一種發酵酶解制備幾丁聚糖的方法
【專利摘要】本發明公開了一種發酵酶解制備幾丁聚糖的方法，包括如下步驟：將蟹殼或蝦殼干燥、粉碎；發酵；酶解脫鈣和脫蛋白；酶解脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。本發明的酶解工藝與現有技術制相比，脫鈣與脫蛋白在同一步驟中實現，大大提高生產效率，無須使用強酸和強堿，耗能低，無污染，更加環保。酶解后的游離鈣溶液經回收后可以制備成有機鈣制劑，這樣所有的產物都能夠被合理利用產生顯著的經濟價值。
【專利說明】一種發酵酶解制備幾丁聚糖的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及幾丁聚糖制備方法，屬于制造領域。

【背景技術】
[0002]甲殼素是一種天然含氮多糖物質，廣泛存在與無脊椎動物的外殼或角質層中，尤其是蝦蟹類的外殼中。甲殼素很容易獲得，可再生，是僅次于纖維素的天然均聚物，但是因分子內部有很強的氫鍵作用，溶解性低，應用范圍受到限制。
[0003]甲殼素脫乙酰后生成殼聚糖。目前殼聚糖的制備多采用化學法和酶解法脫乙酰。化學法脫乙酰反應中，影響脫乙酰的因素很多，但是主要影響因素包括:堿液濃度、反應溫度和時間。一般來說，提高反應溫度和延長反應時間均可提高脫乙酰度，但是會導致甲殼素主鏈降解增加，從而影響產品的粘度和分子量。通入氮氣可以在一定程度上減緩主鏈的降解。由于化學法使用的堿液濃度高，反應時間長，產品質量不穩定，環境污染嚴重。
[0004]酶解法不會降解主鏈，并且無污染，具有重要的研究開發價值。影響酶解的因素很多，主要包括PH值和溫度。文獻記載最適宜PH值4-8，最適宜溫度30-70°C (《甲殼酶特性與應用研究》萬云洋等《天然產物研究與開發》2003 vol 15 N0.6)。迄今為止發現的真菌甲殼質脫乙酰酶(CDA)都是糖蛋白，且有良好的熱穩定性。但是不同來源CDA的存在位置、最適宜PH值(PH4.5-12)、碳水化合物含量、相對分子質量及離子影響等有較大的差異。
[0005]迄今報道的CDA基本都來源于真菌。真菌來源的CDA主要作用是自身細胞壁的合成，最適底物一般為甲殼寡糖，對甲殼質的活性較低，不適合用酶法脫乙酰生產殼聚糖。真菌來源的CDA來源廣泛，獲取容易，成本相對較低。因此如何能夠將真菌來源的CDA用于制備殼聚糖成為本領域技術人員急需解決的問題。


【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種新的幾丁聚糖制備方法，所述的方法能夠較現有技術更節能環保。
[0007]本發明的另一目的是提供一種用真菌來源的CDA制備幾丁聚糖的方法，所述的方法能夠解決現有技術CDA不適于生產幾丁聚糖的技術難題。
[0008]本發明的另一目的是提供一種安全的幾丁聚糖制備方法，所述的方法制得的幾丁聚糖無強酸或強堿殘留，產品更安全。
[0009]本發明的另一目的是提供一種具有市場競爭力的幾丁聚糖，所述的產品不因工藝的改進而增加生產成本。
[0010]為達到上述目的，本發明采用下列技術方案實現:
干燥、超微粉碎、發酵；酶解脫鈣和蛋白、過濾；酶解脫乙酰、水洗干燥即得。
[0011]本發明采用制備方法對脫鈣前的蟹殼或蝦殼進行預處理，然后再進行酶解脫鈣和脫蛋白。
[0012]為增強脫鈣和脫蛋白效果，本發明優選的將蟹殼或蝦殼粉碎至0.5~1.0mm顆粒，顆粒過小則增加生產成本，顆粒過大效果較差。發明人經過多次試驗及經驗，最終確定0.5~1.0mm顆粒范圍達到脫鈣和成本的最佳性價比。
[0013]發明人提供大量實驗，意外發現多種乳酸菌按照一定的配比組合進行發酵后脫鈣效果更好，而采用乳雙歧桿菌(B.lactis)、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)和瑞士乳桿菌(L.helviticus)三種乳酸菌進行發酵效果較好；采用此三種乳酸菌配比后發酵效果最好，當三種乳酸菌以重量比2:6:5進行組合時，游離鈣含量較單一乳酸菌發酵后提高10%~20%。優選的，乳酸菌占蟹殼或蝦殼原料重量比為0.02~0.06%。
[0014]本發明采用高溫滅菌的方法達到殺菌消毒的目的，同時也去除酶解液中的乳酸菌。
[0015]本發明的酶解采用復合酶解方法，經過篩選后，最終發現用木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶進行酶解較其他蛋白酶具有更好的效果。當然，選用其他蛋白酶進行酶解也能夠實現本發明的目的。本發明工藝中最佳酶解方案是將蟹殼或蝦殼粉碎后的原料中加入4-8倍重量體積比的水制成料液，加入乳酸菌發酵36h，然后70~100°C，20min ;發酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2~5的復合蛋白酶，加檸檬酸調PH值至5.5~6.5，40~60°C攪拌I~2h ;分離液體，殘渣再次重復提取。
[0016]酶解殼料所用的復合蛋白酶占殼料重量比為0.05~0.2%為佳。
[0017]酶解除具有脫蛋白的效果外，還具有脫鈣的作用。酶解可以將發酵后的產品中鈣元素游離出來，達到脫鈣效果。
[0018]酶解脫蛋白后，過濾，濾液回收干燥得有機鈣。殘渣中加入含有甲殼質脫乙酰酶的發酵液脫乙酰，甲殼質與發酵液的重量體積比(g/1) I~3:1~6，30~32°C，48~72h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0019]所述的可以從公開市場上購得，也可以通過構巢曲霉菌發酵后制得。
[0020]所述的甲殼質脫乙酰酶制備方法如下:
(1)制備發酵培養基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發酵條件:發酵培養基滅菌，接種構巢曲霉菌，30~35°C，PH6.0~7.0，72~96h。
[0021]經過酶解脫鈣和脫蛋白后，去除了原料中的鈣離子、蛋白質其它有機物質。
[0022]本發明所述的幾丁聚糖脫乙酰度高達95%以上。
