一種淀粉霉新菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種淀粉霉（Amylomyces?rouxii）新菌株CZ1，其保藏號(hào)為CGMCC?No.6874，保藏日期為2012年11月23日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。本發(fā)明還公開了含有其的菌劑。在堆體中接種本發(fā)明的淀粉霉新菌株CZ1，在北方低溫季節(jié)能迅速提高堆體溫度，且能使堆體保持50℃以上的高溫15天，縮短了發(fā)酵周期，能有效殺滅動(dòng)物糞便中的病原物和寄生蟲。堆肥發(fā)酵結(jié)束后，堆肥產(chǎn)物養(yǎng)分含量高，pH8.0左右，可作為優(yōu)良的植物有機(jī)肥使用。
【專利說明】一種淀粉霉新菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于堆肥領(lǐng)域，具體涉及一種堆肥用微生物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)過近30年的快速發(fā)展，極大的滿足了城鄉(xiāng)居民對(duì)于肉蛋奶的需求。然而我國(guó)畜禽養(yǎng)殖迅速發(fā)展的同時(shí)，不可避免帶來每年超過20億噸畜禽糞污的產(chǎn)生，同時(shí)有大量的畜禽糞便不能及時(shí)消納，特別是快速興起的養(yǎng)殖小區(qū)的出現(xiàn)，導(dǎo)致糞污大面積堆積或隨意丟棄，不但使農(nóng)業(yè)資源不能及時(shí)有效地利用，也已成為土壤、水體污染的主要污染源，并且將限制養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。2013年中共中央國(guó)務(wù)院一號(hào)文件再次重申了“強(qiáng)化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程環(huán)境監(jiān)測(cè)，積極開展農(nóng)業(yè)面源污染和畜禽養(yǎng)殖污染防治”工作；北京市十二五發(fā)展規(guī)劃也將“研究廢棄物無害化處理和資源利用技術(shù)與裝備的系列化、標(biāo)準(zhǔn)化，提高生產(chǎn)能力”和“在調(diào)整高端農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)布局的同時(shí)，高度關(guān)注農(nóng)業(yè)發(fā)展對(duì)環(huán)境、能源和水資源的影響”列入工作重點(diǎn)。因此，在確保畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)有效發(fā)展、確保農(nóng)民收入的前提下，有效地處置、利用畜禽廢棄物、減少環(huán)境和生態(tài)的污染風(fēng)險(xiǎn)迫在眉睫。
[0003]目前好氧堆肥是實(shí)現(xiàn)畜禽糞便資源化利用的最主要手段。然而傳統(tǒng)自然堆肥法由于堆肥初期有益微生物數(shù)量少，繁殖速度慢，因此發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、易產(chǎn)生臭味，堆肥效率低下。而在堆肥化過程中添加外源菌劑有利于畜禽糞便堆肥腐熟。但是當(dāng)前市場(chǎng)上成熟的商品菌劑多為國(guó)外引進(jìn)，價(jià)格昂貴，種類不多，應(yīng)用范圍寬泛。接種這些外源菌劑，在初期容易出現(xiàn)堆料中土著微生物與之激烈的競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致外源菌劑無法在堆料中快速定殖，因此發(fā)揮的作用大打折扣。同時(shí)，由于已有的商品菌劑大多缺乏針對(duì)性，在北方低溫季節(jié)接種后，堆料很難迅速升溫，無法及時(shí)發(fā)揮應(yīng)有的作用。目前我國(guó)北方地區(qū)在低溫季節(jié)存在糞污無法及時(shí)的連續(xù)處理導(dǎo)致大量堆積、需要增加額外的糞污存儲(chǔ)場(chǎng)地或設(shè)施、有機(jī)肥生產(chǎn)在低溫季節(jié)無法正常運(yùn)行等問題。因此篩選能在低溫季節(jié)使堆料迅速升溫的微生物菌株，對(duì)于解決北方地區(qū)糞污的連續(xù)處理和有機(jī)肥生產(chǎn)周年進(jìn)行具有重要的實(shí)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明首先提供淀粉霉(Amylomyces rouxii)新菌株CZl。
[0005]本發(fā)明還提供含有所述淀粉霉CZl的菌劑。
[0006]本發(fā)明的菌株分離與篩選過程如下:
[0007]①采用平板稀釋法分別從新鮮牛糞、高溫發(fā)酵階段牛糞以及腐熟后的牛糞中進(jìn)行微生物分離。稱取各樣品各IOg分別放入裝有90mL無菌水的三角瓶中，在搖床上振蕩30min，使樣品充分分散，靜置20min后即為KT1稀釋液，然后連續(xù)稀釋制成10_2_10_8濃度的稀釋液備用。取100 μ L各濃度的稀釋液，采用常規(guī)涂抹法用涂布器在改良高氏I號(hào)固體培養(yǎng)基上涂布，每個(gè)濃度梯度三個(gè)重復(fù)，分別置于25°C、35°C、50°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，進(jìn)一步純化培養(yǎng)，并于4°C保存。
