金黃桿菌及其羰基還原酶用于阿瑞匹坦手性中間體生產的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株金黃桿菌（Chryseobacterium?sp.CA49，保藏號為CCTCC?M2012484）及該菌基因組編碼的一種羰基還原酶ChKRED20，并利用該菌原始菌株或該種羰基還原酶作為生物催化劑制備阿瑞匹坦手性醇中間體(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。產物的對映體過量值大于99.9%。以ChKRED20粗酶粉可催化高達200g/L的底物，24h內獲得99%以上轉化率，且輔酶循環體系簡單、廉價，產物分離提純容易，回收率高，極具工業應用前景。
【專利說明】金黃桿菌及其羰基還原酶用于阿瑞匹坦手性中間體生產【技術領域】[0001]本發明屬于應用微生物與酶工程領域，具體涉及一株金黃桿菌及其基因組編碼的一種新型羰基還原酶，并利用該菌或者這種羰基還原酶作為生物催化劑生產阿瑞匹坦手性中間體。【背景技術】[0002]光學活性(R)-l-[3，5_ 二(三氟甲基)苯基]乙醇是Merk公司研發的藥物阿瑞匹坦(Aprepitant,商品名“Emend”)的關鍵手性中間體。阿瑞匹坦的主要功能是預防和治療化療引起的急性或延遲性嘔吐。[0003]目前制備該手性中間體的主流工藝是化學合成。近年來，隨著生物催化技術的不斷發展，研究者們積極探索采用酶催化前手性酮的方法生產該中間體，篩選到了一些對映體選擇性>99%的微生物菌株，包括Lactobacillus Kefir、Aspergillus niger (Tetrahedron:Asymmetry,2006,17, 2000-2005), Penicillium expansum (Tetrahedron: Asymmetry,2009, 20, 2759-2763), Leifsonia xy I i HS0904 (Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 90, 1897-1904),氧化微桿菌 Microbacterium oxydans C3 (專利號 ZL201010271579.7),以及選擇性稍差的熱帶假絲酵母菌Candida tropicalis20216 (ee 值>92%，Tetrahedron, 2004，60，789-797)等。但是，這些報道都是以微生物菌株全細胞作為生物催化劑，可轉化的底物濃度較低，目前僅有Leifsonia xyli HS0904轉化的底物濃度較高，最高可轉化的底物濃度為51g/L，30h的轉化率為91.8% (J.Microbiol.Biotechnol.2013, 23 (3)，343-350)。考慮產物分離純化成本問題，這些菌株的轉化能力與實際應用還有較大的距離。[0004]為獲得高效的前手性酮催化工藝，首先應解決高效高選擇性酶源問題，從環境中篩選新型微生物菌株作為催化劑是常用的有效途徑之一。然而原始菌株直接轉化可能存在安全性、遺傳穩定性問題，原始菌株可能繼續利用醇產物導致產物產量低以及原始菌株內的其他酶可能對底物作用生成副產物等問題，因此將原始菌株的關鍵羰基還原酶基因克隆并異源表達，以重組菌或者酶用于生物轉化則可避免上述問題，且這種催化體系較為簡單， 穩定，產物分離提純容易，易于工業化。
【發明內容】
`[0005]本發明的目的是公開一種新篩選的金黃桿菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49), 及其所產高活力高對映選擇性羰基還原酶ChKRED20，并利用該菌或者該酶還原底物 3，5-雙三氟甲基苯乙酮制備光學純(R)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，從而以生物催化的方法制備高光學純度的阿瑞匹坦手性中間體。該菌從果園土壤中富集、分離并經過多輪篩選后獲得。關于該菌的保藏信息是:保藏號為CCTCC M2012484 ;分類命名為金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49);于2012年11月27日在中國典型培養物保藏中心保藏，地址是湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心。[0006]基于上述發明目的，本發明首先提供一種金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)，保藏編號為 CCTCC M2012484)。
[0007]本發明還提供了上述金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)的篩選方法， 所述篩選方法為:于果園采集土樣，以3，5-雙三氟甲基苯乙酮為唯一碳源，經2輪富集篩選獲得可能的產酶菌株。將初篩菌株培養后，以休止細胞為催化劑轉化底物，測定產物生成量和產物對映體過量值,并將產物對映體過量值高的菌株進行進一步的鑒定,得到本發明涉及的金黃桿菌。
