一種卷枝毛霉、制備降粘酶的方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種卷枝毛霉、制備降粘酶的方法及其在甘薯發酵降粘中的應用，屬于微生物及微生物發酵領域。針對現有技術中降低甘薯發酵醪液粘度存在的缺陷，本發明提供了一種能夠生產降粘酶的菌種。卷枝毛霉CBS131818已保藏于荷蘭皇家藝術與科學學院荷蘭微生物菌種保藏中心，保藏日期2012年1月27日。卷枝毛霉CBS131818采集自酸處理水稻秸稈處理液，可應用于制備降粘酶。所產降粘酶活性高，并可進一步應用于甘薯燃料乙醇發酵醪液降粘工藝，可有效降低甘薯塊莖發酵醪液粘度，且用量少、作用時間短，能夠簡化甘薯燃料乙醇發酵工藝，降低生產成本。
【專利說明】—種卷枝毛霉、制備降粘酶的方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種卷枝毛霉、利用該菌種制備降粘酶的方法及其應用，特別是涉及一種可應用于甘薯塊莖發酵降粘的普通鐮刀菌及其應用，屬于微生物及微生物發酵領域。
【背景技術】
[0002]生物質燃料乙醇即采用植物等生物質原料發酵生產無水乙醇，再加入體積比5%左右的變性劑(一般為無鉛汽油或無鉛的烴類)使之成為含水量小于0.8%且不可食用的變性無水乙醇。燃料乙醇是一種良好的汽油增氧劑和辛烷值調和組分，能有效降低汽車尾氣中的一氧化碳含量，從而真正實現節能減排。生物質燃料乙醇作為一種可再生能源，因其能緩解能源危機，穩定糧食生產，增加就業機會和農民收入，減少環境污染而備受關注并成為各國競相研發的重要課題之一。2007年，我國正式宣布停止一切以糧食為原料生產燃料乙醇的項目，鼓勵發展甘薯、甘蔗、甜高粱等非糧食原料生產燃料乙醇。甘薯燃料乙醇發酵醪液是一種典型的非牛頓流體(一般的發酵液粘度小于0.1Pa.S)，具有粘度大的特點(大于IOOPa.S)，對發酵過程中傳質傳熱等產生影響，從而降低了發酵效率、延長發酵時間、減少最終乙醇濃度，并且容易堵塞管路、增加能耗。因而醪液粘度高是甘薯高濃度發酵生產燃料乙醇的瓶頸之一。
[0003]現有技術中，降低甘薯發酵醪液基本有兩種方法，一是添加發酵用水降低粘度，二是添加木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶等商品酶或者其混合物，促進a -淀粉酶與淀粉顆粒接觸，提高淀粉顆粒利用效率。這兩種方法均存在各自的技術缺陷:前者不僅增加了發酵用水量，還降低了酒精成產產量，不能解決實際問題；后者使用商品酶作為一種快速預處理方法，增加了生產成本，不利于燃料乙醇規模化生產。

【發明內容】

[0004]本發明的目的就是針對現有技術的不足，提供一種能夠生產降粘酶的菌種，及其制備降粘酶以及到甘薯發酵降粘中的應用。
[0005]為實現上述目的，本發明首先提供一種卷枝毛霉:
[0006]卷枝毛霉S-1，保藏于CBS-KNAW，保藏號為CBS131818，保藏日期為2012年I月27曰。
[0007]卷枝毛霉CBS131818屬卷枝毛霉(Mucor circinelloides),已保藏于荷蘭皇家藝術與科學學院荷蘭微生物菌種保藏中心(Royal Netherlands Academy of Arts andSciences, The CentraalbureauvoorSchimmeIcultures, CBS-KNAW),保藏日期 2012 年 I月27日，保藏編號CBS131818。CBS-KNAW機構地址:8Uppsalalaan，3584CT，荷蘭烏得勒支(Uppsalalaan8, 3584CT Utrechtthe Netherlands)。
[0008]卷枝毛霉CBS131818采集自酸處理水稻秸桿后的處理液。篩選的技術方案如下:一種篩選卷枝毛霉CBS131818的方法:其特征在于:
[0009]步驟S1、制備酸處理秸桿材料后的處理液[0010]秸桿材料于60°C烘干至恒重后粉碎，過35目篩；取篩選后的粉末IOg置于250ml的三角瓶中，加入100ml濃度為0.5%~4% (v/v)的稀硫酸，升溫至121°C保持60min得處理液；處理液室溫放置I~2個月，液面有霉菌生長；
[0011]上述秸桿材料可以是玉米芯、玉米秸桿、小麥秸桿、水稻秸桿等。
