一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法。利用紫外線對水樣中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌進行滅活。該方法在有效滅活水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌的前提下，由于劍水蚤對其體內細菌的庇護作用，避免了現有檢測方法采用液氯滅活劍水蚤體表附著細菌的過程中，由于氯分子的滲透作用會對體內微生物產生影響的問題。采用凍融法與超聲法破碎劍水蚤身體結構，附加解吸劑洗脫其腸道等器官附著的體內細菌。最后根據生活飲用水標準檢驗法（GB/T5750.12-2006）中細菌總數的測定方法進行細菌的培養和計數，檢測其體內細菌數量。本發明具有準確度高、可靠等優點，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種在飲用水處理工藝中針對劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法。
技術背景
[0002]近年來，我國不斷出現劍水蚤類浮游動物穿透飲用水處理工藝系統進入管網的事件，使飲用水安全受到威脅與挑戰。水廠的實踐證明，水處理工藝不能徹底去除水中劍水蚤，劍水蚤成體肉眼可見，其在水處理工藝系統中的出現帶來用戶的感官性狀問題。同時，劍水蚤可作為細菌的載體或其他致病性原生動物的中間宿主，細菌可在劍水蚤的體表和體內穩定賦存；劍水蚤可對其攜帶的細菌提供庇護作用，引起水質生物安全問題。有研究表明，劍水蚤的外殼較為堅硬，對化學消毒劑具有較強的耐性，因此滅活劍水蚤體內攜帶的細菌需要有較長的接觸時間:采用液氯滅活，液氯的接觸時間達到Ih時其體內細菌的滅活率僅為0.71og。劍水蚤體內存活的細菌可引起水質的二次污染。因此，有效評價劍水蚤類浮游動物體內細菌的滅活率是保證飲用水水質安全的重要依據。
[0003]大量的文獻表明，目前國內外可見文獻報道的無脊椎類浮游動物體內微生物的檢測主要參照Bicha1.F提出的方法。該方法采用液氯將劍水蚤體表微生物有效滅活后，通過超聲波細胞破碎儀將浮游動物體表破壞釋放其體內微生物。這個方法主要有兩個弊端:首先，由于采用液氯消毒會造成消毒劑分子滲透入浮游動物體內，對其體內細菌有一定的滅活作用，會造成檢測結果失真；其次，超聲波細胞破碎儀有著大功率、高頻率的特點，能夠破碎組織、細菌、病毒、孢子及其它細胞結構，因而在超聲破碎過程中能夠殺死部分體內細菌，也會造成檢測結果偏低。此外，由于大部分體內細菌都集中在浮游動物的腸道部位，若不將細菌從腸道中釋放，會使 浮游動物經超聲破碎后向水中釋放的體內細菌濃度偏低，也會造成檢測結果偏低。

【發明內容】

[0004]為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，利用紫外輻照進行劍水蚤類浮游動物體表細菌的滅活(可同時滅活取樣中來自水中的自由細菌)，采用凍融法結合超聲波清洗儀振蕩來破碎劍水蚤的蚤體，使用解吸劑脫附其體內細菌，最后進行細菌培養和計數進而計算出劍水蚤類浮游動物體內的細菌數量。
[0005]本發明是由以下技術手段實現的:
[0006]一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，包括以下步驟:
[0007](I)從水樣中取成體劍水蚤，放入盛有無菌水的無菌容器中；
[0008](2)對容器的中劍水蚤進行紫外照射，滅活水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌；
[0009](3)滅活結束后將劍水蚤轉移至無菌離心管中，加入無菌水，置于冰箱中恒溫冷凍，冷凍完畢后取出進行恒溫融化，再用超聲波清洗儀進行超聲作用，破碎劍水蚤身體結構；
[0010](4)將離心管中破碎的蚤體和水全部轉移至裝有無菌水的無菌離心管中，加入解吸劑；
[0011](5)對加入解吸劑后的混合液進行離心，洗脫劍水蚤的腸道等器官附著的體內細菌；
[0012](6)取離心后的上清液，進行細菌培養和菌落計數，計算每個劍水蚤體內的細菌數量。
[0013]上述試驗方法中各試驗步驟可以優選為如下指標:
[0014]所用解吸劑的各成分的質量濃度分別為氯化鈉0.7-1.2%，吐溫800.08-0.12%，磷酸氫二鈉0.2-0.3%，磷酸二氫鉀0.1-0.3%，其余成分為無菌超純水。
[0015]對培養皿中劍水蚤進行紫外照射的紫外波長為200_275nm，液面處紫外強度為2500-4000 μ ff/cm2,紫外照射時間 20_30min。
