一株植物內生細菌sh-1及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株植物內生細菌SH-1及其應用，屬植物保護【技術領域】。本發明的生產菌株變棲克雷伯菌（Klebsiella?variicola）SH-1，已于2013年8月8日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為：CCTCC?NO:M2013367。該植物內生細菌SH-1作為制備用于防治由鏈格孢引起的煙草赤星病、甘藍黑斑病、番茄早疫病制劑的應用。本發明具有對人、畜、農作物安全和環境友好的特點，對煙草赤星病菌、甘藍黑斑病菌、番茄早疫病菌的生長有顯著抑制效果，對由鏈格孢菌引起的煙草赤星病、甘藍黑斑病、番茄早疫病有顯著地防治效果。
【專利說明】一株植物內生細菌SH-1及其應用
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一株植物內生細菌SH-1及其應用，屬植物保護【技術領域】。
【背景技術】:
[0002]鏈格孢，是半知菌的一個屬，是全球分布最廣，經濟上重要的半知菌類真菌之一。95%以上的種類兼性寄生于植物上，引起多種植物病害，造成田間和產后巨大的經濟損失是一些植物主要病害之一，如煙草赤星病，番茄早疫病，白菜黑斑病等都是由鏈格孢屬真菌引起。
[0003]煙草赤星病(Alternaria alternata (Fries) Keissler)是煙草上的一個重要真菌性病害，在各煙草區均有發生，該病具有潛育期短、流行速度快的特點，主要在大田生長后期發生流行，是威脅各地煙葉生產的一個主要病害之一。病菌以菌絲體在病殘體上越冬，翌年產生分生孢子，借氣流傳播進行初侵染，種子和移栽苗也能成為田間初侵染源。受初侵染病部長出分生孢子進行再侵染。煙株有明顯的抗病階段，幼苗期較抗病，葉片在旺長期至成熟期較感病。煙草赤星病發病適溫25— 30°C，雨日多、濕度大是病害流行的重要因素。種植密度大、田間通風透光不良、采收不及時發病重，過多施用氮肥、追肥過晚、移栽遲也會發病較重。
[0004]甘藍黑斑病由半知菌亞門鏈格孢(Alternaria oleracea M.1brath)真菌所致。病菌分生孢子的萌發適溫為28 - 31°C，菌絲生長適溫為25 - 27V。病菌主要以菌絲體及分生孢子在病殘體上、土壤中、采種株上以及種子表面越冬，成為田間發病的初侵染來源。分生孢子借風雨傳播擴大蔓延為害。土壤瘦瘠、耕作粗放、田園衛生管理差，雜草叢生、尤其是在生長中后期肥力不足，植株長勢差，抗病性削弱，都能誘發病害的流行。
[0005]番茄早疫病又稱 為“輪紋病”，在番茄上普遍發生。早疫病是由茄鏈格孢菌(Alternaria solani)侵染所致,菌絲可在1_45°C的廣泛溫度范圍中生長,在26 — 28°C時，生長最快。侵入寄主后，2 — 3天就能形成病斑。形成病斑后3 — 4天，在病斑上就能形成大量的分生孢子。由此而進行多次重復再侵染。肥力差、管理粗放的地塊發病重。另外土質粘重者比土質砂性強的地塊發病重。
[0006]目前對有鏈格孢引起的病害防治方法使用化學藥劑，如紋枯利、多菌靈、多抗霉素、菌核凈及撲海因、百菌清等。長期施用這類化學藥品，病原產生抗藥性，導致防治效果差，甚至難以控制病原菌危害與發展。另外過多施用化學藥劑，造成農藥殘留和環境污染，對人畜極不安全，甚至直接危害非靶標微生物，直接影響生態環境。而生物防治對煙草及蔬菜安全生產及可持續性發展具有極大的應用前景，是有前途的方法。

【發明內容】
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[0007]本發明的在于提供一株植物內生細菌SH-1及其應用。
[0008]本發明的生產菌株變棲克雷伯菌SH-1 (Klebsiella variicola SH-1),已于2013年8月8日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為:CCTCC N0:M2013367o保藏單位地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學中國典型培養物保藏中心。
[0009]本發明的植物內生細菌SH-1作為制備用于防治由鏈格孢引起的煙草赤星病、甘藍黑斑病、番茄早疫病制劑的應用。
[0010]本發明的植物內生細菌SH-1，用常規方法分離自鐵皮石斛莖桿，經形態、生理生化特征鑒定及16S rDNA序列分析，確定SH-1克雷伯氏菌屬變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)。
[0011]本發明的優點在于:具有對人、畜、農作物安全和環境友好的特點；對煙草赤星病菌、甘藍黑斑病菌、番茄早疫病菌的生長有顯著抑制效果；對由鏈格孢菌引起的煙草赤星病、甘藍黑斑病、番茄早疫病有顯著地防治效果。
【具體實施方式】:
[0012]一、菌株的獲得
[0013]本發明菌株的獲得方法為常規方法，具體如下:
[0014]新鮮鐵皮石斛莖桿采自德宏，滅菌水洗凈晾干后切成小段(Icm)，用70%乙醇表面消毒5min，然后滅菌水漂洗3次，采用無菌操作技術縱向剖開莖桿，將剖開的莖桿置于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中30°C培養7天，取培養所得的菌液lmL，加到盛有9mL無菌水的試管中，30°C搖床振蕩培養20min,制成樣品懸浮液。取ImL懸浮液加入盛有9mL無菌水的試管中進行10倍系列稀釋，選擇10_5 -1O-7的稀釋液分別取0.1mL,在PDA平板上采用稀釋涂布法分離純化，30°C培養12-24h，挑取菌落形態不同的單菌落于PDA培養基平板上培養并保存備用。
[0015]篩選:將病原接種在PDA培養基平板中心，用已分離純化出的細菌做成菌懸液，取IOOuL菌懸液置于中心四周 ，28°C培養觀察對峙培養抑菌情況。將抑制效果明顯的細菌進行形態、生理生化鑒定和16S rDNA分析。
[0016]形態鑒定:LB固體培養基上純化培養細菌，觀察菌落形態、菌體形態。
[0017]生理生化鑒定:參照常用細菌鑒定手冊，采用吲哚試驗、V-P試驗、H2S試驗等對分離出的細菌進行生理生化檢測。
[0018]16S rDNA序列測定:采用CTAB/NaCl法提取SH-1基因組DNA。用于擴增的引物為 16S rDNA 擴增通用引物，27F:5 ' -AGAGTTTTATCNTGGCTCAG-3 '和 1492R:5 ' -GGYTACCTTGTTACGACTT-3 '。擴增所得PCR產物有上海生工測序，測得的序列與Genbank中已有的16S rDNA序列進行同源性比對。
[0019]表1.SH-1菌株鑒定的形態及生理生化特征
[0020]
【權利要求】
1.一株植物內生細菌SH-1，特征在于生產菌株變棲克雷伯菌SH-1 (Klebsiellavariicola SH_1 )，已于2013年8月8日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為:CCTCCN0:M2013367o
2.權利要求1所述的一株植物內生細菌SH-1的應用，其特征在于該植物內生細菌SH-1作為制備用于防治由鏈格孢引起的煙草赤星病、甘藍黑斑病、番茄早疫病制 劑的應用。
【文檔編號】C12R1/22GK103484399SQ201310383464
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月29日 優先權日:2013年8月29日
【發明者】李祖紅, 曾嶸, 文國松, 趙明富, 林選知, 張瑞勤 申請人:云南省煙草公司曲靖市公司, 云南農業大學