[0008]改良高氏I號(hào)培養(yǎng)基，其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、瓊脂
1.5%-2.0%。
[0009]②根據(jù)菌株在纖維素一剛果紅平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈與菌落直徑比值(D/d)的大小，篩選出了 I株中溫菌，該菌株在培養(yǎng)的第2天即出現(xiàn)清晰的透明圈，在培養(yǎng)第4天D/d達(dá)到10.7。該菌株菌落邊緣不整齊絨毛長(zhǎng)，草叢狀，潔白色，毛上有黑色孢子。
[0010]③測(cè)定該菌株的ITS序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，所用引物為ITSl:TCCGTAGGTGAACCTGCGG (SEQ ID N0.2) ；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC (SEQ ID N0.3)，序列如SEQ ID N0.1所示，與其它公布的淀粉霉的ITS序列同源性為99%以上，鑒定為淀粉霉(Amylomyces rouxii),命名為CZl,并于2012年11月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6874。
[0011]本發(fā)明的淀粉霉CZl可制備成菌劑，其中，淀粉霉CZl的活菌數(shù)可為50億/克以上，優(yōu)選為100億/克以上。
[0012]本發(fā)明還提供所述生物菌劑的制備方法，其為在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵淀粉霉CZ1，將得到的發(fā)酵液即為生物菌劑。
[0013]其中，優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基。
[0014]優(yōu)選的，所述的制備方法可具體包括如下步驟:
[0015]將淀粉霉CZl接種至改良高氏I號(hào)固體培養(yǎng)基斜面，于35°C恒溫條件培養(yǎng)48_72h得到斜面種子；`
[0016]將斜面種子接種至改良高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基，于35°C恒溫條件，120-200r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48-72h得到液體種子；
[0017]將液體種子以0.5-10% (V/V，即每100ml液體培養(yǎng)基接種0.5-lOml液體種子)接種量，接種到液體發(fā)酵罐中的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，進(jìn)行菌種生產(chǎn)，于持續(xù)通氣條件下，35°C恒溫培養(yǎng)3-4天。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌種盛放于滅菌的容器內(nèi)，置于陰涼干燥處保存。
[0018]優(yōu)選的，還可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法將制備的淀粉霉CZl發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，從而制備凍干粉形式的生物菌劑。
[0019]在堆體中接種本發(fā)明的淀粉霉新菌株CZ1，能在環(huán)境溫度為8°C左右的條件下，使堆肥迅速起爆，且能使堆體保持50°C以上的高溫15天，縮短了發(fā)酵周期，能有效殺滅動(dòng)物糞便中的病原物和寄生蟲。堆肥發(fā)酵結(jié)束后，堆肥產(chǎn)物養(yǎng)分含量高，PH8.0左右，可作為優(yōu)良的植物有機(jī)肥使用。該菌株適于北方低溫季節(jié)畜禽糞便的堆肥化處理，對(duì)于解決北方地區(qū)低溫季節(jié)糞污無法及時(shí)處理而導(dǎo)致糞污堆積、額外增加糞污存儲(chǔ)場(chǎng)地或設(shè)施、有機(jī)肥生產(chǎn)暫停等問題具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可以實(shí)現(xiàn)北方地區(qū)養(yǎng)殖糞污的連續(xù)處理和有機(jī)肥生產(chǎn)周年進(jìn)行。
[0020]本發(fā)明提供了一種適于北方低溫季節(jié)畜禽糞便堆肥化處理的微生物菌株。該菌株來源于不同發(fā)酵階段的畜禽糞便，經(jīng)過馴化配比后又應(yīng)用于畜禽糞便堆肥過程，保證了菌劑的分離環(huán)境與目標(biāo)應(yīng)用環(huán)境的相似性，提高了菌劑的有效性，解決了通常情況下堆肥添加外源菌劑無法與堆料中土著微生物競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致在堆料中難于快速定殖的困難。同時(shí)解決了北方地區(qū)低溫季節(jié)糞污無法及時(shí)處理而導(dǎo)致的糞污堆積、額外增加糞污存儲(chǔ)場(chǎng)地活設(shè)施，有機(jī)肥生產(chǎn)暫停等局面，可以實(shí)現(xiàn)北方地區(qū)糞污的連續(xù)處理和有機(jī)肥生產(chǎn)周年進(jìn)行。
