一種環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物工程【技術領域】，特別涉及一種環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用。該應用是在醬香型白酒生產工藝不變的條件下再使用環狀芽孢桿菌HG12菌株，其特征為，將環狀芽孢桿菌HG12菌株接種到液體種子培養基中，培養制得活化后的液體種子；將液體種子接種到液體培養基或固體培養基中，制得菌株液體培養物或固體培養物；將菌株液體或固體培養物接種到醬香型白酒蒸酒后的固體料醅中，入池發酵，制得發酵酒醅，將酒醅蒸餾，制得醬香型白酒酒液。本發明針對醬香型白酒生產中存在的主要問題，提供了一株產醬香功能菌環狀芽孢桿菌HG12菌株在醬香型白酒中的應用方法，對提升醬香型白酒企業的技術水平與競爭力具有明顯的應用價值。
【專利說明】一種環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用
[0001](一)【技術領域】
本發明屬于生物工程【技術領域】，特別涉及一種環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中
的應用。
[0002](二)【背景技術】
醬香型白酒生產歷史悠久，是我國重要的白酒類型之一，具有“醬香突出、香氣幽雅、酒體豐滿、醇厚柔和、回味悠長、空杯留香持久”的特殊風格。醬香型白酒的特殊風格來自于其獨特的釀造工藝，并且在釀造過程中參與發酵的微生物種類多、數量大，通過微生物群體的生化作用和相互協調，形成了醬香型白酒獨特的風味成分。
[0003]目前醬香型白酒生產中存在的主要問題有:對產生醬香型白酒風味物質所必須的微生物種類尚不清楚，并且對微生物在風味物質產生過程中產生何種酶及其具體作用等方面也不了解；醬香型白酒的釀造缺少特有的釀造科學理論與技術體系；醬香型白酒的生產由于受當地環境、氣候、水質、原輔料以及工藝操作的影響，所產白酒的風格和質量不穩定、優質品率低等問題。
[0004]研究表明醬香型白酒風味物質的產生以及醬香型白酒風格的形成，主要是釀造醬香型白酒用的高溫大曲中的產香功能菌所代謝的生物酶起的催化作用。高溫大曲是以小麥為原料制成的，在制曲過程中通過網羅自然環境中的微生物接種和生長繁殖，因此大曲中含有許多種類的微生物。高溫大曲在醬香型白酒生產過程中的主要作用是生香，這是大曲中微生物功能的體現， 對賦予醬香型白酒風味的典型性具有重要貢獻。因此，從產香微生物的角度分析醬香型白酒的主要風味物質及其形成機制是非常必要的。
[0005]科研人員在醬香型白酒風味物質產生菌方面已經做了一些研究，如楊濤(釀酒科技，2011年第4期)進行微生物技術在醬香型白酒生產中的應用研究時，從醬香型白酒高溫大曲中分離得到5株嗜熱芽孢桿菌，并將它們應用于醬香型白酒生產中，所生產的醬香型白酒品質優良，醬香風格典型；如中國專利文獻CN 102268397 A (申請號201110208832.9)公開了醬香特征香高效產生菌株及其在中國白酒釀造中的應用，該發明利用從中國白酒高溫大曲中選育的3株地衣芽孢桿菌單獨或混合應用于醬香型白酒生產工藝中，生產的白酒品質得到提高，酒的特征香更突出且更持久。
[0006]上述研究表明，從高溫大曲中分離得到產香微生物，經過培養再應用到醬香型白酒生產過程中，可以提高白酒中風味物質的含量，使酒的質量得以提高。雖然一株或幾株產香微生物應用于醬香型白酒生產過程中不能產生醬香型白酒的所有風味物質，但對于提高其質量卻有重要作用。在實際生產中，由于不同地區自然條件及企業制曲工藝的差別，醬香型白酒風味物質產生菌的種類和數量也會有差別。
[0007]據報道高溫大曲中的產香微生物主要是芽孢桿菌(如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等)，目前對地衣芽孢桿菌(如中國專利文獻CN 103131615 A)、枯草芽孢桿菌(如中國專利文獻CN 102703358 A)等在醬香型白酒生產中的應用有一定研究，但對從高溫大曲中分離的產醬香環狀芽孢桿菌及其在醬香型白酒生產中的應用研究較少。
