同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體(獨立融合表達型)的制作方法
【專利摘要】本發明涉及同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-IRES-EGFP?substantive?fusion(獨立融合表達型)。它是在pIRES2-EGFP的基礎上，將DsRed2、IRES經重疊延伸PCR和基因亞克隆操作而得。將目的基因克隆入本載體的DsRed2?3`端MCS1區或EGFP5`端MCS2區并轉染細胞，pCMV啟動轉錄包含DsRed2或DsRed2及其3`端融合目的基因、IRES和EGFP或EGFP及其5`端目的基因的全長mRNA，含DsRed2部分由5`帽子結構起始翻譯，EGFP部分由IRES介導獨立翻譯。成熟蛋白中的融合DsRed2或EGFP能被目的基因產物攜帶在細胞內進行轉運、分布，并對該過程進行示蹤。優化的兩MCS序列適合更廣泛外源基因片段的克隆操作；DsRed2和EGFP的檢測時效范圍寬，且相互獨立、互為表征，成像效果清晰、鮮明，使實驗操作更簡便、高效。
【專利說明】同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體(獨立融合表達型)
【技術領域】
[0001]本發明涉及同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體(獨立融合表達型)，是用于目的基因片段的表達并對其在細胞中的分布進行定位的載體質粒。
【背景技術】
[0002]鑒于熒光蛋白基因在活細胞中的表達產物具有生物活性穩定、信號特異性強、有效活性維持時間長、方便檢測和與融合共性外源基因相互影響小等特點，基因工程中常用作生物篩選標記，來研究外源目的基因的表達及其蛋白產物的胞內分布和定位。通常情況下，同一報告基因載體中僅含有一個熒光蛋白基因，將目的DNA片段克隆到熒光蛋白基因的N端或C端,構建的重組質粒轉染相應宿主細胞，通過檢測突光蛋白的表達即可判定目的核酸片段是否具有相應功能，但難以同時進行在熒光蛋白基因的N端或C端進行表達，也難以同步反映重組報告基因質粒的轉染效率和判定目的基因的生物活性。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-1RES_EGFP substantive fusion(獨立融合表達型)，已于 2013 年 05 月 17 日送藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，分類命名大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏號CGMCC7627。
[0004]本發明構建同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體(獨立融合表達型)所采用的技術方案是:利用基因克隆技術，在親本載體PIRES2-EGFP啟動子pCMV與SV40polyA序列之間置換入如下DNA序列:自5'至3'方向依次插入紅色突光蛋白基因DsRed2、多克隆酶切位點序列 MCSl (包括 Mlu 1、Sal 1、Spe 1、Sca 1、Bgl 11,Xho 1、Sac I, Xba I)、IRES、綠色熒光蛋白基因 EGFP 和 MCS2(包括 EcoR 1、Pvu I, EcoRV, Sac I1、BamH 1、Sma 1、NheI)(如SEQ N0.1中的第591-2642nt)，獲得如SEQ N0.1 (第l_5980nt)所示核苷酸序列的同向串聯共表達雙色熒光蛋白的新型報告基因載體質粒pDsRed2-1RES-EGFP substantivefusion (獨立融合表達型)。
[0005]所述同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體(獨立融合表達型)的DNA分子也屬于本發明的保護范圍。
[0006]含有所述載體分子、所述重組報告基因載體的轉基因重組菌或細胞也屬于本發明的保護范圍。
[0007]本發明的同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體(獨立融合表達型)具備經直接酶切、連接構建插入目的基因的重組報告基因質粒及轉染細胞等簡單操作，就可以用于分析和鑒定目的基因生物活性的功用:由PCMV啟動轉錄的多順反子mRNA中，在上游紅色熒光蛋白基因DsRed2的3'端MCSl和下游綠色熒光蛋白基因EGFP的5'端MCS2中，皆可插入外源目的基因序列進行融合式共表達，DsRed2或EGFP對目的基因的表達及其蛋白產物的生物活性沒有明顯影響，方便對多基因共表達及其蛋白活性分析和多基因產物相互關系的研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-1RES_EGFPsubstantive fusion(獨立融合表達型)的構建圖譜。
[0009]圖2各載體質粒轉染CHO細胞的熒光檢測結果。
【具體實施方式】
[0010]下述實施例中如無特殊說明，所用方法均為常規基因克隆方法，所用試劑均可經商業途徑購得。
[0011]實施例
[0012]1.載體骨架的PCR擴增與克隆
[0013]在載體plRES2-EGFP(PT3267-5，Clontech)和 pDsRed2_Cl (PT3603-5, Clontech)的基礎上，設計在pCMV末端重疊部分DsRed25'序列的引物VRf-R、rGF F-EvSBaSN,經PCR反應擴增缺失MCS、IRES片段的載體骨架(包括pCMV、PUC or1、Kan/Neo、SV40polyA功能或基因序列):
