一株根瘤菌及其在檸條育苗中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株根瘤菌及其在檸條育苗中的應用。本發明提供的楊凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)CCBAU01603，其保藏編號為CGMCC No.7895。本發明還保護所述菌株在促進檸條生長中的應用、在檸條育苗中的應用。本發明還保護一種菌劑，為培養所述菌株得到的整個培養體系。本發明的優點：（1）為生產上提供了生長速度快速的檸條根瘤菌，添補了國內外缺乏快生型檸條根瘤菌的空白；（2）革新了傳統的檸條種植方式，增加了育苗并接種根瘤菌的工作，保證了檸條的結瘤率，促進了檸條在荒漠環境中的健康成長；（3）有利于在荒山、荒漠區以及道路綠化等過程中通過種植結瘤的檸條植株達到促進生態恢復和保護生態環境的目的。CGMCC No.78952013.07.08
【專利說明】一株根瘤菌及其在檸條育苗中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株根瘤菌及其在檸條育苗中的應用。

【背景技術】
[0002] 根瘤菌是一類能與豆科植物結瘤共生的固氮細菌。當與合適的豆科植物共生時， 根瘤菌固定空氣中的氮氣為氨，從而為豆科植物提供氮素營養，而豆科植物則通過光合作 用為根瘤菌提供碳水化合物和能量，兩者形成了很好的共生關系。
[0003] 由于根瘤菌與豆科植物之間存在著相互識別作用，且這種作用又受到地理環境和 土壤理化因子的影響，因此需要選育適合豆科植物且適應環境的根瘤菌，才能達到兩者之 間互惠互利的共生效果。在從未種植過豆科植物的土壤內種植豆科植物,需要接種合適的 根瘤菌才能保障豆科植物良好地生長。
[0004] 檸條是一種很好的防風固沙豆科植物，它在荒漠改良、生態保護、荒山改造中起著 重要的作用。檸條根系發達，入地深達數米以上，抗擊風沙和沙埋的能力強。多年生的檸條 還可作為牛羊的飼料，檸條莖可編筐、造紙、制作復合板材或作為碳薪材料。
[0005] 由于檸條多在貧瘠的荒漠地區生長，而通過人工施肥又存在著缺少肥源，施肥困 難等諸多問題，因此解決檸條在荒漠地區良好生長的重要措施就是在種植初期使其與根瘤 菌結瘤，形成共生固氮體系，再移植到合適的種植區，通過合理的養護管理，就能達到提高 檸條的存活率、促進檸條健康生長，在荒漠綠化，改善生態環境中發揮重要的作用。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一株根瘤菌及其在檸條育苗中的應用。
[0007] 本發明提供的楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)CCBAU01603,已于 2013 年 7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北 京市朝陽區北辰西路1號院3號)，其保藏編號為CGMCC No. 7895。楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)CCBAUO1603 簡稱菌株 CCBAUO1603。
[0008] 本發明還保護菌株CCBAU01603在促進檸條生長中的應用。
[0009] 本發明還保護菌株CCBAUO1603在檸條育苗中的應用。
[0010] 本發明還保護一種用于培養所述菌株CCBAUO1603的培養基（YIA培養基)，為采用 如下方法制備得到的培養基：取肌醇8-12g、酵母粉2-4g、MgS040. 1-0 . 3g、NaC10. 05-0. 15g、 K2HPO4O. 15-0. 35g和KH2PO4O. 15-0. 35g，溶于水并用定容到1000ml。所述YIA培養基具 體可為采用如下方法制備得到的培養基：取肌醇l〇g、酵母粉3g、MgSO 4O. 2g、NaClO. lg、 K2HPO4O. 25g和KH2PO4O. 25g，溶于水并用定容到1000ml。所述培養基的pH具體可為7· 0。