[0016]置于冰箱中恒溫冷凍溫度為-20至-10°C，冷凍時間為l_2h。
[0017]冷凍完畢后取出進行恒溫融化的時間為10_20min，溫度為20_30°C。
[0018]冷凍完畢取出進行恒溫融化后再用超聲波清洗儀進行超聲l_5min。
[0019]加入解吸劑量為離心管中無菌水體積的5%_20%。
[0020]對加入解吸劑后的混合液進行離心的離心機轉速2000-3000rpm、溫度20_25°C、離心時間5-lOmin。
[0021]所述步驟(6)是通過GB/T5750.12-2006對細菌量進行檢測的。
[0022]本發明與現有技術相比具有以下優點:
[0023]1.體表細菌滅活穩定，對體內細菌影響較小。
[0024]本發明采用紫外線照射消毒技術尤其是使用200_275nm的紫外線進行照射，這種波段的紫外線又稱為短波滅菌紫外線。它的穿透能力很弱，無法穿透大部分的透明玻璃及塑料，更不會穿透劍水蚤堅硬的體表外殼。當這種紫外線照射劍水蚤體表時，由于受到劍水蚤體表外殼的保護，紫外線無法穿透體表，保護了其體內細菌免受紫外線照射。
[0025]2.劍水蚤破碎方法可靠，對體內細菌影響較小。
[0026]本發明采用凍融法結合超聲波清洗儀振蕩。凍融時將樣本置于冰箱中恒溫冷凍，再經恒溫融化，冷凍溫度優選為-20至-10°C，融化溫度優選為20-30°C。這種低溫冷凍，恒溫融化對于細菌活性的影響較小。經過I次凍融之后，劍水蚤體表已經開裂，若再經過多次凍融，只需輕微手搖振蕩幾次，劍水蚤的蚤體即可完全破碎。為最大限度減少對體內細菌的傷害，提出采用超聲波清洗儀振蕩破碎劍水蚤體表。超聲波清洗儀不同于超聲波細胞破碎儀，由于其頻率低、功率小，對細菌影響很小。
[0027]3.體內細菌解吸附效率高，檢測結果更加準確
[0028]Bicha1.F提出的檢測方法沒有考慮到浮游動物體內細菌附著在腸道等器官上，浮游動物體表破碎后其體內細菌沒有完全釋放到水中，所以這時水中的細菌濃度偏低，直接吸取上清液進行培養和計數會造成檢測結果偏低。本發明通過加入解吸劑，徹底洗脫腸道等器官附著的細菌，使體內細菌完全釋放入水中，增加了檢測結果的準確性。試驗表明，同等條件下進行檢測，Bicha1.F提出的方法測定劍水蚤類浮游動物體內菌落形成為457CFU/只，而本發明檢測結果為739CFU/只以上，其檢測的準確度為Bicha1.F提出的方法的1.62倍以上,大大優于了現有技術。
[0029]本發明操作步驟簡單，靈敏度高，穩定性好，對于劍水蚤類浮游動物體內細菌檢測效果顯著。經過適當改進也可用去檢測其它浮游動物體內細菌，適用范圍較廣，實用性較強，具有較高的可操作性，適合廣泛推廣與應用。
【具體實施方式】
[0030]以下實施例用用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0031]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0032]以下實施例中為了保證實驗樣本的一致性，所用的劍水蚤類浮游動物取自太湖原水，蚤屬為中華窄腹劍水蚤(Limnoithona sinensis)。
[0033]實施例1
[0034]一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，包括以下步驟:
[0035](I)用3mL巴氏吸管從水樣中逐個吸取15只成體劍水蚤放入盛有IOOmL無菌水的60mm的無菌培養皿中，置于無菌操作臺上。
[0036](2)對培養皿中劍水蚤進行紫外照射，紫外波長為190nm、培養皿液面處紫外強度為2000 u W/cm2、照射時間20min，對水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌進行滅活。
[0037](3)滅活結束后將劍水蚤轉移至一個1.5mL無菌的離心管中，加入ImL無菌水，置于-8°C的冰箱中恒溫冷凍lh，取出后于15°C下恒溫融化lOmin，再用超聲波清洗儀(功率60W，頻率40kHz)進行超聲作用Imin，破碎劍水蚤身體結構。
[0038](4)將離心管中破碎的蚤體和水全部轉移至裝有25mL無菌水的50mL無菌離心管中，加入2mL解吸劑，解吸劑各成分的質量濃度分別為氯化鈉0.7%，吐溫800.08%,磷酸氫二鈉0.2%,磷酸二氫鉀0.1%,其余為無菌超純水；最后用無菌超純水定容至30mL。
[0039](5)離心機轉速1500rpm、溫度20°C、離心時間IOmin,洗脫劍水蚤的腸道等器官附著的體內細菌。
