一種提高聚酮類化合物發酵產量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高聚酮類化合物發酵產量的方法。其包括步驟：在添加了天然油脂的培養基中培養過表達?；o酶A合成酶和?；d體蛋白的基因工程菌，從發酵產物中提取聚酮類化合物，所述的基因工程菌為將含有表達?；o酶A合成酶和?；d體蛋白的重組表達載體的重組大腸桿菌接合轉移放線菌制得的過表達酰基輔酶A合成酶和酰基載體蛋白的重組表達轉化體。該方法在于通過基因工程技術在聚酮類化合物的產生菌中過量表達外源的?；o酶A合成酶和?；d體蛋白，使之利用廉價的天然油脂為原料，提高聚酮類化合物的發酵產量。該方法未見文獻報道。該方法操作簡單易行，且利用廉價的天然油脂為聚酮類化合物提供合成前體，成本很低，便于推廣應用。
【專利說明】-種提高聚鋼類化合物發酵產量的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種提高聚麗類化合物發酵產量的方法。

【背景技術】
[0002] 聚麗類化合物是一類重要的次級代謝產物，它是由簡單脂肪酸經過類似長鏈脂肪 酸的合成途徑生成的，所得的化合物具有一系列復雜的結構，結構的多樣性導致了生物活 性的多樣性。在自然界中已發現的天然聚麗物質約有2萬種，大多數抗生素和一些其他的 重要藥物如抗癌藥、免疫抑制劑等均屬于該個大家族。作為治療藥用途的該類化合物包括 臨床上應用的紅霉素、四環素、利福霉素、兩性霉素、阿霉素、洛伐他了、雷帕霉素等重要抗 生素，W及農牧業用的阿弗菌素和莫能星、泰樂菌素等。
[0003] 許多有生物活性的聚麗類化合物由于其宿主不能進行大規模發酵生產而受到限 巧1|(如海綿和腰鞭毛蟲的共生菌)，或由于宿主菌難于培養而產率很低。目前有研究將該些 生物中合成聚麗類化合物的途徑轉入合適的宿主，W提高目的產物的產率，常用的宿主如 大腸桿菌、鏈霉菌W及植物等。
[0004] 但是，生物代謝通路在異源宿主中的復制并非一個簡單的技術問題，為了進一步 提高聚麗類化合物的發酵產量，有必要對其進行進一步研究，開發新的方法。


【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是針對現有的聚麗類化合物的發酵產量不夠高，難W 滿足實際應用需求的現狀，提供一種提高聚麗類化合物發酵產量的方法。本發明通過基因 工程技術改造放線菌，使之能夠利用廉價的原料增加胞內醜基輔酶A的含量，為聚麗類次 級代謝產物的合成提供前體，從而大大提高聚麗類化合物的發酵產量。
[0006] 本發明提供的技術方案之一是；一種提高聚麗類化合物發酵產量的方法，其包括 步驟；在添加了天然油脂的培養基中培養過表達醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的基因 工程菌，從發酵產物中提取聚麗類化合物，所述的基因工程菌為將含有表達醜基輔酶A合 成酶和醜基載體蛋白的重組表達載體的重組大腸桿菌接合轉移放線菌制得的過表達醜基 輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的重組表達轉化體。
[0007] 本發明中，所述的過表達醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的基因工程菌能夠過 表達外源的醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白，使所述基因工程菌能夠利用廉價的原料增 加胞內己醜輔酶A和丙醜輔酶A的含量，從而豐富聚麗類化合物的直接合成前體，提高聚麗 類化合物的產量。
[0008] 本發明中，所述的提高聚麗類化合物發酵產量的方法還包括所述的基因工程菌的 制備步驟：將表達醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的重組表達載體轉化大腸桿菌，然后 將所得的重組大腸桿菌接合轉移放線菌，所得的過表達醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白 的重組表達轉化體即為所述的基因工程菌。
[0009] 本發明中，所述的醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白優選來源于攻瑰抱鏈霉菌 (Str巧tomyces roseosporus)的醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白，其分別由來源于攻瑰 抱鏈霉菌（Str巧tomyces roseosporus)的化巧和化tF基因編碼，所述的攻瑰抱鏈霉菌 更優選攻瑰抱鏈霉菌NRRL11379菌株。其中，所述的來源于攻瑰抱鏈霉菌（Streptomyces roseosporus)的醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的氨基酸序列分別優選如SEQ ID NO. 1 和SEQ ID NO. 2所示。所述的來源于攻瑰抱鏈霉菌（Streptomyces roseosporus)的Dp1:E 和化tF基因的核巧酸序列分別優選如SEQ ID N03和SEQ ID N04所示。
