一種快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法，以血旺為材料，提取DNA，使用TaqMan探針和特異性引物，進行熒光定量PCR反應；應用ABI7500SoftwareSDS1.4對實驗結果進行分析處理，以Ct值小于36的擴增作為檢測的陽性結果。本發明是一種可以同時檢測血旺中鴨血、豬血和雞血成分的多重TaqMan探針實時熒光PCR法，能夠避免非特異性擴增，可以同時鑒別多種動物源性成分，大大提高檢測效率和結果的準確性，檢測下限為0.15ng，靈敏度達1%，具有良好的特異性，可同時實現對血旺中鴨血、豬血和雞血DNA成分的檢測和定量，為食品中動物源性成分鑒定探索了新的途徑，具有很好的實用性。
【專利說明】一種快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品安全檢測領域，涉及的是食品中動物源性成分的快速檢測，具體涉及血旺中鴨、豬、雞三種動物血液成分多重TaqMan探針實時熒光PCR快速檢測方法。
【背景技術】
[0002]近年來，食品的質量安全問題尤其是摻假問題已經越來越受到社會和監管部門的關注。不明成分的食品或虛假食品標簽不僅會導致制造商之間不正當的商業競爭，還有可能危害到消費者的身體健康，不明成分的食品對于 敏感人群來說更是潛在的過敏原。在中國、日本和歐洲的一些國家，動物的血液已經作為營養添加劑廣泛用于血腸、布丁和沙拉等食品中。血旺又稱血豆腐，是在動物血液中加鹽待凝固后煮制或不煮制形成的塊狀物。豬、 鴨、雞等畜禽血液是制作血旺的主要原料。我國的傳統血旺因其具有很高的營養價值深受消費者喜愛，南京的鴨血粉絲湯作為南京特產聞名遐邇，然而，在經濟利益的驅使下，一些不法分子為牟取暴利而摻雜使假，接連被媒體曝光的假鴨血、毒血旺等事件讓消費者對此類產品望而生畏。目前市場上銷售的血旺均是零散銷售，大多是小作坊加工制造，并且沒有食品標簽，其動物源成分不明，因此，對于鑒別血旺中較常出現鴨血、豬血和雞血，建立科學、準確快速的檢測方法十分必要。
[0003]日常生活中人們通常依靠感官和經驗鑒別血旺種類，但是隨著加工方法的改進， 這種方法已經不能滿足鑒別需要，尤其是那些摻有兩種或三種不同動物血液的血旺。隨著現代分子生物學的發展，逐步形成了分別以蛋白質檢測與核酸檢測為基礎的方法體系。基于蛋白質的檢測技術，如高效液相色譜法和酶聯免疫分析法，在鑒別加工過的食品時受蛋白質降解的影響，其靈敏度較低，消耗時間長。近幾年來，DNA因其高穩定性和在不同組織中的同一性被選作比蛋白質更可靠的分析靶點，根據不同物種基因序列的特異位點設計特異性引物，利用PCR反應實現特異性基因片段的擴增，繼而通過電泳檢測鑒別食品中動物源性成分的PCR方法已基本取代以蛋白檢測為基礎的鑒別技術。尤其是近5年出現的實時熒光PCR技術，以其高特異性、高靈敏性、無污染和可定量等優點，越來越多的應用于食品中的肉類鑒別。實時熒光PCR是利用PCR反應體系中熒光信號的變化對產物生成進行實時監測的技術，它不僅省去了凝膠電泳的繁瑣操作，減少了假陽性的發生率，還可以避免實驗過程中溴化乙錠對人體的潛在危害。在目標基因選擇方面，線粒體DNA拷貝數多，但是因其在不同組織中含量不同而難以進行定量分析，而動物細胞核基因組DNA序列具有高度的物種特異性，能夠避免非特異性擴增，更加適合用作多重PCR分析；此外，在方法的選擇上，單一 PCR的重復性較差且不能實現多個物種的同時鑒定，多重PCR方法則可以同時鑒別多種動物源性成分，大大提高檢測效率和結果的準確性。目前國際上以細胞核基因DNA序列為目標基因，用于鑒別血旺中動物血液成分的多重熒光定量PCR檢測方法尚未見報道。因此， 建立用于鑒別血旺中動物血液成分的快速檢測方法將對食品安全的監管具有重要的實踐意義。
【發明內容】

[0004]發明目的:針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法，使其具有準確穩定、操作方便、高效率等特點，滿足使用需求。
[0005]技術方案:為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下:
[0006]一種快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法，以血旺為材料，提取DNA，使用 TaqMan探針和特異性引物，進行熒光定量PCR反應；應用ABI 7500 Software SDS1.4對實驗結果進行分析處理，以Ct值小于36的擴增作為檢測的陽性結果；其中，TaqMan探針和特異性引物具體如下: [0007]正向引物1: 5 ’ -GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3，，