[0011] 本發明還保護一種菌劑，為培養菌株CCBAU01603得到的整個培養體系。
[0012] 所述菌劑具體可為采用如下方法制備得到的菌劑：（1)將菌株CCBAUO1603接種至 所述YIA培養基，28°C、160轉/分鐘振蕩培養48小時；（2)取步驟（1)的整個培養體系，每 1000毫升加入1毫升微量元素溶液，得到菌劑。所述微量元素溶液的制備方法具體如下： 取 Η3Β042· 86g、MnSO4L 81g、CuSO4 · 5Η200· 8g、ZnSO4O. 22g、H2MoO4O. 02g，溶于水并用定容至 1000ml。
[0013] 本發明還保護所述菌劑在促進檸條生長中的應用。
[0014] 本發明還保護所述菌劑在檸條育苗中的應用。應用所述菌劑進行檸條育苗的方法 具體如下：（1)用所述菌劑噴灑檸條種子，使根瘤菌吸附于種子表面；（2)育苗，使根瘤菌在 檸條根系上結瘤，形成結瘤幼苗；（3)幼苗的田間移栽；（4)田間管理，確保植株成活。室內 及田間試驗的結果均表明，應用本發明提供的菌劑后，可顯著提高檸條的成活率和結瘤率， 并促進檸條的生長。
[0015] 本發明的發明人通過根瘤菌的分離、培養、遺傳、表型等研究,找到一株高效結瘤 固氮、且適應鹽堿環境的檸條快生型根瘤菌。本發明的優點：（1)為生產上提供了生長速度 快速的檸條根瘤菌，添補了國內外缺乏快生型檸條根瘤菌的空白；（2)革新了傳統的檸條 種植方式，增加了育苗并接種根瘤菌的工作，保證了檸條的結瘤率，促進了檸條在荒漠環境 中的健康成長，獲得更多的氮素營養；（3)通過本發明的實施，有利于在荒山、荒漠區及道 路綠化中等過程中通過種植結瘤的檸條植株達到促進生態恢復和保護生態環境的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為播種45天后，每株植株的結瘤數目統計結果。
[0017] 圖2為播種45天后，每株植株的根瘤鮮重統計結果。
[0018] 圖3為播種45天后，每株植株的地上部分干重統計結果。
[0019] 圖4為播種45天后，每株植株的地上部分株高統計結果。

【具體實施方式】
[0020] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置15次重復實驗，結果做 統計學分析。朽 1條(學名：Caragana microphylla;俗稱小葉錦雞兒）：內蒙古鄂爾多斯市碧 森種業有限公司。沙土：采集自內蒙古鄂爾多斯市中科院沙地生態試驗站。
[0021] 實施例1、根瘤菌的獲得和鑒定 [0022] 一、根瘤菌的獲得
[0023] 2011年7月從內蒙古鄂爾多斯中科院野外生態試驗站的沙地中采集沙土樣品， 帶回中國農業大學根瘤菌研究中心。將表面消毒的檸條種子種植到采集的沙土中，一個 月后植株結瘤固氮。將根瘤取下，經表面消毒后，用YIA培養基分離其中的根瘤菌。經純 化并經后續的鑒定、回接結瘤驗證后，將一株在YIA固體培養基上生長快速的菌株命名為 CCBAUO1603,該菌株為對于檸條具有高效結瘤固氮的作用。
[0024] 二、根瘤菌的鑒定
[0025] 革蘭氏染色法染色結果為陰性；不產生芽孢。生長速度快于慢生型根瘤菌，在?Α 液體培養基及28°C條件下培養時，代時為6. 08小時。
[0026] 菌株CCBAU01603的部分測序結果見序列表的序列1，與楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)同源性最高。
[0027] 綜合以上鑒定結果，菌株CCBAU01603為楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)。
[0028] 三、根瘤菌的保藏
[0029] 楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)CCBAU01603,已于 2013 年 7 月 8 日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北 辰西路1號院3號），保藏號為CGMCC No. 7895。楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense) CCBAUO1603 簡稱菌株 CCBAUO1603。
