一種提取高純度海參多肽的方法
【專利摘要】本發明提供一種提取高純度海參多肽的方法，包括有包括以下步驟：1）將海參進行酶切；2）將滅酶滅菌后的海參酶解液冷卻至室溫后，離心，收集上清液，得海參多肽提取液；3）將海參多肽提取液直接加入大孔吸附樹脂柱進行反復多次吸附，吸附結束后，用洗脫液進行洗脫，收集洗脫液，將溶液干燥后得到海參多肽產品。本發明方法的海參多肽的提取率大于70%，提取純化的海參多肽純度均達到90%以上，而且大孔吸附樹脂的再生性能好，可以再生重復使用，洗脫劑無毒無害，也可以回收多次利用。
【專利說明】一種提取高純度海參多肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于天然產物提取分離【技術領域】，具體涉及一種提取高純度海參多肽的方法，即利用高速剪切技術、酶切技術和大孔樹脂混合模擬移動床技術從海參中提取高純度海參多肽的方法。
【背景技術】
[0002]海參(Sea cucumber)是棘皮動物門海參綱生物的總稱,近年來,隨著市場需求的持續升溫，海參養殖業發展迅猛，目前，我國海參的年產量約14萬噸，主要集中在山東沿海，山東省海參年產量為7萬多噸，占全國海參產量的一半以上，養殖年產值即達160億元，且每年還在以20%的增長速度在發展，海參養殖產業已成為山東省水產養殖支柱產業之一，在當地的水產養殖生產中占有舉足輕重的地位。
[0003]海參有著悠久的歷史，在中國，很多年前就被當作高級滋補品名列八珍之首；在大連，很多老人長久以來就保留著進補海參的習慣；在膠東，眾海參商家旌旗飄舞；在內陸，更多的人開始了解海參；在廣東，北方的海參供不應求。由于傳統的粗加工而成的原生態海參食用起來比較繁瑣，而且不易保鮮保質，此外，由于海參的特殊形態，在產品的運輸和儲藏上也有一定的問題。針對這種狀況，海參生產企業推出了 “精細加工”的策略:高壓即食海參、海參罐頭、凍干即食、海參粉膠囊、海參多肽、海參酒等一系列以海參為原料的海參新產品應運而生。在高新技術的支持下，這些新產品目標市場直指外埠。這些海參產品方便消費者食用，有很大的市場需求。就全國市場而言，精細加工的海參產品必將成為未來海參企業的主導方向。
[0004]海參含有豐富的蛋白質，是制備多肽的理想原料。海參多肽市場尚處萌芽階段，目前主要應用于食品、保健品和化妝品等領域，隨著研究的不斷深入，海參多肽的應用領域不斷加大，消費的上升潛力很大，產品價格未來將相對穩定。隨著人民生活水平的提高，國內大中城市的高端消費群體對海參多肽產品的需求還在不斷增加，海參多肽產品市場短期內尚供不應求。
[0005]目前，海參多肽的提取純化工藝已經開始相關的研究，并取得了一定的研究成果。現階段而言，海參多肽的提取純化工藝主要通過膜過濾法，該方法基本工藝為:海參粉碎后，加入適量的酶進行酶解，酶解液進行膜過濾，得到一定分子量范圍的物質。該方法優點是工藝簡單，得到的多肽分子量區間相對集中，缺點是產品中含雜質太多，純度不高，而且對濾膜的消耗量太大，成本較高。
[0006]海參多肽純度高低，直接決定了產品的品質和用途。因此，制備高純度的海參多肽成為本領域目前迫切需要解決的技術難題。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于提供一種以海參為原料，針對現有技術中存在的缺陷和不足，結合高速剪切技術、酶切技術和大孔樹脂混合模擬移動床技術從海參中純化高純度海參多。肽，從而彌補現有技術的不足。
[0008]本發明的方法，包括以下步驟:
[0009]I)向處理后的新鮮海參或水發后的海參中加入去離子水粉碎，置入發酵罐中，然后向發酵罐中加入蛋白酶進行酶切，酶切后進行高溫滅酶滅菌；
[0010]2 )將滅酶滅菌后的海參酶解液冷卻至室溫后，離心，收集上清液，得海參多肽提取液；
[0011]3)將海參多肽提取液直接加入大孔吸附樹脂柱進行反復多次吸附，流速為5~10BV/h(柱體積，簡稱BV)，收集吸附殘液；吸附結束后，用10~40BV的洗脫液進行洗脫，流速為5~10BV/h，收集洗脫液，并與吸附殘液合并；將溶液干燥后得到海參多肽產品。
