一種中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系ctsc-2及其建立方法
【專利摘要】本發明提供了一種中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，為研究人舌部鱗狀上皮細胞癌的特性及其治療藥物提供了物質基礎。該方法包括如下具體步驟：采用組織塊貼壁法進行舌部鱗狀上皮細胞癌細胞的原代培養；當細胞密度達到約80%的時候進行傳代培養；將傳代穩定的細胞經RT-PCR檢測表明細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子CK8、18、19；經免疫印跡實驗檢測貼壁細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子CK8、18蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2。
【專利說明】一種中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2及其建立方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞【技術領域】,具體地,涉及一種中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2及其建立方法。
【背景技術】
[0002]1.1舌部鱗狀上皮細胞癌的發病與預后
[0003]舌癌是最常見的口腔鱗狀上皮細胞癌，常發生在舌前2/3處。舌癌高發于東南亞，以印度為最高，年發生率達到9.4/100萬。近年來研究顯示，世界范圍內舌癌總發生率逐步提高，而且有年輕化的趨勢。由于其發生部位的組織學特點以及舌癌的生物學特性，舌癌使患者舌部運動受限，導致吞咽、說話、進食困難。另外，舌癌易轉移，預后較差。
[0004]1.2腫瘤干細胞研究的進展
[0005]1.2.1腫瘤干細胞理論的提出與發展 [0006]傳統觀念認為，腫瘤是一群由體細胞突變，獲得無限增殖能力的細胞組成，但是小鼠致瘤實驗和體外克隆形成實驗結果表明，并非所有的腫瘤細胞都可以增殖。說明腫瘤不是一個均質的個體，它具有異質性，在組織中存在不同的細胞亞群。腫瘤組織中可能有一部分具有干細胞特性的細胞，這類型細胞被稱為腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)。
[0007]腫瘤干細胞理論最早在白血病中被證實，1994年Lapidot等通過FACS利用細胞表面標志⑶34+⑶38-和小鼠致瘤模型中分離出人急性粒細胞白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)干細胞，隨后，Bonnet等發現只有⑶34+/⑶38-白血病細胞能在非糖尿病重度聯合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeflcient, N0D/SCID)小鼠體內致瘤。2003年，Clarke等第一次將腫瘤干細胞理論運用到實體瘤中，他們在乳腺癌中證實了這個觀點，⑶44+⑶24-/low細胞只需要100個便可以致瘤。之后，研究發現膠質母細胞瘤等腦腫瘤、肝癌、肺癌等癌癥中也能分離出腫瘤干細胞，支持了這個學說。2006年，AACR(American As sociation for Cancer Research)對腫瘤干細胞做出了定義:腫瘤中具有自我更新能力，并能產生異質性腫瘤細胞的細胞。它具有三大特性:1、分化能力:腫瘤干細胞在腫瘤中擔任形成和分化各類型腫瘤細胞的角色，在腫瘤生長過程中，不斷補充所需的各類腫瘤細胞。2、自我更新能力:生成一部分與自己相同的，具有增殖、擴張和分化潛能的細胞，從而維持干細胞的衡定。3、穩態控制能力:調節和平衡腫瘤的分化，根據環境的刺激對腫瘤做出調控。
[0008]1.2.2腫瘤干細胞在口腔癌中的研究及其應用
[0009]口腔癌同一癌灶組織內包含有不同分化程度、不同階段的癌細胞。有研究證實，頭頸部鱗狀上皮細胞癌中存在一群具有自我更新、多向分化潛能和有致瘤能力的癌細胞。腫瘤干細胞大多處于休眠狀態，對放、化療不敏感，是導致手術后腫瘤易復發、耐藥強、難治愈的根源，腫瘤干細胞理論的提出可以使治療的目標從腫瘤整體轉移至腫瘤干細胞，提出針對癌細胞和腫瘤干細胞相結合的綜合性治療策略。腫瘤干細胞的研究也為腫瘤的研究帶來了一個新的思路。
[0010]1.3細胞系的建立
[0011]建立腫瘤細胞系是研究腫瘤致關重要的環節。細胞系廣泛應用于生物學各個研究領域。它是指直接從生物體的組織中分離培養出細胞，為后續研究提供穩定細胞系的一種方法。細胞系是研究特定細胞的生長、代謝、調控特性，細胞與細胞間相互作用，細胞與基質的相互作用等有效的研究材料。人類的第一株連續細胞系是1951年由George Otto Gey實驗室建立的子宮頸癌細胞系(Hela)，這株細胞系的建立是人體細胞體外培養的里程碑，Hela細胞推進了細胞、基因、病毒、疫苗等許多研究領域的進程，也加深了人們對腫瘤的認識:發現腫瘤的各種特性、研究腫瘤發生發展的原因和過程、篩選抗癌藥物等。
[0012]除了研究細胞本身的特性和癌癥的發生發展外，還應用于遺傳、免疫、分化、發育的研究領域。此外，國內外不少企業還可以利用細胞進行生產各種因子、蛋白等。細胞的廣泛應用推動了細胞生物學的蓬勃發展。
[0013]原代培養主要有機械法和酶消化法。機械法主要是利用物理剪切，直接將組織剪碎，然后將這些組織小塊貼壁培養的方法。酶消化法是應用適當的酶裂解組織從而分離出單細胞，直接懸浮或貼壁培養的方法。用于消化的酶主要有:胰蛋白酶、膠原酶、鏈酶蛋白酶、透明質酸酶等。