[0008]本發明還提供一種上述金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)作為生物催化劑在轉化底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮生成(R)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應用。
[0009]具體地，上述用途的操作方法為:將篩選的金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)培養后，收集菌體，以休止細胞作為催化劑，并添加異丙醇和葡萄糖作為輔酶循環底物，底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮經生物轉化后得到(R)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基] 乙醇，產物的對映體過量值>99%。
[0010]另外，本發明還提供一種羰基還原酶ChKRED20。該酶是從上述金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中調取出來的。
[0011]本發明還提供一種上述羰基還原酶ChKRED20作為生物催化劑在轉化底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮生成(R)-l_[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應用。
[0012]其中，從上述金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中關鍵羰基還原酶基因ChKRED20的調取和生物轉化包括以下步驟:
[0013](I)基因chKRED20的調取和鑒定:
[0014]將上述金黃桿菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49)全基因組測序(深圳華大基因公司完成)，根據測序框架圖預測的基因功能，調取出40余個可能`具有羰基還原酶功能的基因，將這些基因用常規PCR方法克隆，并連入pET28a ( + )載體，轉入大腸桿菌BL21 (DE3) 中以常規方法過量表達。將這些重組菌休止細胞作為催化劑轉化3，5-雙三氟甲基苯乙酮， 獲得R-型醇產物且ee值大于99%的酶有3個(ChKRED08、ChKRED 19, ChKRED20)。在培養基中加入或者不加入3，5-雙三氟甲基苯乙酮，以新鮮培養的菌提取總RNA，通過RT-PCR分析，兩種情況下均只有ChKRED08和ChKRED20酶的基因表達(總RNA提取和RT-PCR方法均為常規方法)。同時，測定了 ChKRED08和ChKRED20酶的活力，ChKRED20酶活是ChKRED08的 7倍左右。因此,最后確定金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中關鍵羰基還原酶基因為chKRED20。
[0015]其中，上述步驟中涉及的chKRED20基因PCR擴增所用引物為:正向5' -GAATTCAT GGGAATTTTAGACAACAAAGTAGC-3'(酶切位點 EcoR I)，反向 5' -GTCGACTTAAACTGCCGTGTAGC CACC-3'(酶切位點 Sal I);
[0016]PCR 條件為，95°C預變性 5min，94°C變性 30s，55。。退火 30s，72。。延伸 Imin, 30 個循環，最后72°C延伸lOmin。PCR產物連入pMD19T載體構建TA克隆，而后將測序正確的質粒以EcoR I和Sal I酶切，將其連入以同樣酶消化的pET28a( + )空載體中，構建重組質粒， 并轉入大腸桿菌BL21 (DE3)中，構建重組菌。
[0017]chKRED20基因堿基數為750bp，其序列為(SEQ N0.1)[0018]ATGGGAATTTTAGACAACAAAGTAGCACTTGTTACAGGAGCAGGATCCGGAATCGGATTAGCTGTTGCT CATTCGTATGCAAAAGAAGGCGCCAAAGTTATTGTATCCGATATTAATGAAGATCACGGTAACAAAGCAGTCGAAGA CATTAAAGCACAAGGCGGGGAAGCGTCTTTT GTAAAAGCAGATACTTCAAACCCTGAAGAAGTGGAAGCTTTAGTA AAAAGAACAGTAGAAATCTACGGAAGACTTGATATTGCATGTAATAATGCGGGAATCGGTGGCGAACAGGCGCTGGC AGGCGATTACGGTCTCGACAGCTGGCGAAAAGTATTAAGCATAAATCTTGATGGCGTATTCTACGGGTGCAAATATG