[0040](6)取ImL離心后的上清液，根據生活飲用水標準檢驗法(GB/T5750.12-2006)中細菌總數的測定方法進行細菌培養和菌落計數，細菌總數乘以2即為每個劍水蚤體內細菌數量，結果見表2。
[0041]實施例2
[0042]一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，包括以下步驟:
[0043](I)用3mL巴氏吸管從水樣中逐個吸取15只成體劍水蚤放入盛有IOOmL無菌水的60mm的無菌培養皿中，置于無菌操作臺上。
[0044](2)對培養皿中劍水蚤進行紫外照射，紫外波長為350nm、培養皿液面處紫外強度為4200 u W/cm2、照射時間20min，對水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌進行滅活。
[0045](3)滅活結束后將劍水蚤轉移至一個1.5mL無菌的離心管中，加入ImL無菌水，置于-10°C的冰箱中恒溫冷凍lh，取出后于25°C下恒溫融化lOmin，再用超聲波清洗儀(功率60W，頻率40kHz)進行超聲作用2min，破碎劍水蚤身體結構。
[0046](4)將離心管中破碎的蚤體和水全部轉移至裝有25mL無菌水的50mL無菌離心管中，加入ImL解吸劑，解吸劑各成分的質量濃度分別為氯化鈉0.7%，吐溫800.08%,磷酸氫二鈉0.2%,磷酸二氫鉀0.1%,其余為無菌超純水；最后用無菌超純水定容至30mL。[0047](5)離心機轉速1500rpm、溫度30°C、離心時間5min,洗脫劍水蚤的腸道等器官附
著的體內細菌。
[0048](6)取ImL離心后的上清液，根據生活飲用水標準檢驗法(GB/T5750.12-2006)中細菌總數的測定方法進行細菌培養和菌落計數，細菌總數乘以2即為每個劍水蚤體內細菌數量。
[0049]實施例3
[0050]一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，包括以下步驟:
[0051](I)用3mL巴氏吸管從水樣中逐個吸取15只成體劍水蚤放入盛有IOOmL無菌水的60mm的無菌培養皿中，置于無菌操作臺上。
[0052](2)對培養皿中劍水蚤進行紫外照射，紫外波長為200nm、培養皿液面處紫外強度為2500 μ W/cm2、照射時間30min，對水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌進行滅活。
[0053](3)滅活結束后將劍水蚤轉移至一個1.5mL無菌的離心管中，加入ImL無菌水，置于-10°c的冰箱中恒溫冷凍lh，取出后于20°C下恒溫融化20min，再用超聲波清洗儀(功率60W，頻率40kHz)進行超聲作用3min，破碎劍水蚤身體結構。
[0054](4)將離心管中破碎的蚤體和水全部轉移至裝有25mL無菌水的50mL無菌離心管中，加入5mL解吸劑，解吸劑 各成分的質量濃度分別為氯化鈉0.7%，吐溫800.08%,磷酸氫二鈉0.2%,磷酸二氫鉀0.1%,其余為無菌超純水；最后用無菌超純水定容至30mL。
[0055](5)離心機轉速2000rpm、溫度20°C、離心時間IOmin,洗脫劍水蚤的腸道等器官附著的體內細菌。
[0056](6)取ImL離心后的上清液，根據生活飲用水標準檢驗法(GB/T5750.12-2006)中細菌總數的測定方法進行細菌培養和菌落計數，細菌總數乘以2即為每個劍水蚤體內細菌數量。
[0057]實施例4
[0058]一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，包括以下步驟:
[0059](I)用3mL巴氏吸管從水樣中逐個吸取15只成體劍水蚤放入盛有IOOmL無菌水的60mm的無菌培養皿中，置于無菌操作臺上。
[0060](2)對培養皿中劍水蚤進行紫外照射，紫外波長為225nm、培養皿液面處紫外強度為2800 μ W/cm2、照射時間22min，對水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌進行滅活。
[0061](3)滅活結束后將劍水蚤轉移至一個1.5mL無菌的離心管中，加入ImL無菌水，置于_18°C的冰箱中恒溫冷凍1.5h，取出后于22°C下恒溫融化15min，再用超聲波清洗儀(功率60W，頻率40kHz)進行超聲作用5min，破碎劍水蚤身體結構。