[0010] 對于上述氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的醜基輔酶A合 成酶和醜基載體蛋白，本領域技術人員知曉，與其具有一定的同源性(較佳地為同源性大于 85%)的同源蛋白應當能夠實現與其相同或基本相同的功能。對于上述核巧酸序列如SEQ ID N03和SEQ ID NO. 4所示的化巧和化tF基因，本領域技術人員知曉，與其具有一定的同源 性(較佳地為同源性大于85%)的同源基因應當能夠實現與其相同或基本相同的功能。
[0011] 本發明中，所述的重組表達載體可通過本領域的常規方法獲得，即；將編碼所述醜 基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的基因連接于表達載體上構建而成。所述的表達載體為本 領域常規，所述表達載體較佳地包括：各種質粒、粘粒、瞻菌體或病毒載體等，優選放線菌常 用的各種整合型或復制型載體，所述的整合型載體包括各種瞻菌體整合位點適用的載體， 如pSET152、pS0K804，pSAM2等，所述的復制型載體優選pWhm3等，本發明中所述的表達載體 最優選為質粒PSET152,即所述的重組表達載體最優選通過將編碼所述醜基輔酶A合成酶 和醜基載體蛋白的基因連接于質粒PSET152構建而成。
[0012] 其中，在所述的重組表達載體中，啟動編碼所述醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋 白的基因表達的啟動子可W為常規，只要其能啟動目標基因表達即可，較佳地，所述的啟動 子為紅霉素抗性基因啟動子erm*E，其編碼核巧酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0013] 本發明中，所述的放線菌為本領域常規所述，只要其存在聚麗類化合物或聚麗 NWS雜合化合物的合成途徑，且能滿足使所述的重組表達載體穩定地自行復制，使所述重 組表達載體攜帶的編碼醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的基因能被有效表達即可。其 中較佳地，所述放線菌為游動放線菌（Actinoplanes sp.)或者吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus),更優選游動放線菌（Actinoplanes sp. )N902-109(陽RM BP-3832)菌株或 者吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus)ATCC29253菌株。將前述重組表達載體轉化 至上述菌株中，即可得本發明優選的基因工程菌株。
[0014] 本發明中，所述的培養基為本領域常規的適合放線菌生長的培養基。所述的天然 油脂為本領域常規，更佳的是天然植物油脂，優選豆油、玉米油和花生油中的任一種或多 種。
[0015] 本發明中，所述的聚麗類化合物為本領域常規所述，優選雷帕霉素。
[0016] 本發明提供的技術方案之二是；一種生產雷帕霉素的基因工程菌，其為將含有表 達醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的重組表達載體的重組大腸桿菌接合轉移放線菌制 得的過表達醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的重組表達轉化體。
[0017] 所述的放線菌為本領域常規所述，只要其存在雷帕霉素的合成途徑，且能滿 足使編碼所述的醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的基因被有效表達即可。其中較 佳地，所述放線菌為游動放線菌（Actinoplanes sp.)或者吸水鏈霉菌（Str巧tomyces hygroscopicus),更優選游動放線菌（Actinoplanes sp. )N902-109(陽RM BP-3832)菌株或 者吸水鏈霉菌ATCC29253菌株。
[0018] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0019] 本發明所用試劑和原料除特別說明之外，均市售可得。