AGTTAGAACAAATGGAAAAAAACGGGGGCGGCGTTATTGTGAATATGGCCTCTATTCATGGTATTGTTGCTGCACCG CTTTCCTCAGCCTACACTTCTGCAAAGCACGCAGTGGTAGGGCTTACTAAAAATATAGGAGCAGAATACGGACAGAA AAATATCCGTTGCAATGCGGTGGGGCCTGCTTATATTGAAACCCCGCTGTTGGAAAGCCTGACAAAGGAAATGAAGG AAGCACTGATTTCAAAACATCCGATGGGAAGACTGGGAAAACCTGAAGAAGTAGCAGAACTGGTGTTGTTCCTGAGT TCAGAAAAATCATCTTTTATGACGGGAGGCTATTATCTTGTAGATGGTGGCTACACGGCAGTTTAA ；[0019]chKRED20基因編碼249個氨基酸，序列為(SEQ N0.2):[0020]MGILDNKVALVTGAGSGIGLAVAHSYAKEGAKVIVSDINEDHGNKAVEDIKAQGGEASFVKADTSNPEE VEALVKRTVEIYGRLDIACNNAGIGGEQALAGDYGLDSWRKVLSINLDGVFYGCKYELEQMEKNGGGVIVNMASIHG IVAAPLSSAYTSAKHAVVGLTKNIGAEYGQKNIRCNAVGPAYIETPLLESLTKEMKEALISKHPMGRLGKPEEVAELV LFLSSEKSSFMTGGYYLVDGGYTAV。[0021](2)重組菌生物催化:[0022]挑取單克隆至LB(含卡那霉素50 μ g/ml)培養基中，37°C過夜培養，以1%的接種量轉接至TB (含卡那霉素50 μ g/ml)培養基中，37°C培養3h，加入0.5mM IPTG誘導后，30°C 繼續培養至20~36h。8000rpm，4°C離心收集菌體，用pH值為7.0,0.1M濃度的磷酸鉀緩沖溶液洗滌2次，獲得濕菌體。[0023]取上述新鮮培養的濕菌體重懸于上述緩沖液，加入底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮， 加入1%~3% (w/v,占總轉化體系的質量體積百分數)葡萄糖和/或5%異丙醇(v/v，占總轉化體系的體積百分數)作為輔酶循環底物。轉化體系中菌體濃度為50~150g/L，底物終濃度為I~150g/L，轉化溫度為30°C，轉速為230rpm，轉化時間為I~24h。[0024](3) ChKRED20酶的輔酶依賴型和比活力測定[0025]ChKRED20酶的純化采用鎳柱親和層析(Bio-Rad)。將上述步驟(2)誘導培養20~ 36h后的菌體以13，000rpm，4°C離心收集，重懸于Buffer A (50mM磷酸鹽緩沖液，pH8.0， 300mM NaCl，IOmM咪唑)，超聲破碎(超聲10s，間隔30s，30次)，之后以13，OOOrpm，4°C離心 20min，將上清液加入已用Buffer A平衡的柱料中，輕微混勻30min，用含有20mM咪唑的 Buffer A漂洗雜蛋白，再用含250mM咪唑的Buffer A的緩沖液洗脫目的蛋白，最后電泳鑒定純度，并用BCA Protein Assay kit測定蛋白`濃度。[0026]輔酶依賴型的確定:磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.0)，加有0.2mg/ml純酶，IOmM底物和20mM NADH或者NADPH，30°C反應2h。等體積乙酸乙酯萃取，測定產物的轉化率。以NADH 為輔酶時，轉化率為76% ;以NADPH為輔酶時，轉化率為56% ;兩者的ee值均大于99.9%，因此該酶以NADH為輔酶時轉化率更高。[0027]比活力測定反應條件:1ml磷酸鉀緩沖液(0.1Μ，ρΗ7.0)加有0.2mg純酶，IOmM底物和40mM NADH，30°C反應lmin。等體積乙酸乙酯萃取，測定產物的生成量。酶活力單位定義為:lmin內催化生成I μ mo I產物所需的酶量。ChKRED20純酶的比活力達到43U。[0028](4)粗酶粉生物催化:[0029]表達ChKRED20酶的大腸桿菌重組菌的菌體培養、獲得濕菌體的步驟同步驟(2)。
[0030]取新鮮培養的濕菌體重懸于磷酸鹽緩沖液(pH7.0,0.1M)，濕菌體終濃度為50~ 150g/L,以超聲破碎機破細胞，13，OOOrpm離心后取上清液冷凍于_80°C過夜，而后用冷凍干燥機干燥至粉狀，制成粗酶粉。轉化體系為:磷酸鉀緩沖液(0.1M，PH7.0)，粗酶粉，底物 3，5-雙三氟甲基苯乙酮，異丙醇(輔酶循環底物，用量為40%，v/v), Na-NAD (200mg/L);轉化條件:30°C, IOOrpm, 24h。