[0008]近幾年來，醬香型白酒得到了快速發展，其市場份額逐步提高，醬香型白酒的未來發展必須不斷地對其傳統工藝技術進行升級改造，充分開發醬香型高溫大曲中的產香微生物的種類和功能，并將其應用于酒的生產，形成有效的應用工藝，提升酒的釀造技術水平，使醬香型白酒的特殊風格得到保持和進一步發揮。因此，產香功能微生物的應用對有效提高醬香型白酒生產的穩定性和酒的品質，實現醬香型白酒的釀造技術水平與競爭力的提升具有重要的作用。
[0009](三)
【發明內容】

本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種提高風味物質含量、經濟效益高的環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用。
[0010]本發明是通過如下技術方案實現的:
一種環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用，以菌種保藏編號為CGMCC N0.8044的環狀芽孢桿菌{Bacillus circulans) HG12菌株為生產菌種,包括如下步驟:
(O從試管斜面上挑取1-2環環狀芽孢桿菌HG12菌株接種到液體種子培養基中，在35-40°C、120-160r/min條件下，培養12_16h，制得活化后的液體種子；
(2)將液體種子接種到液體培養基或固體培養基中，進行液體或固體培養，制得菌株液體培養物或固體培養物；
(3 )將菌株液體或固體培養物接種到醬香型白酒蒸酒后的固體料醅中，按醬香型白酒生產工藝操作，入池發酵，制得發酵酒醅，將酒醅蒸餾，制得醬香型白酒酒液。
[0011]發明涉及的環狀芽孢桿菌菌株，來源于中國白酒廠生產醬香型白酒用的高溫大曲，已于2013年8月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址: 北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，菌種保藏編號為CGMCC N0.8044。
[0012]本發明的環狀芽孢桿菌(ifeci77i/5.HG12菌株的微生物學特征是:菌落呈乳白色、有褶皺、無光澤、表面不光滑；菌體呈桿狀、直或接近直、單個或成鏈狀，細胞大小約為(0.6-1.0) MmX (1.8-3.8) Mm，產芽孢、孢囊膨大、芽孢橢圓形、芽孢中生到端生；革蘭氏陽性、兼性厭氧、有機化能異養菌，利用葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖產酸，V-P反應陰性，接觸酶陽性，硝酸鹽還原陽性，可水解酪蛋白、明膠和淀粉，不利用檸檬酸鹽、丙酸鹽，在培養溫度為55°C下生長；可發酵小麥麩皮、小麥、大麥、高粱的一種或幾種組合制成的液體培養基和固態培養基，產生明顯的醬香香氣。
[0013]本發明的更優方案為:
步驟(2)中，將液體種子按體積比為2-5%的接種量接種到液體培養基中，于40-50°C、150-200r/min下，培養16_24h，制得菌株液體培養物。
[0014]步驟(2)中，將液體種子按體積比1-3%的接種量接種到固體培養基中，于40_50°C下，培養3-5d，制得菌株固體培養物。
[0015]步驟(1)中，液體種子培養基的組分為:葡萄糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏
10.0g/L, NaCl 5.0g/L, pH 7.0,蒸餾水定容。
[0016]步驟(3)中，菌株液體培養物的的接種量為1-10%的體積/重量比，菌株固體培養物的接種量為1-10%的重量比。
[0017]步驟(2)中，液體培養基的制備過程為:原料200g，加水800_1000mL，混合均勻，于100°C下、蒸煮 10-20min，調 pH 值為 6.0-6.5，121°C下、滅菌 30min。[0018]步驟(2)中，，固體培養基的制備為:原料200g，加水100-160mL，浸潤10_20h，于10CTC下、蒸煮 20-30min,裝瓶，于 121°C下、滅菌 30min。
[0019]步驟(2)中，液體培養基和固體培養基的原料為小麥麩皮、小麥、大麥和高粱中的一種或幾種，原料經粉碎預處理，粉碎力度為1.0-2.0_。