[0020] 本發明的積極進步效果在于：本發明的特點在于提供了一種新的提高聚麗類化合 物發酵產量的方法。本發明的方法在于通過基因工程技術在聚麗類化合物的產生菌中過量 表達醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白，使之利用廉價的天然油脂為培養基原料，過量合 成聚麗類化合物的上游合成底物己醜輔酶A和丙醜輔酶A，從而大幅度提高聚麗類化合物 的發酵產量。本發明的方法尚屬首創，目前為止未見有公開文獻報道過。本發明的操作方 法簡單易行，且利用廉價的天然油脂為聚麗類化合物的合成提供前體物質，成本很低，具有 很好的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明的質粒構建圖譜。
[0022] 圖2顯示過表達化tE和化tF基因對雷帕霉素產量的影響，左邊為野生型的游動 放線菌（Actinoplanes sp. )N902-109(陽RM BP-3832)菌株，右邊為本發明過表達Dp巧和 化tF基因的基因工程菌。

【具體實施方式】
[0023] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0024] 下述實施例中使用的菌株和質粒信息如下：
[00巧]大腸桿菌D冊a (購自TaKaRa公司），攻瑰抱鏈霉菌（Streptomyces roseosporus) NRRL11379 (購自NRRL);大腸桿菌ET12567 (PUZ8002)(購自Biovector中國質粒載體菌 株細胞株基因保藏中也)、質粒PSET152 (購自Biovector中國質粒載體菌株細胞株基因保 藏中也)、pIB139 (購自Biovector中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中也)，pACK4aBS載體 (購自盤古基因有限公司）。游動放線菌（Actinoplanes sp. )N902-109(陽RM BP-3832)菌 株，購自日本IPOD國際專利菌種保藏中也（WTE)，其保藏編號是陽RM BP-3832。
[0026] Kod肥0 plus DM聚合酶購自Toyobo公司；
[0027] 限制性內切酶購自TaKaRa公司或化rmentas公司；
[0028] T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；
[0029] Axygengel純化試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司；
[0030] Eas^aq DNA聚合酶購自全式金生物工程有限公司；
[0031] 其它常規試劑均為國產或進口分裝。
[0032] PCR 儀為 Bio-rad PTC200。
[003引 實施例1攻瑰抱鏈霉菌（Streptomyces roseosporus)基因組的抽提 [0034] 基因組抽提包括下述步驟：
[00巧](1)攻瑰抱鏈霉菌的培養：將攻瑰抱鏈霉菌接種于50ml液體YEME培養基中，所述 YEME培養基包括；0. 3%酵母提取物、0. 5%蛋白腺、0. 3%麥芽糖提取物、1%葡萄糖、10%藏糖 和5mM MgCls，所述的百分比為質量體積百分比（W/V)，28°C (300巧m)培養，使菌體生長至 對數中后期。
[0036] (2)攻瑰抱鏈霉菌的收集：取1ml培養物于1. 5ml EP管中，室溫、80(K)巧m離也 5min，棄上清，沉淀重新息浮于1ml TE (P服.0)緩沖液中。
[0037] (3)菌體裂解；加入6y 150mg/ml的溶菌酶，37C作用30分鐘。再加2mol/ LNaC150y l，10%SDS110y l，20mg/ml的蛋白酶K3y 1，50°C作用化或37°C過夜(此時菌液應 為透明粘稠液體)。
[0038] (4)抽提：菌液均分到兩個1.5ml EP管，加等體積的酷：氯仿：異戊醇 (25 : 24 : 1)，混勻，室溫放置5?lOmin。12000巧m離也lOmin。抽提兩次。
[00測 （5)沉淀；加0. 6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置lOmin。12000巧m離也lOmin。
[0040] (6)洗涂；沉淀用75%的己醇洗涂。
[0041] (7)抽（瞭)干后，溶于50 y 1 d地2〇中，取25 y 1電泳，結果顯示所提取的菌體基因 組質量良好，適合作PCR模板用。
[0042] 實施例2重組表達載體pSET152erm*E-DptEF的構建：
[004引 UDptEF基因的克隆：
[0044] W實施例1所得的攻瑰抱鏈霉菌基因組為模板，利用引物pi和P2進行高保真PCR 擴增，得到約246化P的片段，該片段包含完整的化巧和化tF基因，其完整序列如SEQ ID NO. 6所示。其中，引物pi和p2的序列分別如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示。