[0062](4)將離心管中破碎的蚤體和水全部轉移至裝有25mL無菌水的50mL無菌離心管中，加入3mL解吸劑，解吸劑各成分的質量濃度分別為氯化鈉0.8%，吐溫800.08%,磷酸氫二鈉0.23%，磷酸二氫鉀0.2%，其余為無菌超純水；最后用無菌超純水定容至30mL。
[0063](5)離心機轉速2200rpm、溫度23°C、離心時間8min,洗脫劍水蚤的腸道等器官附著的體內細菌。
[0064](6)取ImL離心后的上清液，根據生活飲用水標準檢驗法(GB/T5750.12-2006)中細菌總數的測定方法進行細菌培養和菌落計數，細菌總數乘以2即為每個劍水蚤體內細菌數量。[0065]實施例5
[0066]一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，包括以下步驟:
[0067](I)用3mL巴氏吸管從水樣中逐個吸取15只成體劍水蚤放入盛有IOOmL無菌水的60mm的無菌培養皿中，置于無菌操作臺上。
[0068](2)對培養皿中劍水蚤進行紫外照射，紫外波長為247.5nm、培養皿液面處紫外強度為3000 u W/cm2、照射時間20min，對水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌進行滅活。
[0069](3)滅活結束后將劍水蚤轉移至一個1.5mL無菌的離心管中，加入ImL無菌水，置于-15°C的冰箱中恒溫冷凍2h，取出后于26°C下恒溫融化18min，再用超聲波清洗儀(功率60W，頻率40kHz)進行超聲作用2min，破碎劍水蚤身體結構。
[0070](4)將離心管中破碎的蚤體和水全部轉移至裝有25mL無菌水的50mL無菌離心管中，加入2.5mL解吸劑，解吸劑各成分的質量濃度分別為氯化鈉1.0%，吐溫800.1%，磷酸氫二鈉0.25%，磷酸二氫鉀0.18%，其余為無菌超純水；最后用無菌超純水定容至30mL。
[0071](5)離心機轉速2600rpm、溫度20°C、離心時間8min,洗脫劍水蚤的腸道等器官附著的體內細菌。
[0072](6)取ImL離心后的上清液，根據生活飲用水標準檢驗法(GB/T5750.12-2006)中細菌總數的測定方法進行細菌培養和菌落計數，細菌總數乘以2即為每個劍水蚤體內細菌數量。
[0073]實施例6
[0074]一種劍水蚤類浮游 動物體內細菌的檢測方法，包括以下步驟:
[0075](I)用3mL巴氏吸管從水樣中逐個吸取15只成體劍水蚤放入盛有IOOmL無菌水的60mm的無菌培養皿中，置于無菌操作臺上。
[0076](2)對培養皿中劍水蚤進行紫外照射，紫外波長為253.7nm、培養皿液面處紫外強度為3000 u W/cm2、照射時間20min，對水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌進行滅活。
[0077](3)滅活結束后將劍水蚤轉移至一個1.5mL無菌的離心管中，加入ImL無菌水，置于-20°C的冰箱中恒溫冷凍lh，取出后于25°C下恒溫融化lOmin，再用超聲波清洗儀(功率60W，頻率40kHz)進行超聲作用Imin，破碎劍水蚤身體結構。
[0078](4)將離心管中破碎的蚤體和水全部轉移至裝有25mL無菌水的50mL無菌離心管中，加入2mL解吸劑，解吸劑各成分的質量濃度分別為氯化鈉0.9%、吐溫-800.1%、磷酸氫二鈉0.283%、磷酸二氫鉀0.136%，其余為無菌超純水；最后用無菌超純水定容至30mL。
[0079](5)離心機轉速2500rpm、溫度25°C、離心時間5min,洗脫劍水蚤的腸道等器官附著的體內細菌。
[0080](6)取ImL離心后的上清液，根據生活飲用水標準檢驗法(GB/T5750.12-2006)中細菌總數的測定方法進行細菌培養和菌落計數，細菌總數乘以2即為每個劍水蚤體內細菌數量。
[0081]實施例7
[0082]一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，包括以下步驟:
[0083](I)用3mL巴氏吸管從水樣中逐個吸取15只成體劍水蚤放入盛有IOOmL無菌水的60mm的無菌培養皿中，置于無菌操作臺上。
[0084](2)對培養皿中劍水蚤進行紫外照射，紫外波長為263nm、培養皿液面處紫外強度為3500 μ W/cm2、照射時間27min，對水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌進行滅活。
[0085](3)滅活結束后將劍水蚤轉移至一個1.5mL無菌的離心管中，加入ImL無菌水，置于-15°C的冰箱中恒溫冷凍2h，取出后于30°C下恒溫融化lOmin，再用超聲波清洗儀(功率60W，頻率40kHz)進行超聲作用4min，破碎劍水蚤身體結構。
