達酶活提高的畢赤酵母工程菌株P(guān)ichia pastoris GS-LGYM。
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3)，全稱三酰甘油酰基水解酶，廣泛存在于生物體內(nèi)。脂肪酶底物是甘油酯類，水解位點是甘油和12個碳原子以上不溶性長鏈脂肪酸所形成的酯鍵，能夠分解生物產(chǎn)生的各類天然油和脂肪。作為一種界面酶，脂肪酶的水解反應(yīng)只發(fā)生在油-水界面上，即水溶性的酶在水不溶的底物和水的界面上催化反應(yīng)。微生物來源的脂肪酶由于作用多樣、易于培養(yǎng)、產(chǎn)量豐富等特點而被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)，其中熱穩(wěn)定脂肪酶的研究和開發(fā)更是具有重要的商業(yè)價值。

疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus),它分布廣泛，生長上限較高,產(chǎn)生的脂肪酶具有較高的工業(yè)價值。T.lanuginosus脂肪酶能在畢赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表達產(chǎn)物同樣具有原始菌株T.lanuginosus脂肪酶的優(yōu)良特性。定向進化具體應(yīng)用到酯酶和脂肪酶的改造上的成功的方法和策略，以及近些年來，所取得了重要研究進展。定向進化技術(shù)已經(jīng)在酯酶和脂肪酶性質(zhì)改造領(lǐng)域取得的巨大成功，主要集中于提高酶的催化反應(yīng)活性，改進底物特異性，提高熱穩(wěn)定性，對映立體選擇性等方面。

發(fā)明內(nèi)容
以表達疏綿狀嗜熱絲孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶LGY的畢赤酵母工程菌GS-LGY為出發(fā)菌株，利用定向進化的方法對其進行分子改造。并通過高通量篩選方法最后篩選出一株正向突變菌株GS-LGYM，對此工程菌進行發(fā)酵，通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等步驟純化了突變蛋白并測定酶活，結(jié)果其酶活是野生菌株所產(chǎn)酶活力的
2.3倍。對此突變基因進行測序，并與野生基因比較得出，GS-LGYM中脂肪酶基因較原始的脂肪酶基因Igy有三個堿基發(fā)生改變，分別是第287為由G變?yōu)門 (密碼子由GGG變?yōu)镚TG)，第575位由T變?yōu)镃 (密碼子由GAT變?yōu)镚CA)，第741位由T變?yōu)镃 (密碼子由CGT變?yōu)镃GC)。其中前兩個堿基的變化引起了氨基酸的變化，分別是第96位氨基酸由甘氨酸(Gly, G)變?yōu)槔i氨酸(Val，V)，第192位氨基酸由丙氨酸(Ala，A)變?yōu)槔i氨酸(Val，V)。第741位堿基雖然改變，但是編碼的氨基酸都是天冬氨酸(Asp，D)未發(fā)生改變。


:圖1:易錯PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳泳道M:Marker-DL2000其他泳道:cDNA(ORF)
圖2:平板透明圈法篩選酵母轉(zhuǎn)化子圖3:含G418的YPD平板篩選酵母轉(zhuǎn)化子圖4 =GS-LGYM 表達脂肪酶的 SDS-PAGE泳道M:低分子量蛋白Marker泳道1-7:酵母工程菌Pichia pastoris GS-LGYM的誘導(dǎo)7天的表達情況圖5 =GS-LGY與GS-LGYM酶液的酶活力比較圖6 =GS-LGY與GS-LGYM脂肪酶氨基酸序列比對
具體實施方式
:實施例1:疏綿狀嗜熱絲孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶LGY突變體庫的構(gòu)建(I)易錯PCR及 條件摸索:采用易錯PCR法對目的基因進行改造。引物為:上游引物L(fēng)GY-5’:5’-TTGCTACGTAAGTCCTATTCGTCGAGAG-3’ (SnaBI)下游引物L(fēng)GY-3’:5’ -GGCCTAGGCTAAAGACATGTCCCAATT-3’ (AvrII)易錯PCR反應(yīng)體系摸索:50yL體系中含I XTaqDNA聚合酶緩沖液、0.2mmol/L
dATP 和 dGTP，1.0mmoI/L dCTP 和 dTTP，10 μ mol/L 上下游引物、4-7mmol/LMg2+、0-5mmol/L
MnCl2模板DNA從質(zhì)粒擴增獲得。PCR反應(yīng)體系:
IOx PCR Buffer5 μ
Taq DNA聚合酶Ιμ
dCTP、dTTP 各 μΙ
dATP、dGTP 各\μΙ
模板DNA2μ
上游引物2μΙ
下游引物2pL
25 mmoL/L MgCi24-7 ^iL
5 mmoL/L MnCl20-0.5 μL
ddH20to 50 μLPCR反應(yīng)條件:
權(quán)利要求
1.一種酶活提高的疏綿狀嗜熱絲胞菌Thermomyces Ianuginosus脂肪酶LGY突變畢赤酵母工程菌株，其特征是該菌為一種畢赤酵母，以野生工程菌GS-LGY為出發(fā)菌，采用定向進化和高通量篩選方法，獲得一株是野生菌株所產(chǎn)脂肪酶酶活力的2.3倍的突變菌株。測序與野生基因比較，有3個堿基位點發(fā)生變化，其中兩個位點引起氨基酸的變化，它們是G96V，A192V。最終將此突變工程菌株 命名為GS-LGYM。
全文摘要
本研究利用定向進化的方法對疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶LGY進行分子改造。采用易錯PCR方法，建立了含有14755個轉(zhuǎn)化子的突變體庫。以高活力為篩選壓力，通過三丁酸甘油酯平板透明圈法、G418平板、小量發(fā)酵篩選和大量發(fā)酵測酶活，最后篩選出一株正向突變菌株，對此工程菌進行發(fā)酵，通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等步驟純化了突變蛋白并測定酶活，結(jié)果其酶活是野生菌株所產(chǎn)酶活力的2.3倍。對此突變基因進行測得的序列，并與野生基因比較，有3個堿基位點發(fā)生變化，其中兩個位點引起氨基酸的變化，它們是G96V，A192V。將這株定點突變工程菌株最終命名為GS-LGYM。
文檔編號C12R1/645GK103243038SQ20131020491
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月28日
發(fā)明者李多川, 李安娜, 韓雙 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)