[0045] (1)反應體系（50y 1)包括；5y IIOXKOD 肥 0 plus 緩沖液，3y 125mM MgC12, 1.5yl2. 5mmol/L dNTP 溶液，2. 5yl DMS0,30pmol Pl，30pmol P2，1U K孤肥 0 plus DM 聚合酶，50ng基因組，加雙蒸水至50 y 1。
[0046] (2)PCR 反應程序為；95 °C 5min，30 個循環（94 °C 30s，56 °C 30s，72 °C 120s)， 72〇C lOmin。
[0047] PCR片段經過瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒純化回收。
[004引將1 y L pACMaBS載體與3 y L純化片段混合，37C賠育15分鐘，置冰上1?2分 鐘，轉化大腸桿菌D冊a，涂布氨予LB平板。W引物pi和P2進行菌落PCR驗證，能夠擴增 出相應條帶（246化P)的菌落為陽性菌落。挑取陽性菌落經過LB液體培養，抽提質粒，并經 過限制性內切酶（Ndel，甜al)酶切驗證并測序，獲得正確的pACK4aBS-DptEF克隆。
[0049] 2、紅霉素啟動子erm*E的克?。?br> [0050] W PIB139質粒為模板，利用引物p3和p4進行高可信度PCR擴增，得到約IWbp 片段，其中，引物p3和p4的序列分別如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示。
[0051] (1)反應體系（50y 1)包括；5y IIOXKOD 肥 0 plus 緩沖液，3y 125mM MgC12, 1.5yl2. 5mmol/L dNTP 溶液，2. 5yl DMS0,30pmol P3,30pmol P4，1U K孤肥 0 plus DM 聚合酶，50ng基因組，加雙蒸水至50 y 1。
[0052] (2)PCR 反應程序為；95 °C 5min，30 個循環（94 °C 30s，56 °C 30s，72 °C 120s)， 72〇C lOmin。
[005引 PCR片段經過瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒純化回收。
[0054] 將1 y L pACMaBS載體與3 y L純化片段混合，37C賠育15分鐘，置冰上1-2分 鐘，轉化大腸桿菌D冊a,涂布氨予LB平板，W引物P3和p4進行菌落PCR驗證，能夠擴增出 相應條帶（190bp)的菌落為陽性菌落。挑取陽性菌落經過LB液體培養，抽提質粒，并經過 限制性內切酶（BamHI，Ndel)酶切和測序驗證，獲得正確的pACK4aBS-ermE克隆。
[00巧]3、構建重組載體 pSET152erm*E-DptEF :
[0056] 將克隆有紅霉素啟動子的重組質粒pACK4aBS-erm*E W BamHI，Ndel酶切得到啟 動子片段約IWbp，將PSET152質粒W BamHI、甜al酶切獲得載體片段約5. 7化，將重組質 粒pACK4aBS-DptEF W Ndel、甜al酶切獲得DptEF片段約2. 46化，分別進行凝膠純化，H個 片段W摩爾比5 ;1 ;5的比例在T4DNA連接酶的作用下16C連接過夜。取連接液5y L轉化 D冊a感受態細胞，之后涂布終濃度50 y g/血濃度的安普霉素LB平板，長出的單克隆通過液 體LB培養，抽提質粒，并利用Ndel，甜al酶切，得到預期大小的載體條帶和化tEF插入片段 條帶，進一步通過測序，驗證得到正確的pSET152erm*E-DptEF質粒。本發明的載體構建過 程如圖1所7]^。
[0057] 實施例3.向游動放線菌中轉化pSET152erm*E-DptEF:
[0058] 制備游動放線菌抱子息液；在結合轉移前5天左右，將游動放線菌甘油保藏液取 3 y 1涂布I-Isp2固體培養基，所述的I-Isp2固體培養基包括1%麥芽糖提取物、0. 4%酵母 抽提物yeast extract、0. 4%葡萄糖，2%瓊脂粉，所述的百分比為質量體積百分比（W/V)，其 抑為7. 0。28°C培養120小時左右，用無菌刮棒刮取表面菌體，用15-20ml無菌水洗并通過 玻璃珠在旋潤振蕩器上震蕩10次，每次10砂鐘后，將息液通過棉花塞的無菌注射器針筒， 濾出液經過7000轉/分離也后，棄去上清，用適量0. 4-1. 0ml無菌水重息即可得到抱子息 液。
[0059] 將重組表達載體pSET152erm*E-DptEF通過電擊法轉化入大腸桿菌ET12567 (PUZ8002)，涂布在含有終濃度50 y g/mL卡那霉素、50 y g/mL安普霉素、25 y g/mL氯 霉素的LB平板上，37C培養過夜，得到的的陽性克隆為重組大腸桿菌，WET12567 (pSET152erm*E-Dpt邸，pUZ8002)表示。