[0030] 實施例2、菌株CCBAU01603的應用
[0031] 一、培養基的制備
[0032] YIA培養基，全稱為"Yeast-Inositol-Agar"培養基，中文全稱為"酵母粉-肌 醇-瓊脂"培養基。
[0033] YIA液體培養基的制備方法：取肌醇10g、酵母粉3g、MgSO4O. 2g、NaClO. lg、 K2HPO4O. 25g和KH2PO4O. 25g溶于蒸餾水，并用蒸餾水定容到1000ml ;ρΗ7· 0。
[0034] YIA固體培養基的制備方法：在液體培養基的基礎上，每升加入15_20g瓊脂粉。
[0035] 常規的用于根瘤菌的培養的培養基為YMA培養基（全稱為 "Yeast-Mannitol-Agar"培養基；中文全稱為"酵母粉-甘露醇-瓊脂"培養基）。YIA與 YM之間的差別僅在于碳源種類的不同，YIA培養基中碳源為肌醇，YM培養基中，碳源為甘 露醇。
[0036] 本發明的實施例中使用YIA培養基，因為在YIA培養基中，肌醇充當根瘤菌生長的 碳源，而豆科植物根系又可分泌此物質，同時肌醇還可做為根瘤菌與植物之間的分子對話 的信號分子以及根瘤菌生長的生長因子。YMA培養基中，甘露醇僅做為根瘤菌生長的碳源， 未見報到有其它功能。如果未能得到肌醇，可以使用YM培養基培養菌株CCBAU01603,菌株 也能生長良好。
[0037] 二、根瘤菌菌劑的制備
[0038] 1、菌株活化
[0039] 將4°C冰箱保存于YIA固體斜面上的菌株CCBAU01603轉接到新鮮配制的?Α固體 培養基平板上，劃線出單菌落。4°C冰箱保存時，保存時間不應長于3個月。
[0040] 2、擴大培養
[0041] 用滅菌后的接種環挑取上述平板上的單菌落一到兩環，接種至200ml滅菌后的 YIA液體培養基，28°C、160轉/分鐘振蕩培養48小時。
[0042] 3、根瘤菌菌劑的獲得
[0043] 取步驟2的整個培養體系，每1000毫升的上述培養體系加入1毫升滅菌后的微量 元素溶液，得到根瘤菌菌劑。
[0044] 微量元素溶液的制備方法：取 Η3Β042· 86g、MnSO4L 81g、CuSO4 · 5Η200· 8g、 ZnSO4O. 22g、H2MoO4O. 02g，溶于蒸餾水，并用蒸餾水定容到1000ml。
[0045] 培養體系與微量元素與微量元素溶液混合均勻可直接使用（本發明中直接使用）， 如短期存放，最好4-8°C保存，也可存在放于通風陰涼的地方，勿在陽光下曝曬，建議在1-2 周內使用完畢。
[0046] 三、根瘤菌菌劑的應用
[0047] 1、苗床整理
[0048] 第一組：將干濕度合適的沙土 (水份控制在10%以下）過10目的篩子，然后均勻鋪 到苗床上，苗床的深度以30-50厘米為宜。
[0049] 第二組：將直徑為0. 75-1. Omm的蛭石均勻鋪到苗床上，苗床的深度以30-50厘米 為宜。
[0050] 2、用根瘤菌菌劑噴灑檸條種子
[0051] 實驗時間為4月初至4月中旬，實驗地點為北京中國農業大學根瘤菌研究中心。
[0052] 挑選健康、飽滿、粒度大小一致的檸條種子，置于干凈塑料盆中，在陰涼處用噴霧 器將步驟二制備得到的根瘤菌菌劑噴灑于檸條種子表面，確保每粒種子都粘上菌劑。
[0053] 實際應用中，也可將根瘤菌菌劑搖勻后，取適量倒到種子表面，然后攪拌均勻。
[0054] 粘有根瘤菌菌劑的種子不宜在陽光下暴曬。
[0055] 3、播種
[0056] 第一組實驗組（Sandy_01603組）：將步驟2中噴灑了根瘤菌菌劑的種子均勻播灑 到步驟1制備的第一組苗床上，每粒種子占據5cmX 5cm的面積，種子表面均勻覆蓋一層 l-2cm厚的濕度為20%左右的過10目篩后的沙子，將窗紗蓋到苗床上，并與苗床保持20cm 的距離，防止鳥兒刨食，再在苗床上噴灑適量的水份。