[0008]反向引物1: 5 ’ -GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3，，
[0009]TaqMan 探針 1:FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT_BHQ1
[0010]正向引物2:5，-CGAGAGGCTGCCGTAAAGG-3，，
[0011]反向引物2:5 ’ -TGCAAGGAACACGGCTAAGTG-3 ’，
[0012]TaqMan 探針 2: CY5-ACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA-BHQI ；
[0013]正向引物3:5 ’ -CAGCTGGCCTGCCGG-3 ’，
[0014]反向引物3:5 ’ -CCCAGTGGAATGTGGTATTCA-3，，
[0015]TaqMan 探針 3: HEX-CTGCCAAGCTCTGCCACTCCTCTG-BHQI。
[0016]所述熒光定量PCR反應，50 ii L的反應體系組成為:Premix Ex Taq酶(2X) 25u L,6 個特異性引物(10 ii M)各 I ii L，3 個 TaqMan 探針(10 ii M)各 2 ii L，Rox Reference Dye II 染液(50X) I u L, DNA 模板 5 u L,剩余為 ddH20。
[0017]所述熒光定量PCR反應，條件為:95°C 30s ；95°C 5s,60°C 34s，40個循環。
[0018]該方法的DNA模板檢測下限為0.15ng,濃度為0.03ng/ u L。
[0019]該方法的靈敏度達1%。
[0020]有益效果:與現有技術相比，本發明是國際上首次以細胞核基因為目標基因建立的一種可以同時檢測血旺中鴨血、豬血和雞血成分的多重TaqMan探針實時熒光PCR法，能夠避免非特異性擴增；采用多重PCR方法，可以同時鑒別多種動物源性成分，大大提高檢測效率和結果的準確性。該檢測方法不僅具有良好的特異性，還可以同時實現對血旺中鴨血、 豬血和雞血DNA成分的檢測和的定量，為食品中動物源性成分鑒定探索了新的途徑，具有準確穩定、操作方便、高效率等特點，具有很好的實用性，能產生較好的經濟效益和社會效應。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是多重TaqMan探針實時熒光PCR特異性分析擴增曲線，圖中，1、2、3分別代表鴨血旺,豬血旺和雞血旺中提取的DNA ；
[0022]圖2是多重TaqMan探針實時熒光PCR鴨擴增標準曲線；
[0023]圖3是多重TaqMan探針實時熒光PCR豬擴增標準曲線；
[0024]圖4是多重TaqMan探針實時熒光PCR雞擴增標準曲線；
[0025]圖5是多重TaqMan探針實時熒光PCR靈敏度分析鴨血液DNA擴增曲線，圖中，1、 2、3、4所對應樣品鴨血液含量分別是20%、10%、5%、1% ；[0026]圖6是多重TaqMan探針實時熒光PCR靈敏度分析豬血液DNA擴增曲線，圖中，1、
2、3、4所對應樣品豬血液含量分別是20%、10%、5%、1%。
[0027]圖7是多重TaqMan探針實時熒光PCR靈敏度分析雞血液DNA擴增曲線，圖中，1、
2、3、4所對應樣品雞血液含量分別是20%、10%、5%、1%。
【具體實施方式】
[0028]下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。
[0029]以下實施例，所用樣品:鴨血、豬血、雞血采集于農貿市場；屠宰場、驢肉、牛肉、兔肉、鵝肉、魚、山羊肉、綿羊肉、玉米均購于江蘇南京地區超市。
[0030]所用儀器為:熒光定量PCR儀(美國ABI公司，ABI7500);核酸蛋白測定儀(美國熱電公司，Nanodrop 1000 Thermal) ；MB-102恒溫震蕩金屬浴(Bioer公司)；高速冷凍離心機 (美國 Sigma 公司，3-18K)。