[0031]粗酶粉用量為10g/L，底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮濃度為200g/L，轉化24h可實現轉化率>99%, ee值>99.9%。
[0032]本發明涉及的金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)可高效轉化3，5_雙三氟甲基苯乙酮生成R-醇，其關鍵羰基還原酶基因chKRED20與NCBI數據庫中其他基因的相似度最高70%，氨基酸序列的最高相似度為76%，與已報道的功能蛋白(NCBI登錄號為: BAD99642)的最高相似度為51%，為(R)-l_[3，5_ 二(三氟甲基)苯基]乙醇生物催化合成提供了可供選擇的新型酶源。
[0033]該蛋白在大腸桿菌中過量表達后制成粗酶粉，10g/L的酶量便可在24h內轉化高達200g/L的底物，且轉化率為99%以上，ee值大于99.9%。粗酶轉化工藝簡單，以廉價異丙醇和少量NAD+作為輔酶循環，產物易于分離純化，回收率高達90%以上，極具工業應用前
旦
o
[0034]凡是與ChKRED20氨基酸相似度高于51%且具有催化3，5_雙三氟甲基苯乙酮生成 (R)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇功能的酶均屬于本發明的保護范圍。
[0035]圖1是ChKRED20蛋白純化后SDS-PAGE圖。`【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]以下結合實施例詳細地說明本發明。實施方案為便于更好的理解本發明，但并非對本發明的限制。
【具體實施方式】
[0037]實施例1:菌株篩選
[0038]于某果園采集土樣，以3，5-雙三氟甲基苯乙酮(2g/L)為唯一碳源并添加無機鹽于 30°C，230rpm 培養 7 ~10 天。無機鹽為:Na2HP042g/L，KH2PO41 g/L, NH4Cl0.4g/L， MgCl20.4g/L。從富集液中取出1%加入到上述相同培養基中再次富集培養7~10天。而后將培養液稀釋IO4倍，并涂布至篩選平板上(上述無機鹽+3，5-雙三氟甲基苯乙酮lg/L + 酵母粉0.5g/L +瓊脂粉15g/L)，30°C培養I~3天，每支平板上可見許多微生物單菌落，這些菌株為可能的產酶菌株。
[0039]將富集平板中的單菌落用無菌牙簽逐一接入24孔篩選板各孔(Costar，美國)進行培養(每孔裝有發酵培養基1ml，發酵培養基組分:蛋白胨5g/L，牛肉膏1.5g/L，酵母粉
1.5g/L, NaC15g/L,葡萄糖 10g/L), 30。。, 240rpm 培養 24h。6000rpm 離心收集菌體，用磷酸鉀緩沖液(pH7.0,0.1M)洗滌2次，再加入Iml緩沖液重懸菌體，而后加入底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮5mg, 30°C, 270rpm進行生物催化篩選試驗。轉化36h后，以200 y I乙酸乙酯萃取。以氣相手性柱分析產物的對映體過量值，得到產(R)-醇菌株5株。其中I株為本發明涉及的金黃桿菌(Chryseobacterium sp.CA49),產物對映體過量值大于99%。
[0040]實施例2:篩選菌株的鑒定
[0041]為確定該菌株分類地位并詳細了解其性能，對該菌株進行了初步鑒定。該菌株的菌落為圓型，光滑，隨培養時間不同，菌落呈淺黃色到金黃色。
[0042]16S rRNA鑒定:基因組DNA為模板，以細菌通用引物27f和1492r擴增16S rRNA 序列，并將PCR產物直接送樣測序，獲得的部分序列(1381bp)如下(SEQ N0.3):
[0043]AGCTGAGCGGTAGAGTTTCTTCGGAGACTTGAGAGCGGCGTACGGGTGCGGAACACGTGTGCAACCTGC CTTTATCAGGGGGATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCCCATAATATATAGAGTGGCATCACTTTATATTGAAA ACTGAGGTGGATAAAGATGGGCACGCGCAAGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCGATGATCTTTA GGGGGCCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAAT ATTGGACAATGGGTTAGCGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGAAGGACGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTG TACAGGGATAAACCTATTTACGTGTAAATAGCTGAAGGTACTGTACGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGATCTGTAAGTCAG TGGTGAAATCTCACAGCTT AACTGTGAAACTGCCATTGATACTGCAGGTCTTGAGTAAGGTAGAAGTGGCTGGAAT AAGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACTTAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTCACTATGTCTTAACTGAC GCTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGCTAACTCGTT TTTGGGCTTTCGGGTTCAGAGACTAAGCGAAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGAACGCAAGTTTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGATTATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAG GCTTAAATGGGAATTGATCGGTTTAGAAATAGACCTTCCTTCGGGCAATTTTCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAG CTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTTACTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGGA CTCTAGTAAGACTGCCTACGCAAGTAGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGCCTTGGGC CACACACGTAATACAATGGCCGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCAAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGT TCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATA CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC`GTCAAGCCATGGAAGTCTGGGGTACCTGAAGTCGGTGACCGTAAAAGGAG CTGC
[0044]經NCBI的 blast 比對，該菌與 Chryseobacterium taiwanense, Chryseobacterium sp.MG-2011-139-ER、Chryseobacterium sp.HNRl2 等菌株的同源性大于 99%,初步可確定為 Chryseobacterium sp.金黃桿菌屬，實驗室自編號為 Chryseobacterium sp.CA49, 2012 年 11月27日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M2012484。
[0045]實施例3:金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)原始菌株生物催化
[0046]菌株培養:將少量金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)斜面種子接種于發酵培養基中(組分同實施例1 )，30°C，230rpm培養16~24h制備種子液，以0.5%~2%的接種量轉接至發酵培養基中擴大培養，培養條件:30°C，230rpm，24~48h。
[0047]休止細胞轉化:將第I步培養的菌體以13，OOOrpm離心收集，用pH值為7.0,0.1M 濃度的磷酸鉀緩沖溶液洗滌2次。轉化體系包括磷酸鹽緩沖液(pH值7.0,0.1M)、菌體、底物和輔酶循環底物。輔酶底物為5%~10% (v/v)的異丙醇和2%~5% (v/w)的葡萄糖。菌體濃度為50~200g/L，底物終濃度為I~50g/L，轉化溫度為30°C，轉速為230rpm，轉化時間為5~24h。以下為幾種原始菌株休止細胞轉化的具體實施例:
[0048](I)取菌體0.5g重懸于IOml緩沖液,加入底物3，5_雙三氟甲基苯乙酮IOmg,并加入異丙醇0.5ml (5%)和葡萄糖0.2g (2%)，30°C，230rpm轉化5h。以IOml乙酸乙酯萃取，取有機相氣相色譜(SGE，澳大利亞，AC-5,30mX0.22)測定轉化率為95.6%，氣相手性柱 (CHIRASIL-DEX CB，瓦里安 25mX0.25)測定產物 ee 值大于 99%。[0049].夕入CF,印人、,'O,[0050]產物數據如下:[0051]無色液體，[a]D25=+21.6(c=l，乙腈)；[0052]ee>99%(CHIRASIL-DEX CB,柱溫:120 °C，進樣器:260 °C,檢測器:280 °C， t=8.403min);[0053]IH NMR (600MHz, CDCl3): δ 7.84 (s, 2H, Ar-H)，7.78 (s, 1H, Ar-H)，5.04 (q, J=6.54Hz ，1H, -CH)，1.99 (br, 1H, OH)，1.55 (d, J=6.54Hz, 3H, -CH3)[0054](2)取菌體1.0g重懸于IOml緩沖液中，加入底物lOOmg，葡萄糖和異丙醇添加量同上，轉化條件和分析方法也同上。底物的轉化率為91.5%，產物對映體過量值大于99%。[0055](3)取菌體1.5g重懸于IOml緩沖液中，加入底物500mg，并加入異丙醇1.0ml (10%)和葡萄糖0.5g (5%)，30°C，230rpm轉化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，經氣相色譜分析，底物的轉化率為90.8%，產物對映體過量值大于99%。[0056]實施例4:羰基還原酶ChKRED20重組菌全細胞生物催化[0057]羰基還原酶ChKRED20重組菌的培養方法和菌體收集方法見說明書
【發明內容】
部分。[0058](I)取菌體0.5g，重懸于IOml磷酸鹽緩沖液，加入底物IOmg和0.1g葡萄糖，30°C， 230rpm轉化2h。以IOml乙酸乙酯萃取，經氣相色譜分析，底物的轉化率為30.1%，產物對映體過量值大于99.9%。[0059](2)取菌體0.5g，重懸于IOml磷酸鹽緩沖液，加入底物10mg，0.2g葡萄糖和0.5ml 異丙醇，30°C，230rpm轉化lh。以IOml乙酸乙酯萃取，經氣相色譜分析，底物的轉化率為 29.5%，產物對映體過量值大于99.9%。[0060](3)取菌體1.0g,重懸于IOml磷酸鹽緩沖液，加入底物500mg和0.2g葡萄糖， 30°C，230rpm轉化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，經氣相色譜分析，底物的轉化率為88.2%，產物對映體過量值大于99.9%。[0061](4)取菌體1.0g,重懸于IOml磷酸鹽緩沖液，加入底物500mg和0.5ml異丙醇， 30°C，230rpm轉化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，經氣相色譜分析，底物的轉化率為79.1%，產物對映體過量值大于99.9%。[0062](5)取菌體1.5g,重懸于IOml磷酸鹽緩沖液,加入底物1500mg和0.5ml異丙醇， 30°C，230rpm轉化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，經氣相色譜分析，底物的轉化率為46.1%，產物對映體過量值大于99.9%。[0063]實施例5:羰基還原酶ChKRED20純酶生物催化[0064]轉化體系:磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.0)，純酶濃度2g/L，底物3，5_雙三氟甲基苯乙酮，異丙醇40% (V/V)，Na-NAD200mg/L，30°C生物轉化。反應`結束后用等體積乙酸乙酯萃取，氣相色譜分析轉化率和ee值，結果見表1。
[0065]表1羰基還原酶ChKRED20純酶對不同濃度底物轉化
[0066]
【權利要求】
1.一種保藏號為 CCTCC M2012484 的金黃桿菌 CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)。
2.一種從權利要求1所述的金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中調取出來的羰基還原酶ChKRED20，其特征在于其核苷酸序列為如SEQ N0.1所示，其氨基酸序列為如 SEQ N0.2 所示。
3.權利要求1所述的金黃桿菌CA49作為生物催化劑在轉化底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮生成(R)-l_[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應用。
4.權利要求2所述的羰基還原酶ChKRED20作為生物催化劑在轉化底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮生成(R)-l_[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK103497911SQ201310399109
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月5日 優先權日:2013年9月5日
【發明者】吳中柳, 劉艷, 湯脫險, 裴小瓊 申請人:中國科學院成都生物研究所