[0023]本發明的產物與任何一種或一種以上藥劑學上輔料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉硅膠、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甘氨酸等混合制成的各種劑型，例如，可制成片齊?、緩釋片、滴丸、顆粒齊?、膠囊齊?、微粒劑。優選劑型為膠囊劑或顆粒劑。
[0024]本發明的酶解工藝與現有技術制相比，脫鈣與脫蛋白在同一步驟中實現，大大提高生產效率，無須使用強酸和強堿，耗能低，無污染，更加環保。酶解后的游離鈣溶液經回收后可以制備成有機鈣制劑，這樣所有的產物都能夠被合理利用產生顯著的經濟價值。

【具體實施方式】
[0025]實施例1
制備甲殼質脫乙酰酶:(1)制備發酵培養基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/1) 10ml，水 1000ml ；
(2)發酵:發酵培養基滅菌，接種構巢曲霉菌，35°C，PH6.0,發酵72h。
[0026]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.5_顆粒，加入4倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.02%,發酵36h，然后70~100°C，20min ;發酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2的復合蛋白酶，蛋白酶占殼料重量比為0.05%，加檸檬酸調PH值至5.5，40°C攪拌Ih ;分離液體，殘渣再次重復提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質脫乙酰酶的發酵液脫乙酰，甲殼質與發酵液的重量體積比1:1，30°C，48h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0027]實施例2
制備甲殼質脫乙酰酶:
(1)制備發酵培養基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發酵條件:發酵培養基滅菌，接種構巢曲霉菌，30°C，PH7.0，72h。
[0028]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至1.0mm顆粒，加入8倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.06%,發酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1: 5的復合蛋白酶，蛋白酶占殼料重量比為0.2%，加檸檬酸調PH值至6.5，60°C攪拌2h ;分離液體，殘渣再次重復提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質脫乙酰酶的發酵液脫乙酰，甲殼質與發酵液的重量體積比1: 6，320C，72h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0029]實施例3 制備甲殼質脫乙酰酶:
(1)制備發酵培養基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發酵條件:發酵培養基滅菌，接種構巢曲霉菌，33°C，PH6.5，96h。
[0030]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.5mm顆粒，加入8倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.04%,發酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1: 5的復合蛋白酶，蛋白酶占殼料重量比為0.1%，加檸檬酸調PH值至6.5，60°C攪拌2h ;分離液體，殘渣再次重復提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質脫乙酰酶的發酵液脫乙酰，甲殼質與發酵液的重量體積比3: 6，31°C，72h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0031]實施例4 制備甲殼質脫乙酰酶:
(1)制備發酵培養基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發酵條件:發酵培養基滅菌，接種構巢曲霉菌，32°C，PH6.6，72h。
[0032]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至1.0mm顆粒，加入4倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.05%,發酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2的復合蛋白酶，蛋白酶占殼料重量比為0.15%，加檸檬酸調PH值至6，40°C攪拌2h ;分離液體，殘渣再次重復提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質脫乙酰酶的發酵液脫乙酰，甲殼質與發酵液的重量體積比1:3，320C ,48~72h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0033]實施例5 制備甲殼質脫乙酰酶:
(1)制備發酵培養基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發酵條件:發酵培養基滅菌，接種構巢曲霉菌，34°C，PH6.l，72h。