[0012]步驟I)中的粉碎方法為高速剪切機、均質機、膠體磨、勻漿機等中的一種或幾種。
[0013]步驟I)中的蛋白酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶中的一種或幾種的復合酶。
[0014]步驟3)中大孔吸附樹脂與海參多肽提取液的質量比為20:1~10，樹脂柱徑高比為 1:4 ~1:12 ;
[0015]為了獲得更好的分離效果，其中步驟3)中的大孔吸附樹脂為混合樹脂，其中AB-8:D101:LSA-21 的質量比為 2:1:1 ；
[0016]步驟3)中的洗脫 液中乙酸乙酯:乙醇:水的體積比為0.5:1:98.5。
[0017]步驟3)中的干燥方法為噴霧干燥、微波干燥、真空干燥，鼓風干燥中的一種或幾種。
[0018]本發明方法的海參多肽的提取率大于70%，提取純化的海參多肽純度均達到90%以上，而且大孔吸附樹脂的再生性能好，可以再生重復使用，洗脫劑無毒無害，也可以回收多次利用。本發明與已有技術方法相比，特點在于提供了一種提取高純度海參多肽的制備工藝；而生產過程中使用綠色溶劑，成本低、效率高、環境友好；工藝路線簡單，可為藥物、保健品或食品等提供高純度的海參多肽。本發明可進一步促進海參多肽的產業化開發。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1:本發明的工藝流程示意圖。
【具體實施方式】
[0020]在海參多肽的提取中，洗脫液的組分及配比對提取效果具有重要的影響，既要保證提取率，又要保證純度。因此， 申請人:經過長期的研究，確定海參多肽提取的洗脫液的組分及配比。
[0021]實施例1
[0022]稱取處理后的新鮮海參120g置于燒杯中，加入600ml去離子水浸泡，用高速剪切機進行剪切粉碎，將剪切后的海參溶液置于發酵罐中，用去離子水稀釋至3000ml，然后向發酵罐中分別加入Ig木瓜蛋白酶和0.6g胃蛋白酶的復配酶，在45°C下，酶切3h后，利用發酵罐在121°C下滅酶滅菌20min。將滅酶滅菌后的海參酶解液冷卻至室溫后，4000r/min下離心15min，收集上清液，得海參多肽提取液。[0023]稱取300g NKA-9型大孔吸附樹脂與320g AB-8型大孔吸附樹脂在水溶液中均勻混合，濕法裝入一根內徑8cm、柱高120cm的玻璃柱中，利用泵將海參多肽提取液由下端泵入大孔樹脂混合柱中進行反復吸附3次，流速為6BV/h，收集吸附殘液；吸附結束后，用IOBV的乙酸乙酯:乙醇:水(0.5:1:98.5，v/v)進行洗脫，流速為5BV/h，收集洗脫液，并與吸附殘液合并，將合并溶液噴霧干燥后得到海參多肽產品。
[0024]對本品進行高效液相色譜法(HPLC法)檢驗，海參多肽的純度為80.3%，海參多肽的提取率為73%。樹脂柱以70%乙醇除雜后，再以95%乙醇再生重復使用，并回收溶劑。
[0025]上述的液相色譜法的測定條件如下:
[0026]色譜柱:TSKgelG2000SWXL (300mm 1.D.X 7.8mm);
[0027]流動相:乙腈:7jC:三氟乙酸為20:80:0.03 (體織比〉。
[0028]流速為0.5mL/min ；
[0029]檢測波長為214nm ；
[0030]進樣量為10 μ L。
[0031]實施例2
[0032]稱取處理后的新鮮海參200g置于燒杯中，加入800ml去離子水浸泡，用高速剪切機進行剪切粉碎，然后用均質機均質，將均質后的海參溶液置于發酵罐中，用去離子水稀釋至10000ml，然后向發酵罐中分別加入Ig風味蛋白酶和Ig胰蛋白酶的復配酶，在50°C下，酶切2h后，利用發酵罐在121°C下滅酶滅菌25min。將滅酶滅菌后的海參酶解液冷卻至室溫后，4000r/min下離心15min，收`集上清液，得海參多肽提取液。