[0021]說明書附圖
[0022]圖1所示為不同堆肥處理溫度變化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0024]若無特別說明，本發(fā)明中所述的“份”是指“重量份”;
[0025]實(shí)施例1淀粉霉菌劑的制備
[0026]將淀粉霉CZl接種至改良高氏I號(hào)固體培養(yǎng)基斜面，于35°C恒溫條件培養(yǎng)72h得到斜面種子；
[0027]將斜面種子接種至改良高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基，于35°C恒溫條件，180r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)72h得到液體種子；
[0028]將液體種子以5% (V/V,即每100ml液體培養(yǎng)基接種5ml液體種子)接種量,接種到液體發(fā)酵罐中的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，進(jìn)行菌種生產(chǎn)，于持續(xù)通氣條件下，35°C恒溫培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后的發(fā)酵液即可作為菌劑使用。
[0029]所述的改良高氏I號(hào)固體培養(yǎng)基成分為:其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、瓊脂2.0%，分裝入試管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高溫高壓滅菌20min，之后擺成斜
面。`
[0030]所述的改良高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基成分同前，無瓊脂。
[0031]實(shí)施例2
[0032]將新鮮牛糞與粉碎秸桿以一定比例進(jìn)行混合，調(diào)整堆料的C/N為28-32，含水量為60%。
[0033]將實(shí)施例1生產(chǎn)的菌劑按照質(zhì)量比5%。接種到堆料混合物中，定期翻堆通氣，進(jìn)行堆肥發(fā)酵。同時(shí)以不接入本發(fā)明的菌劑的堆體為對(duì)照。
[0034]接種本發(fā)明所述微生物菌劑的堆料與自然堆肥的堆料相比(見表1及圖1)，在低溫環(huán)境條件(5°C左右)下，堆料起爆速度快，升溫迅速，堆體最高溫度高，發(fā)酵周期短，其C/N下降迅速，這些結(jié)果表明向以牛糞為主的堆料中接種本發(fā)明所述的微生物菌劑能夠在北方低溫季節(jié)加快堆料的腐熟進(jìn)程。
[0035]堆肥結(jié)束后及時(shí)取樣，用小土鉆鉆取堆體表層下40~50cm處樣品，風(fēng)干后研磨，測(cè)定有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀含量。通過對(duì)比分析接種本發(fā)明所述微生物菌劑的堆肥產(chǎn)物與自然堆肥的產(chǎn)物中養(yǎng)分含量(見表2)，發(fā)現(xiàn)接種本發(fā)明所述微生物菌劑的堆肥產(chǎn)物中，其全氮、全磷、全鉀以及有機(jī)質(zhì)含量均顯著高于自然堆肥的產(chǎn)物，這表明向以牛糞為主的堆料中接種本發(fā)明所述的菌劑更有利于堆料中養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與保存。
[0036]表1本發(fā)明所述微生物菌劑對(duì)堆肥腐熟程度的影響
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種淀粉霉(Amylomyces rouxii)新菌株 CZl，其保藏號(hào)為 CGMCC N0.6874。
2.含有權(quán)利要求1所述菌株的生物菌劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物菌劑，其中淀粉霉CZl的活菌數(shù)為50億/克以上。
4.制備權(quán)利要求2或3所述的生物菌劑的方法，其為在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵淀粉霉CZ1，將得到的發(fā)酵液即為生物菌劑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其還包括將淀粉霉CZl發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，制備成的凍干粉為生物 菌劑。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103497898SQ201310425145
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】劉克鋒, 王順利, 王紅利, 高程達(dá), 石愛平 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院