[0012]步驟S2、篩選過程 [0013]按照經典的涂布稀釋平板法，挑取步驟SI處理液中菌落按經梯度稀釋后；分別取lOOiiLlOAlO'lO—7濃度的菌懸液涂布于篩選培養基上，30°C培養3d;挑取平板上生長較大的單菌落到PDA培養基上，30°C培養7d ;用剛果紅染液染色，挑選出黃色透明圈大且明顯的菌株；所述篩選培養基的組成為(g/L):羧甲基纖維素鈉(CMC) 10，酵母膏4.5，(NH4) 2S044.5，NaCl5.0，K2HP042.0，MgSO4 ? 7H200.4，瓊脂 15，pH6.0。
[0014]上述篩選方法中，剛果紅染液染色為常規操作，具體是:菌落挑取后，利用1%剛果紅染液染色lOmin，倒掉染色液然后用lmol/L NaCl溶液潤洗3次，每次lOmin。
[0015]本發明菌落質地疏松，一般高度在Icm以內，棕褐色，頂生孢子囊，孢子囊成球形，成熟時孢子囊壁消解，孢囊孢子橢圓形或擬橢圓形。經鑒定屬卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)o
[0016]卷枝毛霉CBS131818可應用于降粘酶制備。
[0017]本發明還提供一種降粘酶制備方法，其技術方案如下:
[0018]一種降粘酶制備方法，其特征在于:將卷枝毛霉CBS131818接種于發酵培養基，30°C、130rpm下培養5d，制得降粘酶粗酶液；所述發酵培養基組分是(g/L):風干玉米芯 20、蛋白胨 3.0、酵母膏 0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4 ? 7H200.15、CaCl20.3、FeSO4 WH2O0.0005,ZnSO4 *7H200.0014,MnSO4.H2O0.0016,C0Cl2 *6H200.0016,Tween-803.3,pH5.00
[0019]在優選條件下，發酵培養基的組成是(g/L):風干玉米芯4.4、木聚糖10.7、L-山梨醇 4.9、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4 ? 7H200.15、CaCl20.3、FeSO4 ? 7H200.0005、ZnSO4 ? 7H200.0014、MnSO4 ? H2O0.0016、C0Cl2 ? 6H200.0016, Tween-803.3，pH3.48。
[0020]以上述方法制得的降粘酶粗酶液，是多種酶的混合液，經Pedersen etal.(2009)報道的AZCL分析方法分析顯示，降粘酶粗酶液組成為:內切-1，4-0-D-甘露聚糖酶24 (藍色水解環直徑/mm,下同)，內切-1,4-P-D-木聚糖酶11，P -葡聚糖酶24，內切-1，3-^-D-葡聚糖酶18。基于此，本發明提供一種降粘酶組合物，其技術方案如下:
[0021]一種降粘酶組合物，其特征在于:制備方法為:將卷枝毛霉CBS131818接種于發酵培養基，30°C、130rpm下培養5d，制得降粘酶組合物；所述發酵培養基是如下二者之一:
[0022]發酵培養基一(g/L):風干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4 ? 7H200.15、CaCl20.3、FeSO4 ? 7H200.0005、ZnSO4 ? 7H200.0014、MnSO4 ? H2O0.0016、C0Cl2 ? 6H200.0016、Tween-803.3，pH5.0 ；
[0023]發酵培養基二(g/L):風干玉米芯4.4、木聚糖10.7、L-山梨醇4.9、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4 ? 7H200.15、CaCl20.3、FeSO4 ? 7H200.0005、ZnSO4 ? 7H200.0014、MnSO4 ? H2O0.0016、C0Cl2 ? 6H200.0016、Tween-803.3，pH3.48。
[0024]上述降粘酶組合物是粗酶液，在優化條件下，可經離心，取上清液經0.22 過濾器過濾制得純化后的降粘酶組合物。[0025]利用上述降粘酶組合物，本發明進一步提供一種甘薯塊莖發酵降粘的方法，其技術方案如下:
[0026]一種利用上述降粘酶組合物實施的甘薯塊莖發酵降粘的方法，其特征在于:30°C條件下向甘薯塊莖漿中添加反應酶液，50°C、ISOrpm條件下反應2h ;所述反應酶液是降粘酶粗酶液。
[0027]在優選條件下，上述方法的反應酶液是降粘酶粗酶液經離心，取上清液經0.22 y m過濾器過濾制得。
[0028]在優選條件下，上述方法的甘薯塊莖漿制備方法是:步驟S1、甘薯塊莖原料洗凈、打漿制得甘薯塊莖原漿；步驟S2、按照90~150KNU/kg淀粉在甘薯塊莖原漿中添加a -淀粉酶，80°C~90°C反應至碘反應為紅棕色，冷卻至室溫后按甘薯塊莖原漿料水重量比3:1加水；115°C條件下滅菌20min，制得甘薯塊莖漿。
[0029]上述甘薯塊莖發酵降粘的方法可以應用于甘薯燃料乙醇發酵工藝中。具體是應用于鮮甘薯類燃料乙醇發酵工藝的前期降粘預處理中。
[0030]與現有技術相比，本發明的有益效果是:(1)提供了新的卷枝毛霉CBS131818 (卷枝毛霉S-1); (2)卷枝毛霉CBS131818可應用于制備降粘酶，卷枝毛霉CBS131818所產降粘酶活性高、用量少、作用時間短、降粘效果好；(3)卷枝毛霉CBS131818可應用于甘薯塊莖發酵降粘；(4)利用卷枝毛霉CBS131818實施的甘薯塊莖發酵降粘方法可應用于甘薯燃料乙醇發酵工藝中。
【具體實施方式】
[0031]下面結合優選實施例、對照例對本發明技術方案作進一步的描述。
`[0032]實施例一
[0033]本實施例記載卷枝毛霉CBS131818的篩選方法。
[0034]水稻秸桿于60°C烘干至恒重后粉碎，過35目篩；取篩選后的粉末IOg置于250ml的三角瓶中，加入100ml濃度為0.5% (v/v)的稀硫酸，升溫至121°C保持60min得處理液；處理液室溫放置I~2個月，液面有霉菌生長。
[0035]篩選過程為:按照經典的涂布稀釋平板法，將上述處理液經10_\10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7的濃度稀釋后，分別取100 u L10_5，10_6，10_7濃度的菌懸液涂布于篩選培養基上，30°C培養3d，挑取平板上生長較大的單菌落到PDA斜面培養基上，30°C培養7d，然后用剛果紅染液染色，挑選出黃色透明圈大且明顯的菌株。
[0036]篩選培養基的組成為(g/L):羧甲基纖維素鈉(CMC) 10，酵母膏4.5，(NH4)2S044.5，NaCl5.0，K2HP042.0，MgSO4 ? 7H200.4，瓊脂 15，pH6.0。
[0037]剛果紅染液染色步驟為:菌落挑取后，利用1%剛果紅染液染色lOmin，倒掉染色液然后用lmol/LNaCl溶液潤洗3次，每次lOmin。
[0038]本實施例篩選得到的菌落質地疏松，一般高度在Icm以內，棕褐色，頂生孢子囊，孢子囊成球形，成熟時孢子囊壁消解，孢囊孢子橢圓形或擬橢圓形。經鑒定屬卷枝毛霉(Mucorcircinelloides),命名為 S-1。
[0039]實施例二
[0040]本實施例記載卷枝毛霉CBS131818的篩選方法，其與實施例一相同之處不再重復，不同之處在于，所述稀硫酸濃度為4% (v/v)。
[0041]實施例三
[0042]本實施例記載卷枝毛霉CBS131818的篩選方法，其與實施例一相同之處不再重復，不同之處在于，所述稀硫酸濃度為2% (v/v)。
[0043]實施例四
[0044]本實施例記載卷枝毛霉CBS131818制備降粘酶的方法。
[0045]發酵培養基:風干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5,MgSO4 ? 7H200.15、CaCl20.3、FeSO4 ? 7H200.0005、ZnSO4 ? 7H200.0014、MnSO4 ? H2O0.0016、C0Cl2 ? 6H200.0016、Tween-803.3，pH5.0。
[0046]制備操作:將卷枝毛霉CBS131818接種于50mL發酵培養基，30°C、130印111下培養4d，制得降粘酶粗酶液。
[0047]實施例五
[0048]本實施例記載卷枝毛霉CBS131818制備降粘酶的方法，其與實施例二相同之處不再重復，其不同之處在于，將卷枝毛霉CBS131818接種于發酵培養基，300C、130rpm下培養5d，制得降粘酶粗酶液。