[0086](4)將離心管中破碎的蚤體和水全部轉移至裝有25mL無菌水的50mL無菌離心管中，加入3.5mL解吸劑，解吸劑各成分的質量濃度分別為氯化鈉1.1%，吐溫800.09%,磷酸氫二鈉0.25%，磷酸二氫鉀0.25%，其余為無菌超純水；最后用無菌超純水定容至30mL。
[0087](5)離心機轉速3000rpm、溫度20°C、離心時間IOmin,洗脫劍水蚤的腸道等器官附著的體內細菌。
[0088](6)取ImL離心后的上清液，根據生活飲用水標準檢驗法(GB/T5750.12-2006)中細菌總數的測定方法進行細菌培養和菌落計數，細菌總數乘以2即為每個劍水蚤體內細菌數量。
[0089]實施例8
[0090]一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，包括以下步驟:
[0091](I)用3mL巴氏吸管從水樣中逐個吸取15只成體劍水蚤放入盛有IOOmL無菌水的60mm的無菌培養皿中，置于無菌操作臺上。
[0092](2)對培養皿中劍水蚤進行紫外照射，紫外波長為275nm、培養皿液面處紫外強度為4000 μ W/cm2、照射時間25min，對水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌進行滅活。
[0093](3)滅活結束后將劍水蚤轉移至一個1.5mL無菌的離心管中，加入ImL無菌水，置于_20°C的冰箱中恒溫冷凍lh，取出后于20°C下恒溫融化lOmin，再用超聲波清洗儀(功率60W，頻率40kHz)進行超聲作用Imin，破碎劍水蚤身體結構。
[0094](4)將離心管中破碎的蚤體和水全部轉移至裝有25mL無菌水的50mL無菌離心管中，加入1.25ml解吸劑，解吸劑各成分的質量濃度分別為氯化鈉1.2%，吐溫800.12%，磷酸氫二鈉0.3%,磷酸二氫鉀0.3%,其余為無菌超純水；最后用無菌超純水定容至30mL。
[0095](5)離心機轉速2000rpm、溫度25°C、離心時間5min,洗脫劍水蚤的腸道等器官附著的體內細菌。
[0096](6)取ImL離心后的上清液，根據生活飲用水標準檢驗法(GB/T5750.12-2006)中細菌總數的測定方法進行細菌培養和菌落計數，細菌總數乘以2即為每個劍水蚤體內細菌數量。
[0097]米用Wolmarans.E 提出的方法(Wolmarans, E.，et al., Significance ofbacteria associated with invertebrates in drinking water distributionnetworks.4.World Water Congress:Water and Health.2005:1ffA Publishing, AllianceHousel2Caxton Street London SfflHOQS UK.5-175.),在無菌、恒溫振蕩條件下將劍水蚤在無菌水中浸泡2-4h，進行其體表攜帶細菌的釋放，取適當體積的水進行紫外滅活后劍水蚤體表附著細菌的檢測，同時進行水樣中自由細菌檢測(生活飲用水標準檢驗法GB/T5750.12-2006中細菌總數的測定方法)。結果如表I所示。
[0098]表I紫外消毒時間與體表附著細菌存在的關系(每個時間點進行6次試驗，取平均值)
[0099][0100]從表I中的數據可以看到，隨著紫外線照射時間的增加，劍水蚤體表附著細菌數量逐漸減少，當紫外線照射時間為ISmin時，體表附著細菌沒有檢出，為保證結果的可靠性，本發明采用20min以上的照射時間；同時培養皿水中的自由細菌在5min時就未有檢出。這說明采用紫外照射法，對于劍水蚤體表附著細菌和水中自由細菌的滅活效果顯著。
[0101]分別采用本發明中實施例的方法和Bicha1.F提出的方法(Bichai F，BarbeauB，Dullemont Y，et al.Role of predation by zooplankton in transport and fateof protozoan (oo)cysts in granular activated Carbon filtration[J].WaterResearch, 2010，44(4): 1072-1081.)進行劍水蚤類浮游動物體內細菌檢測比較，每種方法平行進行3次試驗，進行比較。試驗所用的劍水蚤樣本都是從同一取水地點同一時間收集的劍水蚤，試驗時挑選個頭一樣大的成年劍水蚤，每組試驗樣本收集條件完全一樣，試驗結果如表2所示。