[0031 ] 血液、細胞和動物組織的基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；Premix Ex Taq購自寶生物工程(大連)有限公司；引物和探針合成由上海輝睿生物科技有限公司完成；DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0032]實施例1
[0033]I)樣品制備與DNA提取
[0034]血旺的制備:采集的新鮮血液加2%食鹽，待其凝固成塊狀物，然后用沸水煮熟。
[0035]DNA的提取:按照`TIANGEN (天根)試劑盒的說明書進行操作。50mg樣品(血旺、驢肉、豬肉、兔肉、鵝肉、魚、山羊肉、綿羊肉、玉米)的總DNA均溶解于IOOiiL TE緩沖液中，利用核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度和純度。
[0036]2)引物和探針設計
[0037]根據GenBank中已發表的鴨(登錄號:HQ008784.1)，豬(登錄號為DQ452569.1)和雞(登錄號為AY685072.1)的基因組序列，應用Primer Premier 5.0軟件設計出特異性引物和探針，再將引物和探針序列在NCBI網站中進行Blast分析比較和評估，保證引物與探針的特異性。分別使用熒光基團FAM，CY5和HEX作為探針的發光基團。各引物和探針序列，擴增片段大小見表1。
[0038]表1熒光定量PCR引物與探針序列
【權利要求】
1.一種快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法，其特征在于:以血旺為材料，提取DNA,使用TaqMan探針和特異性引物，進行熒光定量PCR反應；應用ABI 7500 SoftwareSDS1.4對實驗結果進行分析處理，以Ct值小于36的擴增作為檢測的陽性結果；其中，TaqMan探針和特異性引物具體如下:正向引物 1:5’ -GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3’，反向引物 1:5’ -GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3’，TaqMan 探針 1:FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT_BHQ1 ；正向引物 2:5’ -CGAGAGGCTGCCGTAAAGG-3’，反向引物 2:5’ -TGCAAGGAACACGGCTAAGTG-3’，TaqMan 探針 2:CY5-ACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA-BHQI ；正向引物 3:5’ -CAGCTGGCCTGCCGG-3’，反向引物 3:5’ -CCCAGTGGAATGTGGTATTCA-3’，TaqMan 探針 3:HEX-CTGCCAAGCTCTGCCACTCCTCTG_BHQ1。
2.根據權利要求1所述的快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法，其特征在于:所述熒光定量PCR反應，50 μ L的反應體系組成為:Premix Ex Taq酶25 μ L，6個特異性引物各I μ L, 3 個 TaqMan 探針各 2 μ L, Rox Reference Dye II 染液 I μ L, DNA 模板 5 μ L,剩余為ddH20。
3.根據權利要求1所述的快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法，其特征在于:所述熒光定量PCR反應，條件為:95°C 30s ；95°C 5s, 60°C 34s，40個循環。
4.根據權利要求1所述的快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法，其特征在于:該方法的DNA模板檢測下限為0.15ng,濃度為0.03ng/ μ L。
5.根據權利要求1所述的快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法，其特征在于:該方法的靈敏度達1%。
【文檔編號】C12Q1/68GK103525908SQ201310351330
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年8月13日 優先權日:2013年8月13日
【發明者】黃明, 程欣, 楊靜, 黃繼超, 周興虎 申請人:南京吉泰生物科技有限公司