[0014]VRf-R : 5'-GTGATGACGTTCTCGGAGGAGGCCATGGTGATCTGACGGTTCACTAAACCAGCTCTG-3'。
[0015]rGF F-EvSBaSN:5' -TTATAATTATGATATCCGCGGATCCCGGGAGCTAGCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3'，(含有 EcoRV、Sac I1、BamH 1、SmaI 和 Nhe I 的識別位點);
[0016]25μ I 反應體系的組成是:雙蒸水 15.Ομ 1，Ex TaqlO X Buff er2.5 μ I,dNTPs2.0 μ 1，MgCl2L 5 μ 1，rGFF-EvSBaSNl.0 μ 1，VRf-Rl.0 μ 1，pIRES2_EGFPTE 溶液
1.Ομ I, ExTaql.0y I。PCR 反應條件是 95°C 5min ；95°C 50sec,55°C 50sec,72°C 5min，共32個循環；最后經72°C 15min充分延伸后冷卻至4°C保存。
[0017]PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離大小為4709bp的PCR產物，切膠回收后與PMD18-T Simple Vector連接構建重組克隆。經常規轉化經CaCl2制備的DH5 α感受態細胞，涂布含Ampicillin (100 μ g/ml)的LB固體平板，37°C過夜培養。選取平板上優勢抗性生長的單菌落，用引物rGF F-EvSBaSN、VRf-R做菌落PCR檢測。挑取陽性克隆菌落，在含Ampicillin (100 μ g/ml)的LB液體培養基中過夜擴增，提取質粒分別進行EcoR 1、BamH I單酶切反應，鑒定載體質粒psT-V。
[0018]2.DsRed2的PCR擴增與克隆
[0019]以載體pDsRed2_Cl (PT3603-5, Clontech)為模板，設計5'端重疊部分PIRES2-EGFP pCMV 末端的引物 rDsR F、rDR R-MSSSBg 擴增 DsRed2 基因(723nt):
[0020]rDsR F:5'-GTTTAGTGAACCGTCAGATCACCATGGCCTCCTCCGAGAAC-3' ；
[0021]rDR R-MSSSBg:5'-TAAGATCTAGTACTAGTCGACGCGTCAGGAACAGGTGGTGGCGGC-3'，(含有 Mlu 1、Sal 1、Spe 1、Sca 1、Bgl II 識別位點)。
[0022]PCR 反應體系是:雙蒸水 15.0 μ 1，Ex TaqlOxBuff er2.5 μ 1，dNTPs2.0μ I,MgCl2L 5 μ 1，DsRed2Fl.0μ 1，DsRed2Rl.0μ 1，pDsRed2_ClTE 溶液 1.0 μ 1，Ex Taql.0 μ I。PCR 擴增條件是 95 °C 5min ；95 °C 50sec,55°C 50sec,72°C 50sec,共 32 個循環；最后經72°C IOmin充分延伸后冷卻至4°C保存。
[0023]PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收后與pMD18-T Simple Vector連接。連接產物經常規轉化經CaCl2制備的DH5a感受態細胞，涂布含Ampicillin的LB固體平板，37°C過夜培養。用引物rDsR F、rDR R-MSSSBg做菌落PCR檢測，陽性克隆菌落經含Ampicillin LB液體培養基擴增，提取質粒分別進行Mlu 1、Bgl II單酶切，鑒定重組質粒psT_DsRed2m。
[0024]3.重疊延伸PCR擴增載體骨架與DsRed2的串聯片段及其克隆
[0025]以psT-V 和 psT-DsRed2m 為模板，用引物 rGF F-EvSBaSN,rDR R-MSSSBg 進行重疊延伸PCR擴增載體骨架與DsRed2的串聯片段(5382nt)。
[0026]PCR 反應體系是:雙蒸水 15.0μ 1，Ex Taq 10 X Buf f er2.5 μ I, dNTPs2.0 μ I,MgCl2L 5 μ 1，rGF F-EvSBaSNl.0 μ I, rDR R-MSSSBgl.Ομ I, psT-V TE 溶液 0.5 μ 1，psT-DsRed2m TE 溶液 0.5 μ 1，Ex Taql.0 μ L.PCR 擴增條件是 95 °C 5mira95 °C 50sec，55°C50sec，72°C5min50sec，共32個循環；最后經72°C 15min充分延伸后冷卻至4°C保存。
[0027]PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收后與pMD18_T Simple Vector連接。連接產物經常規轉化經CaCl2制備的DH5 α感受態細胞，涂布含Ampicillin的LB固體平板，37°C過夜培養。用引物rGF F-EvSBaSN, rDR R-MSSSBg做菌落PCR檢測，陽性克隆菌落經在含Ampicillin LB液體培養基擴增，提取質粒進行EcoR V、Mlu I雙酶切反應，鑒定重組質粒psT-V_DsRed2。
[0028]4.1RES的PCR擴增與克隆
[0029]以載體plRES2- EGFP(PT3267-5，Clontech)為模板，用引物 rlRES F-BgXhSXb,rlRES R-EiPvEv 進行 PCR 擴增 IRES 片段(637bp):
[0030]rRES F-BgXhSXb:5'-TATATTAAGATCTCGAGCTCTAGAGCCCCTCTCCCTCCCCCCC-3' ；