[0102]表2本發明的檢測方法與Bicha1.F提出的檢測方法結果對比
[0103][0105]根據表2的數據結果，可以發現本發明檢測到的劍水蚤體內細菌數量明顯多于現行Bicha1.F提出的檢測方法，且檢測結果波動小，其中RSD值都小于3 ;而Bicha1.F提出的檢測方法實驗結果波動較大，RSD值達到了 20.13，其中實施例1與實施例2是根據本領域技術人員的公知常識任意選取的參數進行的實驗，說明利用本發明提供的方法可以實現比現有技術更好的檢測效果，而實施例3-8是本發明優選的實驗參數范圍，通過對比可以發現，其檢測效果與現有技術檢測手段相比更為突出，其檢測的準確度為現有技術的1.88倍以上，大大優于了現有技術。通過上述試驗數據對比說明本發明所采用的體表附著細菌紫外線滅活、劍水蚤體表破碎和解吸劑脫附的方法檢測效率更高、重現性更好、穩定性更好。
[0106]以上對本發明所提供的劍水蚤類浮游動物體內細菌檢測方法進行了詳細介紹，并對本發明的【具體實施方式】進行了闡述，對于本領域的一般技術人員，依據本發明的思路在【具體實施方式】及應用范圍上可能在實施過程中會有改變之處，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。
【權利要求】
1.一種劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)從水樣中取成體劍水蚤，放入盛有無菌水的無菌容器中； (2)對容器中的劍水蚤進行紫外照射，滅活水中自由細菌和劍水蚤體表附著細菌； (3)滅活結束后將劍水蚤轉移至無菌離心管中，加入無菌水，置于冰箱中恒溫冷凍，冷凍完畢后取出進行恒溫融化，再用超聲波清洗儀進行超聲作用，破碎劍水蚤身體結構； (4)將離心管中破碎的蚤體和水全部轉移至裝有無菌水的無菌離心管中，加入解吸劑； (5)對加入解吸劑后的混合液進行離心，洗脫劍水蚤的腸道等器官附著的體內細菌； (6)取離心后的上清液，進行細菌培養和菌落計數，計算每個劍水蚤體內的細菌數量。
2.根據權利要求1所述的劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，其特征在于，所用解吸劑的各成分的質量濃度分別為氯化鈉0.7-1.2%，吐溫80 0.08-0.12%，磷酸氫二鈉0.2-0.3%，磷酸二氫 鉀0.1-0.3%，其余成分為無菌超純水。
3.根據權利要求1所述的劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，其特征在于，對培養皿中劍水蚤進行紫外照射的紫外波長為200-275nm，液面處紫外強度為2500-4000 u W/cm2,紫外照射時間20-30min。
4.根據權利要求1所述的劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，其特征在于，步驟(3)置于冰箱中恒溫冷凍溫度為-20至-10°C，冷凍時間為l_2h。
5.根據權利要求1所述的劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，其特征在于，步驟(3)冷凍完畢后取出進行恒溫融化的時間為10-20min，溫度為20_30°C。
6.根據權利要求1所述的劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，其特征在于，步驟(3)冷凍完畢取出進行恒溫融化后再用超聲波清洗儀進行超聲l_5min。
7.根據權利要求1所述的劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，其特征在于，加入解吸劑量為離心管中無菌水體積的5%-20%。
8.根據權利要求1所述的劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，其特征在于，對加入解吸劑后的混合液進行離心的離心機轉速2000-3000rpm、溫度20-25 V、離心時間5-10mino
9.根據權利要求1所述的劍水蚤類浮游動物體內細菌的檢測方法，其特征在于，所述步驟(6)是通過GB/T5750.12-2006對細菌量進行檢測的。
【文檔編號】C12Q1/06GK103451262SQ201310358527
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月15日 優先權日:2013年8月15日
【發明者】林濤, 陳衛, 蔡博, 吳壽可 申請人:河海大學