[0014]鱗狀上皮細胞癌細胞系的鑒定有以下幾個方面:1、病理切片鑒定:世界衛生組織(WH0，2005)根據細胞和細胞核 的多形性、細胞分裂狀態、角化程度等將其分為高、中、低三級。高分化鱗癌與正常鱗狀上皮類似、角化明顯、核分裂相少、細胞和細胞核多形性不明顯；中分化鱗癌角化較少見，核分裂相多、細胞多形性明顯；低分化鱗癌有大量的核分裂相、細胞多形性明顯、角化非常少見；2、細胞形態:一般為多角形上皮樣，核質比高，核仁清晰個數較多，細胞排列緊密后呈鋪路石樣；3、細胞間橋粒連接:相鄰細胞之間的膜上有一塊圓形區域，負責細胞間的連接、通訊、抵抗外力拉扯，橋粒多見于上皮，皮膚、口腔、食管等處的復層扁平上皮細胞間較多，能被胰蛋白酶、膠原酶及透明質酸酶所破壞，電鏡下可見致密斑和中間纖絲，上皮細胞中多是角蛋白絲；4、分子標志:主要是細胞角蛋白(cytokeratin,CK)，特異地表達于上皮細胞，是構成上皮細胞內細胞骨架的中間纖絲類蛋白質，共有20種，CK1-9是偏堿性或中性的II型角蛋白，CK10-20是偏酸性的I型角蛋白，這些角蛋白一般表達于特定的器官或組織，CK8、CK18、CK19常表達于單層上皮。鱗狀上皮細胞癌的上述特征為分析新建立的舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系的生物學特性提供了理論依據。
[0015]第一株舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系建立于1981年，是由日本報道的，這一株細胞系未能使小鼠致瘤。而后1983年在我國上海報道建立了一株舌癌Tca8113,1995在我國香港報道建立了一株舌癌細胞系PWH-S1。現存在American type culture colIection(ATCC)中的舌癌細胞系共有5株，分別為SCC-15、SCC-4、SCC-25、SCC-9、CAL27，均是20世紀80年代的，之后鮮有報道。
[0016]不同舌癌細胞的生物學特性會存在差異，這種差異源于患者本身和接受治療的方法。有些舌癌的分化度低，惡性程度高；有些舌癌的分化度高，惡性程度低。有些患者在術前接受化療，因此術后所得到的細胞有較高的耐藥性。正是這種差異的存在，使我們對舌癌的多樣性和復雜性有了更多的認識，而存在差異的舌癌細胞系便成為研究舌癌發生發展的有效體外模型。
【發明內容】

[0017]為此，本發明提供了一種中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2及其建立方法。
[0018]本發明的技術方案如下:
[0019]中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，包括如下具體步驟:
[0020]A)采用組織塊貼壁法進行舌部鱗狀上皮細胞癌細胞的原代培養；
[0021]B)當細胞密度達到約80%的時候進行傳代培養；
[0022]C)將傳代穩定的細胞經RT-PCR檢測表明細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子CK8、18、19 ；
[0023]D)經免疫印跡實驗檢測貼壁細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子CK8U8蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2 ；獲得的CTSC-2保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國武漢市武漢大學；保藏號CCTCCNO C2012177，保藏日期為2012年11月14日。
[0024]所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，步驟A的具體方法為:
[0025]I) I型膠原包被培養皿，室溫靜止I小時以上，IXPBS洗皿一次，待用；
[0026]2)準備培養液，放`于37°C恒溫水浴鍋中溫育10分鐘；
[0027]3)在超凈臺中取出舌部鱗狀上皮細胞癌組織，在酒精中消毒不超過10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培養液中；
[0028]4)將組織剪成小碎塊，均勻分種入培養皿中，加入適量培養液，使組織一半浸于培養液中；
[0029]5)置于37°C，5%C02的培養箱中培養；
[0030]6)第二天補充適量培養液至稍稍浸沒組織塊；
[0031]7)視細胞生長情況進行適當換液。
[0032]所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，步驟B的具體方法為:
[0033]I)棄培養液，用I XPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化；
[0034]2)加入血清終止消化；
[0035]3)吹打細胞，置于離心管中，加入適量的培養液吹打；
[0036]4)離心 lOOOrpm，5 分鐘；
[0037]5)棄上清，加入適量培養液吹打散；
[0038]6)將細胞懸液加入新的培養皿中，得到所述中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2。
[0039]所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2在研究治療人舌部鱗狀上皮細胞癌的藥物中的用途。
[0040]所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2在治療人舌部鱗狀上皮細胞癌的藥物中的用途。
[0041]所述中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2已經在中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)進行保藏。