[0020]步驟(3)中，醬香型白酒生產工藝是白酒行業人員熟知的工藝，在醬香型白酒生產工藝(如入池溫度、用曲量、發酵時間等)不變的條件下，再接種HG12菌株進行白酒生產。
[0021]本發明的方法是利用環狀芽孢桿菌菌株提高醬香型白酒中風味物質的含量，從而提高白酒質量、取得較好的經濟效益。
[0022]本發明使用的環狀芽孢桿菌(MeiciIIus circulans) HG12菌株來源于生產醬香型白酒的高溫大曲并經過紫外線誘變選育獲得；HG12菌株含有高活性阿魏酸脫羧酶，能將釀酒原料(如小麥、小麥麩皮、大麥等)中的阿魏酸轉化成4-乙烯基愈創木酚，在白酒發酵過程中4-乙烯基愈創木酚在酵母菌(如酒香酵母)產生的乙烯基愈創木酚還原酶的作用下分解生成4-乙基愈創木酚，4-乙基愈創木酚是醬香型白酒的重要風味物質，對醬香型白酒的質量起著重要作用，酒液中含有4-乙基愈創木酚會使酒的醬香風味更突出和持久；HG12菌株能耐受55°C的高溫，能分泌淀粉酶、蛋白酶等，可利用原料中的營養成分產生一系列代謝產物，將其應用于醬香型白酒生產中，能提高白酒中的酯、酸等風味物質的濃度，使生產的白酒品質得以提聞。
[0023]本發明針對醬香型白酒生產中存在的主要問題，提供了一株產醬香功能菌環狀芽孢桿菌HG12菌株在醬香型白酒中的應用方法，對提升醬香型白酒企業的技術水平與競爭力具有明顯的應用價值。
[0024](四)【具體實施方式】
下面結合實施例對本發明的技術方案進行具體描述或作進一步說明，目的在于更好地理解本發明的方法，但本發明的保`護范圍不限于以下的實施例。
[0025]本發明中4-乙基愈創木酚含量的測定步驟如下:
精密稱取4-乙基愈創木酚標準品25mg，用1%冰乙酸溶解并定容到25mL，制得濃度為lmg/mL的標準母液。用1%冰乙酸將標準母液稀釋，制得4-乙基愈創木酚質量體積濃度依次為0.02,0.2、1.0,2.0,4.0Pg/mL的標準溶液。將上述標準溶液分別用0.22Mm的有機濾膜過濾，過濾液分別用高效液相色譜儀(購自上海天普分析儀器有限公司)進樣測定，以峰面積(Y)為縱坐標、濃度值(X，Kg/mL)為橫坐標，制作4-乙基愈創木酚標準溶液的標準曲線。根據標準曲線獲得該曲線的回歸方程為:y=3.862x+8.416 (R2=0.9996)，其中:y為峰面積，X為4-乙基愈創木酚的質量濃度(Pg/mL)，R2為相關系數。峰面積Y的變化與4-乙基愈創木酚的質量濃度成線性關系，其擬合度達0.9996。
[0026]白酒酒液中4-乙基愈創木酚含量的測定:取白酒溶液10mL，用蒸餾水將酒液稀釋，制得4-乙基愈創木酚質量體積濃度為0.01-4.0Pg/mL的樣品溶液，用高效液相色譜儀進樣測定，得到樣品溶液的峰面積，根據回歸方程計算出4-乙基愈創木酚的濃度。
[0027]高效液相色譜儀的測定條件為:C18色譜柱(Agilent HC-C18, 250mmX4mm, 5Mm),流動相為水:甲醇:磷酸=540:450:10 (v/v/v)，流速為lmL/min，進樣量為15μ?，操作溫度為30°C。熒光檢測器條件為激發波長270nm、發射波長315nm。
[0028]本發明中醬香型白酒樣品中的總酸、總酯含量的測定方法按《白酒分析方法國家標準》GB/T10345-2007中規定的測定方法。
[0029]原料來源:小麥麩皮、小麥、大麥、高粱市售，4-乙基愈創木酚標準品購自美國Sigma公司，冰乙酸購自天津市科密歐化學試劑有限公司。
[0030]實施例1-4所用的液體種子培養基組分如下(g/L):葡萄糖10.0，蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，NaCl 5.0, pH 7.0,蒸餾水定容。
[0031]實施例1
一種環狀芽孢桿菌{Bacillus circw7a/750HG12菌株在醬香型白酒生產中的應用,步驟如下:
(I)用接種環從菌株試管斜面上挑取I環環狀芽孢桿菌HG12菌株接種到IOmL的液體種子培養基中，在40°C、160r/min條件下，培養12h，制得活化后的液體種子。
[0032](2)將步驟(1)制得的液體種子按5% (v/v)的接種量接種到200mL的液體培養基中，于50°C、200r/min下，培養16h，制得菌株液體培養物。