[0034]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.8mm顆粒，加入6倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.03%,發酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:3的復合蛋白酶，蛋白酶占殼料重量比為0.12%，加檸檬酸調PH值至5.5，50°C攪拌2h ;分離液體，殘渣再次重復提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質脫乙酰酶的發酵液脫乙酰，甲殼質與發酵液的重量體積比1:5，31.5°C，64h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0035]實施例6 制備甲殼質脫乙酰酶:
(1)制備發酵培養基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發酵條件:發酵培養基滅菌，接種構巢曲霉菌，32°C，PH6.0，80h。
[0036]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.9mm顆粒，加入5倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.06%,發酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2.5的復合蛋白酶，蛋白酶占殼料重量比為0.18%，加檸檬酸調PH值至6.5，55°C攪拌Ih ;分離液體，殘渣再次重復提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質脫乙酰酶的發酵液脫乙酰，甲殼質與發酵液的重量體積比3:5，320C，56h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0037]實施例7 制備甲殼質脫乙酰酶:
(1)制備發酵培養基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發酵條件:發酵培養基滅菌，接種構巢曲霉菌，35°C，PH6.0，96h。
[0038]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.6_顆粒，加入7倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.05%,發酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:4的復合蛋白酶，蛋白酶占殼料重量比為
0.08%， 加檸檬酸調PH值至5.5，45°C攪拌1.5h ;分離液體，殘渣再次重復提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質脫乙酰酶的發酵液脫乙酰，甲殼質與發酵液的重量體積比1:3,30°C，72h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
【權利要求】
1.一種發酵酶解制備幾丁聚糖的方法，包括如下步驟: (1)將蟹殼或蝦殼干燥、粉碎； (2)發酵 (3)蛋白酶酶解脫鈣和脫蛋白； (4)酶解脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，將蟹殼或蝦殼粉碎至0.5~1.0mm大小。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的發酵采用乳酸菌。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的乳酸菌是乳雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌復合菌。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的乳酸菌重量比是乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5。
6.根據權利要求3、4或5所述的制備方法，其特征在于，乳酸菌占蟹殼或蝦殼原料重量比為 0.02 ~0.06%ο
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的酶解是發酵液中加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2~5的復合蛋白酶，加檸檬酸調PH值至5.5~6.5，40~60 V攪拌I~2h。
8.根據權利要求1或7所述的制備方法，其特征在于，所述的蛋白酶占殼料重量比為0.05 ~0.2%ο
9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的脫乙酰是殘渣中加入含有甲殼質脫乙酰酶的發酵液脫乙酰，甲殼質與發酵液的重量體積比I~3:1~6，30~320C，48 ~72h，0.2MPa，然后 120°C滅菌 20min，干燥即得。
10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述的甲殼質脫乙酰酶制備方法是: (1)制備發酵培養基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 0.01mol/l 的二氯化鈷 10ml，水 100ml ； (2)發酵條件:發酵培養基滅菌，接種構巢曲霉菌，30~35°C，PH6.0~7.0，72~96h。
【文檔編號】C12P19/26GK104046666SQ201310450576
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】李瑩, 楊國元, 田志同, 白潔, 李雨田, 李卉婷, 苗勝昆 申請人:天津天獅生物發展有限公司