[0057] 第一組對照組（Sandy_CK組):將檸條種子(未進行步驟2的處理)均勻播灑到步驟 1制備的第一組苗床上，每粒種子占據5cmX 5cm的面積，種子表面均勻覆蓋一層l-2cm厚的 濕度為20%左右的過10目篩后的沙子，將窗紗蓋到苗床上，并與苗床保持20cm的距離，防 止鳥兒刨食，再在苗床上噴灑適量的水份。
[0058] 第二組實驗組（Vml_01603組）：用第二組苗床代替第一組苗床，且用"種子表面均 勻覆蓋一層l-2cm厚的粒徑為0. 75-1. OOmm的蛭石"代替"種子表面均勻覆蓋一層l-2cm厚 的濕度為20%左右的過10目篩后的沙子"，其它共第一組實驗組。
[0059] 第二組對照組（Vml_CK組):用第二組苗床代替第一組苗床，且用"種子表面均勻覆 蓋一層l-2cm厚的粒徑為0. 75-1. OOmm的蛭石"代替"種子表面均勻覆蓋一層l-2cm厚的 濕度為20%左右的過10目篩后的沙子"，其它共第一組對照組。
[0060] 4、育苗
[0061] 播種后3-5天即可出苗，根據天氣情況適時澆水，育苗時間為1. 5-2個月，以45天 為宜，以形成結瘤苗。結瘤苗形成后，可以統計結瘤數目、根瘤鮮重、地上部分干重、地上部 分株1?、葉片葉綠素含量等指標。
[0062] 播種45天后，每株植株的結瘤數目統計結果見圖1 (每組統計15株植株)，每株植 株的根瘤鮮重（g)統計結果見圖2 (每組統計15株植株)，每株植株的地上部分干重（g)統 計結果見圖3 (每組統計15株植株)，每株植株的地上部分株高（cm)統計結果見圖4 (每組 統計15株植株)。圖1至圖4中，每個柱子上的橫線為標準差。橫線上面的字母(即a，b，c，d 及不同組合)代表不同處理的差異是否顯著（P=〇. 05水平），如果為不同的字母則表示處理 間有顯著差異，如果有相同的字母則表示處理間的差異不顯著。
[0063] 結果表明，以蛭石為基質時，施加根瘤菌菌劑后，植株的各項生物學指標(包括結 瘤數目、根瘤鮮重、地上部分株高、地上部分干重）均明顯高于不施加根瘤菌菌劑的對照處 理，且差異顯著。結果表明，以沙土為基質時，施加根瘤菌菌劑后，植株的各項生物學指標 (包括結瘤數目、根瘤鮮重、地上部分干重)均高于不施加根瘤菌菌劑的對照處理，且差異顯 著。結果表明，以沙土為基質時，施加根瘤菌菌劑后，植株的地上部分株高高于不施加根瘤 菌菌劑的對照處理。
[0064] 5、田間移植與管理
[0065] 將完成育苗的幼苗用鐵鍬小心挖出，勿傷及根系，將幼苗放入合適的容器(如塑料 袋）中，保持一定的濕度，盡快移植到田間。田間種植時，可以行播，每穴3-5株，穴間距為1 米。移植后要根據情況及時澆水，以保證植株成活。植株成活后，第一年要防止牲畜啃食， 如果植株得病要及時進行防治，禁止采伐3年后方可解除圍封禁牧。
【權利要求】
1. 楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)CCBAU01603,其保藏編號為 CGMCC No.7895。
2. 權利要求1所述菌株在促進檸條生長中的應用。
3. 權利要求1所述菌株在檸條育苗中的應用。
4. 用于培養權利要求1所述菌株的培養基，為采用如下方法制備得到的培養基： 取肌醇 8-12g、酵母粉 2-4g、MgS040. 1-0 . 3g、NaClO. 05-0. 15g、Κ2ΗΡ040· 15-0. 35g 和 ΚΗ2Ρ040· 15-0. 35g，溶于水并用定容到1000ml。
5. -種菌劑，為培養權利要求1所述菌株得到的整個培養體系。
6. 權利要求5所述菌劑在促進檸條生長中的應用。
7. 權利要求5所述菌劑在檸條育苗中的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK104277992SQ201310292237
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月12日 優先權日:2013年7月12日
【發明者】陳文峰, 崔清國, 冀照君, 嚴慧, 陳文新 申請人:中國農業大學, 中國科學院植物研究所