[0042]本發明的有益效果為:本發明建立了中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2，為研究人舌部鱗狀上皮細胞癌的特性及其治療藥物提供了物質基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1、細胞來源患者組織切片H&E染色，光鏡下觀察原代細胞和CTSC-2第16代傳代細胞系的細胞形態。
[0044]圖2、透射電鏡下觀察CTSC-2細胞的超微結構圖。
[0045]圖3、瓊脂糖凝膠檢測正常頰粘膜細胞、CAL27舌癌細胞系、CTSC-2細胞的CK8、18、19的mRNA的表達情況；
[0046]圖4、Western免疫印跡方法檢測CAL27舌癌細胞系、CTSC-2細胞的CK8、18和E-cadherin的蛋白表達情況。
[0047]圖5、CTSC-2細胞染色體顯示；
[0048]圖6、隨機選擇計算了 100個分散均勻的CTSC-2細胞染色體后用SSCP統計所得結
果O
[0049]圖7、CTSC-2細胞的細胞生長曲線；
`[0050]圖8、CTSC-2細胞的克隆形成；
[0051]圖9、CTSC-2CTSC-2細胞小鼠移植瘤組織切片H&E染色；
[0052]圖10、免疫熒光檢測 CTSC-2 細胞系對 CD133，Sox2, Nanog, 0ct4, SSEA-1, SSEA-4,TRA-1-60, TRA-1-81 的表達；
[0053]圖11、無血清懸浮培養富集CTSC-2細胞系腫瘤干細胞及其形態學觀察；
[0054]圖12、H&E染色CTSC-2球囊細胞；
[0055]圖13、CTSC-2球囊細胞和貼壁細胞對CK8、CK18、CK19的表達；圖14、CTSC_2貼壁細胞和球囊細胞在BME中的克隆形成統計結果；
[0056]圖15、流式細胞儀檢測CTSC-2球囊細胞和貼壁細胞的干細胞分子標志物表達的對比；
[0057]圖16、用脂肪誘導培養的方法檢測CTSC-2球囊細胞的分化能力結果。
【具體實施方式】
[0058]以下將結合具體實施例對本發明所述中國人舌癌細胞系CTSC-2的建立方法進一步說明。
[0059]一、舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立以及特性鑒定
[0060]材料說明:
[0061]I臨床標本
[0062]本實驗所用的口腔組織均取自中山大學附屬光華口腔醫院手術切除標本。
[0063]2細胞系
[0064]本實驗所用的舌部鱗狀上皮細胞癌CAL27細胞株購自ATCC。
[0065]3主要儀器
[0066]
【權利要求】
1.中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法,其特征在于,包括如下具體步驟: A)采用組織塊貼壁法進行舌部鱗狀上皮細胞癌細胞的原代培養； B)當細胞密度達到約80%的時候進行傳代培養； C)將傳代穩定的細胞經RT-PCR檢測表明細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子 CK8、18、19 ； D)經免疫印跡實驗檢測貼壁細胞表達人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞標志性分子CK8、18蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2，獲得的CTSC-2保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NO:C2012177。
2.如權利要求1所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，其特征在于，步驟A的具體方法為: O I型膠原包被培養皿，室溫靜止Ih以上，IXPBS洗皿一次，待用； 2)準備培養液，放于37°C恒溫水浴鍋中溫育10分鐘； 3)在超凈臺中取出舌部鱗狀上皮細胞癌組織，在酒精中消毒不超過10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培養液中； 4)將口腔組織剪成小碎塊，均勻分種入培養皿中，加入適量培養液，使組織一半浸于培養液中； 5)置于370C, 5%C02的培養箱中培養； 6)第二天補充適量培養液至稍稍浸沒組織塊； 7)視細胞生長情況進行適當換液。
3.如權利要求1所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2的建立方法，其特征在于，步驟B的具體方法為: O棄培養液，用IXPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化； 2)加入血清終止消化； 3)吹打細胞，置于離心管中，加入適量的培養液吹打；
4)離心1000rpm, 5min ； 5)棄上清，加入適量培養液吹打散； 6)將細胞懸液加入新的培養皿中，得到所述中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2。
4.如權利要求1所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2在研究治療人舌部鱗狀上皮細胞癌的藥物中的用途。
5.如權利要求1所述的中國人舌部鱗狀上皮細胞癌細胞系CTSC-2在治療人舌部鱗狀上皮細胞癌的藥物中的用途。
【文檔編號】C12N5/095GK103756966SQ201310374502
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年8月23日 優先權日:2012年8月24日
【發明者】張雁, 賀姮, 張海霞, 汪華 申請人:東莞中山大學研究院