一種斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別方法
【專利摘要】本項發明屬于遺傳學領域，涉及一種斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別方法。一種斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別方法，包含以下步驟：分別提取待鑒定的斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰基因組DNA；PCR擴增斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的生長抑制素基因；進行測序并比對；MSTN基因從第83位點開始的AGC微衛星重復六次的為斑點叉尾鮰，若該微衛星重復七次的為長鰭叉尾鮰。該方法可以快速、簡便、準確、有效地鑒別斑點叉尾鮰和長鰭叉尾鮰，結果穩定性好，重復率高，填補了目前國內分子生物學標準鑒別斑點叉尾鮰和長鰭叉尾鮰的空白。
【專利說明】一種斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別方法

【技術領域】
[0001] 本項發明屬于遺傳學領域，涉及一種斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別方 法。

【背景技術】
[0002] 斑點叉尾鮰和長鰭叉尾鮰原產于美國，是目前美國養殖技術最為成熟、養殖產量 最高的種類，養殖產量約30萬噸。斑點叉尾鮰自20世紀80年代引入我國后，在短短的二十 幾年時間里得到了快速發展，相繼突破了養殖、繁殖、飼料、加工出口等環節技術難關，形成 了從苗種繁育、養殖、加工、市場營銷完整的產業鏈條，產量也從最初的幾千噸猛增，最高峰 時達到了 22. 4萬噸，成為我國出口美國的主要品種之一。但是斑點叉尾鮰和長鰭叉尾鮰種 質來源依靠進口，質量得不到保障，可能存在斑點叉尾鮰和長鰭叉尾鮰混雜的情況。
[0003] 目前尚沒有文獻報道斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰MSTN基因的微衛星的重復規律 性，并將此作為兩種魚類分子鑒定的依據。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的 分子遺傳鑒別方法。
[0005] -種斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別方法，包含以下步驟：
[0006] (1)分別提取待鑒定的斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰基因組DNA ;
[0007] (2)以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的生長抑制素 基因；
[0008] ( 3 )擴增產物純化后，直接測序，進行序列比對；
[0009] (4)根據測序結果，進行判定：MSTN基因從第83位點開始的AGC微衛星重復六次 的為斑點叉尾鮰，若該微衛星重復七次的為長鰭叉尾鮰。
[0010] 所述的用于PCR擴增斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的生長抑制素基因的上游引物為 SEQ ID NO. 1，下游引物為 SEQ ID NO. 2。
[0011] 所述的PCR反應體系為50 μ L :50ng/ μ L的模板DNAl μ L，PCR緩沖液5 μ L，dNTP 混合液4μ L，每種dNTPO. lmmol/L，10ymol/L的上、下游引物各1μ L，2y L2IU的Taq酶； 雙蒸水 36yL;所述的 PCR 緩沖液由 lOmmol/L Tris-HCl，pH9.0,0.5mmol/L KCl，30mmol/ L MgC12,0. 01%明膠組成；PCR擴增反應程序為：94°C預變性2min，94°C變性45s，60°C退火 lmin，72°C延伸lmin，經35個循環后再72°C延伸10min。
[0012] 一種用于斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別的引物對，上游引物為SEQ ID NO. 1，下游引物為SEQ ID NO. 2。
[0013] 本發明所述的引物對在制備斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰分子遺傳鑒別試劑中的應 用。
[0014] 一種斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰分子遺傳鑒別試劑，包含本發明所述的引物對。
[0015] 所述的斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰分子遺傳鑒別試劑，還優選包括PCR緩沖液和 dNTP 混合液，所述的 PCR 緩沖液由 lOmmol/L Tris-HCl，ρΗ9· 0,0· 5mmol/LKCl，30mmol/L MgCl2,0.01%明膠組成。
[0016] 有益效果：
[0017] 本發明針對斑點叉尾鮰和長鰭叉尾鮰肌細胞生長抑制素（Myostatin，MSTN)基因 上的微衛星的重復次數的不同，首次以該種屬特異性片段作為依據，從而定性鑒別斑點叉 尾鮰和長鰭叉尾鮰。該方法可以快速、簡便、準確、有效地鑒別斑點叉尾鮰和長鰭叉尾鮰，結 果穩定性好，重復率高，填補了目前國內分子生物學標準鑒別斑點叉尾鮰和長鰭叉尾鮰的 空白。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為本發明中MSTN基因測序序列比對結果，星號標明的是從第83位點
[0019] (MSTN-83)開始的（AGC)微衛星重復。

