一種甜瓜種子純度檢驗的方法
【專利摘要】本發明公開了一種甜瓜種子純度檢驗的方法，特別是一種利用SSR分子標記對金露三號甜瓜種子進行純度檢驗的方法。其利用一對SSR引物FLWSSRL和FLWSSRR對甜瓜雜交品種金露三號的父母本和雜交一代的基因組DNA進行擴增和瓊脂糖凝膠電泳分離，找出雜交一代與父母本差異的特征譜帶，通過受檢種子純度計算，對金露三號雜一代種子樣品進行檢驗，其檢驗的純度經與田間種植鑒定的純度對照比較，二者的結果高度一致。適用于對金露三號及其親本真實性和種子純度的檢驗。
【專利說明】一種甜瓜種子純度檢驗的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于種子質量檢驗【技術領域】，涉及雜交甜瓜種子純度檢驗的方法，特別是一種利用SSR分子標記對甜瓜金露三號種子進行純度檢驗的方法。
【背景技術】
[0002]金露三號是由合肥豐樂種業股份有限公司培育的高產優質雜交甜瓜新品種(詳見《遺傳資源來源披露登記表》)，具有優秀的田間農藝性狀。該品種在雜交制種過程當中，需要通過母本人工去雄，授以父本花粉來完成雜交過程，母本去雄不徹底或漏去雄，將會極大地影響制種純度。傳統的雜交種純度檢測方法為種植鑒定，依賴于品種表型差異，通過成株外觀形狀比較鑒定，鑒定時間長、費用高、難度較大和準確性差，特別是在田間表型鑒定主要依靠鑒定人員對相關品種及其親本的熟悉程度，是一種完全的經驗型判斷，鑒定人員本身素質的高低直接關系鑒定純度及鑒定成功與否，因此田間鑒定越來越不適宜現代種業的發展需要。
[0003]SSR(Simple Sequence Repeat)是在PCR(Polymerase Chain Reaction)基礎上發展起來的一種新的分子標記技術，具有高度多態性、共顯性、保守性、且僅需少量的DNA、操作簡便、重復性好、穩定可靠等優點，在動物、植物、微生物等研究領域中得到了廣泛應用，并已開始應用于甜瓜的遺傳多樣性分析及雜交種純度的鑒定研究。本研究利用金露三號雜交種與雙親在一些SSR位點上的差異，尋找合適的引物擴增出雜交種與雙親差異明顯的穩定條帶，用于金露三號的室內純度檢測。為金露三號純度鑒定提供一個準確、穩定、快捷、實用的檢測方法。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在·于提供一種能夠對甜瓜種子進行準確、穩定、快捷且實用的檢驗方法。
[0005]其技術方案是:一種甜瓜種子純度檢驗的方法，按下述步驟操作:
[0006]I) DNA 提取:
[0007]f)將甜瓜種子置于營養缽中發芽出苗，等到幼苗有2-3片真葉時，取2.5-3.5cm2的葉片于小研缽中，加入4XCTAB提取緩沖液將其研碎，轉入離心管，65°C水浴半小時；
[0008]g)加入與提取緩沖液等體積的的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，12000rpm離心10分鐘，吸其上清置于另一離心管，加入冰凍無水乙醇，_20°C冰柜內放置60分鐘沉淀DNA ；
[0009]h) 12000rpm離心10分鐘，棄上清；加濃度為75%的乙醇，靜置4分鐘去鹽，棄去乙醇；
[0010]i)離心管置于加熱通風烘箱中，65°C風干；
[0011]j)加滅菌雙蒸水溶解待用；
[0012]上述4XCTAB提取緩沖液由4%(w/v)的十六烷基三甲基溴化銨，1.4mol/L的氯化鈉 NaCl,0.lmol/L 的 Tris-Cl 緩沖液(pH8.0),0.02mol/L 的乙二胺四乙酸和 0.2%(v/v)的α-巰基乙醇構成；
[0013]上述苯酚-氯仿-異戊醇混合液由氯仿和異戊醇混合而成，其混合體積比為1:24: I ；
[0014]2) PCR 反應:
[0015]在PCR管中分別加入DNA模板、改性緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷、引物FLXGSSRL和FLXGSSRR、Taq酶及雙蒸水；先94°C預變性4分鐘；再94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，32個循環；72°C延伸7分鐘，95°C水浴4分鐘變性后置冰上；[0016]上述改性緩沖液為10 X PCR緩沖液+2 X 10^3mol/L氯化鎂；
[0017]上述引物FLXGSSRL 序列為 5’ -GATTCATTAGGCGGTGAG-3’ ；
[0018]上述引物FLXGSSRR 序列為 5’ -CGTGGGTTGATTGATGTTGT-3’ ；
[0019]3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測:
[0020]將瓊脂糖加入100ml的5 X TBE中攪拌混合均勻后加熱，配制成濃度為3%的瓊脂糖溶液，室溫下冷卻至55-65°C，每200ml瓊脂糖溶液中加入0.5μ g的核酸染料sybe GreenI，倒入專用瓊脂糖制膠模板內，插梳；待瓊脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，將凝膠放入具有1.5XTBE電泳液的電泳槽中，以電泳液高出凝膠0.5cm為宜，點樣；設定電壓200V,電泳半小時，關閉電源，使用紫外凝膠成像系統拍照；
[0021]4)受檢種子純度計算:
[0022]用上述方法分別獲取甜瓜雜交一代和親本種子電泳譜帶，計數受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數，并用下式計算受檢樣品的種子純度(％) =受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數/受檢種子總數X100%。
[0023]其技術效果是:本發明利用一對SSR引物FLXGSSRL和FLXGSSRR對甜瓜雜交品種金露三號的父母本和雜交一代的基因組DNA進行擴增和瓊脂糖凝膠電泳分離，找出雜交一代與父母本差異的特征譜帶，通過受檢種子純度計算，對金露三號雜一代種子樣品進行檢驗，其檢驗的純度經與田間種植鑒定的純度對照比較，二者的結果高度一致(詳見附表1)。
[0024]附表1:應用SSR分子標記室內檢測純度與田間種植鑒定純度對照表
[0025]
【權利要求】
1.一種甜瓜種子純度檢驗的方法，按下述步驟操作: 1)DNA提取: a)將甜瓜種子置于營養缽中發芽出苗，等到幼苗有2-3片真葉時，取2.5-3.5cm2的葉片于小研缽中，加入4XCTAB提取緩沖液將其研碎，轉入離心管，65°C水浴半小時； b)加入與提取緩沖液等體積的的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，12000rpm離心10分鐘，吸其上清置于另一離心管,加入冰凍無水乙醇，_20°C冰柜內放置60分鐘沉淀DNA ； c)12000rpm離心10分鐘，棄上清；加濃度為75%的乙醇，靜置4分鐘去鹽，棄去乙醇； d)離心管置于加熱通風烘箱中，65°C風干； e)加滅菌雙蒸水溶解待用； 上述4XCTAB提取緩沖液由4%(w/v)的十六烷基三甲基溴化銨，1.4mol/L的氯化鈉NaCl,0.lmol/L 的 Tris-Cl 緩沖液(pH8.0),0.02mol/L 的乙二胺四乙酸和 0.2% (v/v)的a-巰基乙醇構成； 上述苯酚-氯仿-異戊醇混合液由氯仿和異戊醇混合而成，其混合體積比為1:24:I; 2)PCR反應: 在PCR管中分別加入DNA模板、改性緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷、引物FLXGSSRL和FLXGSSRR、Taq酶及雙蒸水；先94°C預變性4分鐘；再94°C變性30秒，55°C退火30秒，72 °C延伸I分鐘，32個循環；72°C延伸7分鐘，95°C水浴4分鐘變性后置冰上； 上述改性緩沖液為10XPCR緩沖液+2X 10_3mol/L氯化鎂； 上述引物 FLXGSSRL 序列為 5’ -GAITCATTAGGCGGTGAG-3’ ； 上述引物 FLXGSSRR 序列為 5’ -CGTGGGTTGATTGATGTTGT-3?； 3)瓊脂糖凝膠電泳檢測: 將瓊脂糖加入100ml的5 X TBE中攪拌混合均勻后加熱，配制成濃度為3%的瓊脂糖溶液，室溫下冷卻至55-65°C，每200ml瓊脂糖溶液中加入0.5 y g的核酸染料sybe Green I，倒入專用瓊脂糖制膠模板內，插梳；待瓊脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，將凝膠放入具有1.5 X TBE電泳液的電泳槽中，以電泳液高出凝膠0.5cm為宜，點樣；設定電壓200V，電泳半小時，關閉電源，使用紫外凝膠成像系統拍照； 4)受檢種子純度計算: 用上述方法分別獲取甜瓜雜交一代和親本種子電泳譜帶，計數受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數，并用下式計算受檢樣品的種子純度(％) =受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數/受檢種子總數X 100%。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627786SQ201310305714
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年7月19日 優先權日:2013年7月19日
【發明者】周賢達, 王兆賢, 陳會中, 王浩波, 吳義兵, 周桂林, 林茂, 朱先飛, 徐麗媛, 王麗梅 申請人:合肥豐樂種業股份有限公司