[0031]rRES R-EiPvEv:5'-GGCGCCGCGGATATCGATCGAATTCCATTGTGGCCATATTATCATCG-3'。
[0032]PCR 反應體系是:雙蒸水 15.0 μ I，Ex TaqlO X Buffer2.5 μ I，dNTPs2.Ομ I,MgCl2L 5 μ 1，rlRES F-BgXhSXb1.0 μ 1，rlRES R-EiPvEvl.0 μ 1，plRES2_EGFP TE 溶液 1.0μ 1，Ex Taql.0 μ I。PCR 擴增條件是 95 °C 5min ；95 °C 50sec，55 °C 50sec,72°C 5min50sec，共32個循環；最后經72°C IOmin充分延伸后冷卻至4°C保存。
[0033]PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收后與pMD18-T Simple Vector連接。連接產物經常規轉化經CaCl2制備的DH5a感受態細胞，涂布含Ampicillin的LB固體平板，37°C過夜培養。用引物rIRESF-BgXhSXb、rIRES R-EiPvEv做菌落PCR檢測，陽性克隆菌落經在含AmpiciHin LB液體培養基擴增，提取質粒進行Xho 1.EcoR I雙酶切反應，鑒定重組質粒psT-1RESm。
[0034]5.構建同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-1RES_EGFPsubstantive fusion (獨立融合表達型)
[0035]取psT-V_DsRed2、psT-1RESm同樣經Bgl I1、EcoR V雙酶切后的目的片段V-DsRed2Bg_v (5359bp)、IRESBg_v (621bp)，用 T4 連接酶進行連接。10 μ I 的反應體系是:IOXT4Bufferl.0 μ 1，V_DsRed2Bg_vl.0 μ 1，IRESBg_v7.0 μ 1，T4Iigasel.0 μ I。連接反應條件是16°C 4h，到時轉至4°C保存。[0036]連接產物常規轉化經CaCl2制備的DH5 α感受態細胞，涂布含Kanamycin (50 μ g/ml)的LB固體平板培養基，37°C過夜培養。到時挑取優勢抗性單克隆菌落經在含Kanamycin (50 μ g/ml)的LB液體培養基過夜培養，提取質粒分別進行Mlu I和EcoR 1、BglII和EcoR V組合的雙酶切反應，鑒定重組質粒pDsRed2-1RES_EGFP substantive fusion。
[0037]6.細胞轉染
[0038]取親本載體質粒pIRES2-EGFP、pDsRed2_Cl 和重組載體質粒 pDsRed2-1RES_EGFPsubstantive fusion、各約0.8 μ g,參照《分子克隆(第三版)》P1276-1281,用Lipofectamine轉染已長成單層的CHO細胞。24h后將轉染細胞置于突光顯微鏡下檢測綠色和紅色熒光蛋白的表達。
[0039]熒光檢測結果如圖2所示，親本載體質粒pDsRed2-Cl轉染的細胞中只有紅色熒光蛋白表達(圖2，B)，pIRES2-EGFP轉染的細胞中只有綠色熒光蛋白表達(圖2，C)，同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體質粒pDsRed2-1RES-EGFP substantive fusion轉染的細胞中紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白都有表達(圖2，D、E、F);同時以未轉染的空白CHO細胞作對照(圖2，A)。
[0040]圖2中，A:未轉染的空白CHO細胞，B:PDsRed2-Cl轉染的CHO細胞，C:PIRES2-EGFP 轉染的 CHO 細胞，D:pDsRed2-1RES-EGFP substantive fusion 轉染的 CHO 細胞中紅色突光蛋白表達效果，E:pDsRed2-1RES_EGFP substantive fusion轉染的CHO細胞中綠色突光蛋白表達效果，F:pDsRed2-1RES-EGFPsubstantive fusion轉染的CHO細胞中紅綠熒光蛋白表達后的疊加效果 。
【權利要求】
1.一種DNA分子，其特征是:經IRES序列串聯的可同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體 pDsRed2-1RES-EGFP substantive fusion (獨立融合表達型)，具有 SEQ N0.1 中第 591-2642nt 的 DNA 序列。
2.含有權利要求1所述報告基因載體質粒的構建方法。
3.根據權利要求2所述的報告基因載體質粒，其特征在于:pCMV下游連接有由IRES串聯獨立共表達的雙色熒光蛋白報告基因序列DsRed2-1RES-EGFP，其中在DsRed2基因3'末端、終止密碼子前含有優化的MCSl序列，在EGFP基因5'端、起始密碼子之后含有優化的MCS2序列，所述報告基因載體的核苷酸序列為SEQ N0.1中的第l_5980nt的DNA序列。
4.含有權利要求1所述報告基因載體質粒的轉基因細胞。
5.含有權利要求2或3所述報告基因載體質粒的轉基因細胞。
6.含有權利要求1所述報告基因載體質粒的重組菌。
7.含有權利要求2或3所述報告基因載體質粒的重組菌。
8.權利要求2或3 所述報告基因載體質粒在檢測目的基因功能中的應用。
【文檔編號】C12N1/15GK103468728SQ201310295917
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月12日 優先權日:2013年7月12日
【發明者】王玉, 姜世金, 于愛蓮, 于廣福, 施魯笛 申請人:泰山醫學院