[0060] 接合轉移前一天，接種 ET12567 (pSET152erm*E-DptEF，PUZ8002)重組大腸桿菌 單菌落到3mL LB試管中，加入抗生素卡那霉素（50 y g/mL)，安普霉素（50 y g/mL)，氯霉素 (25 yg/mL)培養過夜，次日W 1%接種量接入含有同濃度的H種抗生素的10血LB H角瓶 中，37C培養至0D0. 4-0. 6。保持無菌狀態，450化pm, 4°C離也收集菌體，棄上清，用同體積無 菌LB洗涂一次，重復離也和洗涂一次，重息在約200 y L LB中。將大腸桿菌菌液與制備好 的游動放線菌抱子息液50 y L充分混合，涂布1-2塊含有終濃度lOmMMgCls的MS平板上，所 述MS平板的組成為；2%甘露醇、2%豆餅粉、2%瓊脂粉，所述的百分比為質量體積百分比（W/ V)。
[0061] 28C培養20小時后，每板均勻平鋪混合了 0. 7ml無菌水、15y 1蔡巧麗酸（50mg/ ml溶解于0. IN的化OH中）和15y 1安普霉素（50mg/ml)的溶液。28°C繼續培養5-10天 至單克隆長出。將單克隆在接合轉移平板上劃線分單菌落，使之與混雜的大腸桿菌分離，得 到純化后的重組單克隆菌株。將菌株接種I-Isp2液體培養基，所述的I-Isp2液體培養基 包括1%麥芽糖提取物、0. 4%酵母抽提物yeast extract、0. 4%葡萄糖，其抑為7. 0。28C 培養48-72小時后，抽提基因組，利用引物pi和p2進行PCR驗證重組單克隆的正確性，結 果能夠擴增出預期的2. 46化DptEF條帶，確認為整合了重組載體的重組表達轉化子。
[00的]引物序列
[0063]

【權利要求】
1. 一種提高聚酮類化合物發酵產量的方法，其特征在于，其包括步驟：在添加了天然 油脂的培養基中培養過表達?；o酶A合成酶和?；d體蛋白的基因工程菌，從發酵產物 中提取聚酮類化合物，所述的基因工程菌為將含有表達?；o酶A合成酶和?；d體蛋白 的重組表達載體的重組大腸桿菌接合轉移放線菌制得的過表達酰基輔酶A合成酶和?；?載體蛋白重組表達轉化體。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，其還包括所述的基因工程菌的制備步驟：將 表達?；o酶A合成酶和?；d體蛋白的重組表達載體轉化大腸桿菌，然后將所得的重組 大腸桿菌接合轉移放線菌，所得的過表達?；o酶A合成酶和?；d體蛋白的重組表達轉 化體即為所述的基因工程菌。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的重組表達載體通過將編碼所述?；?輔酶A合成酶和?；d體蛋白的基因連接于質粒pSET152構建而成。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，在所述的重組表達載體中，啟動編碼所述酰 基輔酶A合成酶和?；d體蛋白的基因表達的啟動子為紅霉素抗性基因啟動子erm*E，其 序列如SEQIDNO. 5所示。
5. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的放線菌為游動放線菌(Actinoplanes sp.)或者吸水鏈霉菌（Streptomyceshygroscopicus)。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的?；o酶A合成酶和?；d體蛋白為 來源于玫瑰孢鏈霉菌（Streptomycesroseosporus)的酰基輔酶A合成酶和酰基載體蛋白， 其分別由來源于玫瑰孢鏈霉菌的DptE和DptF基因編碼。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的來源于玫瑰孢鏈霉菌的酰基輔酶A合 成酶和酰基載體蛋白的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示。
8. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的來源于玫瑰孢鏈霉菌的DptE和DptF 基因的核苷酸序列分別如SEQIDN03和SEQIDN04所示。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚酮類化合物為雷帕霉素；所述的天 然油脂為豆油、玉米油和花生油中的任一種或多種。
10. -種生產雷帕霉素的基因工程菌，其為將含有表達?；o酶A合成酶和?；d體 蛋白的重組表達載體的重組大腸桿菌接合轉移放線菌制得的過表達?；o酶A合成酶和 ?；d體蛋白的重組表達轉化體。
【文檔編號】C12N1/20GK104513840SQ201310461966
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】胡海峰, 黃鶴 申請人:上海醫藥工業研究院, 中國醫藥工業研究總院