[0033]為了獲得更好的分離效果，稱取950g型號為AB-8:D101:LSA_21 (2:1:1)均勻混合的大孔吸附樹脂，濕法裝入一根內徑10cm、柱高150cm的玻璃柱中，利用泵將海參多肽提取液由下端泵入大孔樹脂混合柱中進行反復吸附3次，流速為5BV/h，收集吸附殘液；吸附結束后，用IOBV的乙酸乙酯:乙醇:水(0.5:1:98.5，v/v)進行洗脫，流速為8BV/h，收集洗脫液，并與吸附殘液合并，將合并溶液噴霧干燥后得到海參多肽產品。
[0034]對本品進行高效液相色譜法(HPLC法)檢驗，海參多肽的純度為93.2%，海參多肽的提取率為85%。樹脂柱以70%乙醇除雜后，再以95%乙醇再生重復使用，并回收溶劑。
[0035]實施例3
[0036]稱取處理后的新鮮海參IKg置于燒杯中，加入4000ml去離子水浸泡，用高速剪切機進行剪切粉碎，然后用膠體磨均質，將均質后的海參溶液置于發酵罐中，用去離子水稀釋至20L，然后向發酵罐中分別加入40g中性蛋白酶，在50°C下，酶切3h后，利用發酵罐在121°C下滅酶滅菌25min。將滅酶滅菌后的海參酶解液冷卻至室溫后，4000r/min下離心15min,收集上清液，得海參多肽提取液。
[0037]稱取IOkg型號為AB-8:D101:LSA_21 (2:1:1)均勻混合的大孔吸附樹脂，濕法裝入一根內徑30cm、柱高350cm的不銹鋼柱中，利用泵將海參多肽提取液由下端泵入大孔樹脂混合柱中進行反復吸附5次，流速為10BV/h，收集吸附殘液；吸附結束后，用30BV的乙酸乙酯:乙醇:水(0.5:1:98.5，v/v)進行洗脫，流速為8BV/h，收集洗脫液，并與吸附殘液合并，將合并溶液噴霧干燥后得到海參多肽產品。而樹脂柱以70%乙醇除雜后，再以95%乙醇再生重復使用。
[0038]對本品進行高效液相色譜法(HPLC法)檢驗，海參多肽的純度為91%，海參多肽的提取率為83%。 結果表明，使用的洗脫液能夠滿足提取率和純度兩方面的要求。
【權利要求】
1.一種提取高純度海參多肽的方法，包括以下步驟: O向處理后的新鮮海參或水發后的海參中加入去離子水粉碎，置入發酵罐中，然后向發酵罐中加入蛋白酶進行酶切，酶切后進行高溫滅酶滅菌； 2)將滅酶滅菌后的海參酶解液冷卻至室溫后，離心，收集上清液，得海參多肽提取液； 3)將海參多肽提取液直接加入大孔吸附樹脂柱進行反復多次吸附，流速為5~IOBV/h (柱體積，簡稱BV)，收集吸附殘液；吸附結束后，用10~40BV的洗脫液進行洗脫，流速為5~10BV/h，收集洗脫液，并與吸附殘液合并；將溶液干燥后得到海參多肽產品。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟I)中的蛋白酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶中的一種或幾種。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3)中大孔吸附樹脂與海參多肽提取液的質量比為20:1~10。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3)中大孔吸附樹脂的樹脂柱徑高比為1:4~12。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3)中的大孔吸附樹脂為混合樹月旨，其中AB-8 =DlOl:LSA-21的質量比為2:1:1。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3)中的洗脫液，其中乙酸乙酯:乙醇:水的體積比為0.5:1:98.5。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3)中的干燥方法為噴霧干燥、微波干燥、真空干燥，鼓風干燥中.的一種或幾種。
【文檔編號】C12P21/06GK103468775SQ201310439122
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年6月5日
【發明者】裴棟, 邸多隆, 魏鑒騰 申請人:青島耐特生物技術有限公司