【具體實施方式】
[0020] 以下結合實施例來進一步闡明本發明，但并不是對本發明做任何形式的限定，僅 僅作示例說明。
[0021] 實施例1
[0022] 1、引物設計
[0023] 設計一對特異性PCR擴增引物，引物序列為：上游引物SEQ ID NO. 1 : 5' -ACGGTGTTC CTGTTACTGC-3'，下游引物 SEQ ID NO. 2 :5' -CACCAGATGTTGCTATGC-3'。
[0024] 2、樣本采集
[0025] 取待鑒定的斑點叉尾鮰和長鰭叉尾鮰個體各30尾。
[0026] 3、基因組DNA提取
[0027] 取每尾魚的尾鰭組織約20mg，用濾紙吸干表面水分，裝入I. 5ml離心管，加入 420yL STE 緩沖液（30mmol/L Tris-HCl，pH8.0,200mmol/L EDTA，50mmol/LNaCl)。混勻后 再加入濃度為10%的SDS80 μ L和20mg/mL的蛋白酶KlO μ L，56°C消化8-10h ;加入等體積 酚：氯仿：異戊醇（25:24:1)抽提兩次，12000r離心IOmin,取上清液；加入等體積氯仿：異 戊醇（24:1)抽提一次，12000r離心10min，取上清液；加入等體積預冷無水乙醇，12000r離 心IOmin,棄清液；加入600mL70%的乙醇洗漆沉淀，8000r離心IOmin,倒掉乙醇，干燥；加入 200 μ L雙蒸水溶解，紫外分光光度計測其OD值并稀釋至50ng/ μ L，-20°C保存備用。
[0028] 4、PCR擴增與檢測
[0029] 已提取的DNA為模板，用上述引物（SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2)進行PCR 擴增。PCR 反應體系為 50 μ L : 1 μ L 模板 DNA (50ng/ μ L) ;PCR 緩沖液 5 μ L (lOmmol/L 1'1^8-!1(：1，口!19.0,0.5臟〇1/11((：1，30臟〇1/1]\%(：12,0.01%明膠）；(1階1 3混合液4 4 1^(每種 dNTPO. lmmol/L);上、下游引物（10 μ mol/L)各 I μ L，2 μ L Taq 酶（2IU);雙蒸水 36 μ L。擴 增反應程序為：94°C預變性2min，94°C變性45s，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，經35個循 環后再72°C延伸10min。
[0030] PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測分離，120V電壓下電泳30min之后，經凝膠 成像分析系統確定PCR擴增產物的大小及純度。
[0031] 5、測序比對
[0032] 檢測后的PCR擴增產物直接送至生物公司純化測序，獲得500bp左右的序列，比對 后可以發現MSTN基因從第83位點（MSTN-83)開始的（AGC)微衛星重復次數存在差異：30 尾斑點叉尾鮰從第83位點（MSTN-83)開始的（AGC)微衛星重復次數為六次，30尾長鰭叉尾 鮰從第83位點（MSTN-83)開始的（AGC)微衛星重復次數為七次。
[0033] 實施例2
[0034] 按照實施例1方法，將樣本擴大到斑點叉尾鮰和長鰭叉尾鮰個體各100尾，結果依 然顯示斑點叉尾鮰從第83位點（MSTN-83)開始的（AGC)微衛星重復次數為六次，長鰭叉尾 鮰從第83位點（MSTN-83)開始的（AGC)微衛星重復次數為七次。
【權利要求】
1. 一種斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別方法，其特征在于包含以下步驟： (1) 分別提取待鑒定的斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰基因組DNA ; (2) 以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的生長抑制素基 因； (3 )擴增產物純化后，直接測序，進行序列比對； (4)根據測序結果，進行判定：MSTN基因從第83位點開始的AGC微衛星重復六次的為 斑點叉尾鮰，若該微衛星重復七次的為長鰭叉尾鮰。
2. 根據權利要求1所述的斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別方法，其特征在 于所述的用于PCR擴增斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的生長抑制素基因的上游引物為SEQ ID NO. 1，下游引物為SEQ ID NO. 2。
3. 根據權利要求1所述的斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別方法，其特征在于 所述的PCR反應體系為50 ii L :50ng/ ii L的模板DNA1 ii L，PCR緩沖液5 ii L，dNTP混合液 L，每種 dNTPO. lmmol/L，10iimol/L 的上、下游引物各 lii L，2ii L2IU 的 Taq 酶；雙蒸水 36iiL;所述的 PCR 緩沖液由 10mmol/LTris-HCl，pH9.0,0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgC12， 0. 01%明膠組成；PCR擴增反應程序為：94°C預變性2min，94°C變性45s，60°C退火lmin， 72°C延伸lmin，經35個循環后再72°C延伸lOmin。
4. 一種用于斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰的分子遺傳鑒別的引物對，其特征在于上游引物 為 SEQ ID NO. 1，下游引物為 SEQ ID NO. 2。
5. 權利要求4所述的引物對在制備斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰分子遺傳鑒別試劑中的 應用。
6. -種斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰分子遺傳鑒別試劑，其特征在于包含權利要求4所述 的引物對。
7. 根據權利要求6所述的斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰分子遺傳鑒別試劑，其特征在于還 包括PCR緩沖液和dNTP混合液，所述的PCR緩沖液由10mmol/LTris-HCl，pH9. 0,0. 5mmol/ L KCl，30mmol/L MgC12,0.01% 明膠組成。
【文檔編號】C12N15/11GK104419758SQ201310398110
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月5日 優先權日:2013年9月5日
【發明者】鐘立強, 陳校輝, 邊文冀, 王明華, 秦欽, 陳友明, 張明生, 史陽白, 孔杰, 欒生 申請人:江蘇省淡水水產研究所, 中國水產科學研究院黃海水產研究所