[0033](3)將步驟(2)制得的菌株液體培養物以10% (v/w)的接種量接種到醬香型白酒蒸酒后的固體料醅中，按醬香型白酒生產工藝操作，入池發酵30d，制得發酵酒醅，將酒醅蒸餾，制得乙醇濃度 為60% (v/v)的醬香型白酒酒液。
[0034]所述步驟(2)中的液體培養基:小麥麩皮200g，加水800mL，混合均勻，于100°C下、蒸煮IOmin,調pH值為6.0,121°C下、滅菌30min。
[0035]將制得的醬香型白酒進行風味物質含量檢測，與生產工藝相同但未使用HG12菌株所制得的醬香型白酒作對比，檢測結果見表1。
[0036]表1醬香型白酒中風味物質的含量
【權利要求】
1.一種環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用，以菌種保藏編號為CGMCC N0.8044的環狀芽孢桿菌iBacillus circulans ) HG 12菌株為生產菌種，其特征為，包括如下步驟:(I)從試管斜面上挑取1-2環環狀芽孢桿菌HG12菌株接種到液體種子培養基中，在35-40°CU20-160r/min條件下，培養12_16h，制得活化后的液體種子；(2)將液體種子接種到液體培養基或固體培養基中，進行液體或固體培養，制得菌株液體培養物或固體培養物；(3 )將菌株液體或固體培養物接種到醬香型白酒蒸酒后的固體料醅中，按醬香型白酒生產工藝操作，入池發酵，制得發酵酒醅，將酒醅蒸餾，制得醬香型白酒酒液。
2.根據權利要求1所述的環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用，其特征在于:步驟(2)中，將液體種子按體積比為2-5%的接種量接種到液體培養基中，于40-50°C、150-200r/min下，培養16_24h，制得菌株液體培養物。
3.根據權利要求1所述的環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用，其特征在于:步驟(2)中，將液體種子按體積比1-3%的接種量接種到固體培養基中，于40-50°C下，培養3-5d，制得菌株固體培養物。
4.根據權利要求1所述的環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用，其特征為，步驟(O中，液體種子培養基的組分為:葡萄糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L, NaCl5.0g/L, pH 7.0,蒸懼水定容。
5.根據權利要求1所述的環狀芽孢桿菌在醬香型杯酒生產中的應用，其特征在于:步驟(3)中，菌株液體培養物的的接種量為1-10%的體積/重量比，菌株固體培養物的接種量為1-10%的重量比。
6.根據權利要求1或2所述的環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用，其特征為，步驟(2)中，液體培養基的制備過程為:原料200g，加水800-1000mL，混合均勻，于100°C下、蒸煮 10-20min，調 pH 值為 6.0-6.5，121°C下、滅菌 30min。
7.根據權利要求1或3所述的環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用，其特征為，步驟(2)中，固體培養基的制備為:原料200g，加水100-160mL，浸潤10_20h，于100°C下、蒸煮20_30min,裝瓶，于 121°C下、滅菌 30min。
8.根據權利要求1所述的環狀芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的應用，其特征在于:步驟(2)中，液體培養基和固體培養基的原料為小麥麩皮、小麥、大麥和高粱中的一種或幾種，原料經粉碎預處理，粉碎力度為1.0-2.0mm。
【文檔編號】C12G3/02GK103789131SQ201310413426
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】董永勝 申請人:齊魯工業大學