[0049]實施例六
[0050]本實施例記載卷枝毛霉CBS131818制備降粘酶的方法。
[0051]優選發酵培養基:風干玉米芯4.4、木聚糖10.7、L-山梨醇4.9、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4 ? 7H200.15、CaCl20.3、FeSO4 ? 7H200.0005、ZnSO4 ? 7H200.0014、MnSO4 ? H2O0.0016、C0Cl2 ? 6H200.0016、Tween-803.3，pH3.48。
[0052]制備操作:將卷枝毛霉CBS131818接種于50mL發酵培養基，30°C、130rpm下培養4d，制得降粘酶粗酶液。
[0053]實施例七
[0054]本實施例記載卷枝毛霉CBS131818制備降粘酶的方法，其與實施例四相同之處不再重復，其不同之處在于:將卷枝毛霉CBS131818接種于50mL發酵培養基，30°C、130rpm下培養5d，制得降粘酶粗酶液。
[0055]實施例八
[0056]本實施例記載卷枝毛霉CBS131818制備降粘酶的方法，其與實施例五相同之處不再重復，其不同之處在于:將卷枝毛霉CBS131818接種于200mL發酵培養基(其中卷枝毛霉CBS131818接種量與發酵培養基用量放大相同倍數)，300C、130rpm下培養5d，制得降粘酶粗酶液。
[0057]實施例九
[0058]本實施例記載甘薯塊莖發酵降粘的方法。
[0059]粘度測定儀器:上海尼潤智能科技有限公司生產的RDV-2+PR0型數字式旋轉粘度計。
[0060]a -淀粉酶標準酶活力為90KNU/g，酶活定義為在37°C，pH5.6時，每h水解5.26g淀粉的酶量為I個KNU。
[0061]步驟S1、甘薯塊莖原料洗凈、打漿制得甘薯塊莖原漿。
[0062]步驟S2、按照90~150KNU/kg淀粉在甘薯塊莖原漿中添加a -淀粉酶，80°C~90°C反應至碘反應為紅棕色，冷卻至室溫后按甘薯塊莖原漿料水重量比3:1加水；115°C條件下滅菌20min，制得甘薯塊莖漿。
[0063]步驟S3、降粘酶粗酶液經離心，取上清液經0.22 y m過濾器過濾制得反應酶液。
[0064]步驟S4、步驟S2所得甘薯塊莖漿升溫至30°C，添加反應酶液，50°C、180rpm條件下反應2h，測量粘度值；降粘酶粗酶液來源、加入量及降粘效果如下表1所示。
[0065]對照處理:50g或100g步驟S2所得甘薯塊莖漿，加入2mL或4mL無菌水，50°C作用2h后，測定粘度值為19686mPa.s~23042.5mPa.S。
[0066]表1反應酶液及粘度測定值
[0067]
【權利要求】
1.卷枝毛霉CBS131818，保藏于CBS-KNAW，保藏號為CBS131818，保藏日期為2012年I月27日。
2.根據權利要求1所述的卷枝毛霉CBS131818在制備降粘酶中的應用。
3.—種降粘酶制備方法，其特征在于:將卷枝毛霉CBS131818接種于發酵培養基，30°C、130rpm下培養4d~5d，制得降粘酶粗酶液；所述發酵培養基組分是如下二種之一: 發酵培養基一(g/L):風干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4 ? 7H200.15、CaCl20.3、FeSO4 ? 7H200.0005、ZnSO4 ? 7H200.0014、MnSO4 ? H2O0.0016、C0Cl2 ? 6H200.0016、Tween-803.3，pH5.0 ； 發酵培養基二(g/L):風干玉米芯4.4、木聚糖10.7、L-山梨醇4.9、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4 ? 7H200.15、CaCl20.3、FeSO4 ? 7H200.0005、ZnSO4 ? 7H200.0014、MnSO4 ? H2O0.0016、C0Cl2 ? 6H200.0016、Tween-803.3，pH3.48。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述發酵培養天數為5d。
5.—種降粘酶組合物，其特征在于:制備方法為:將卷枝毛霉CBS131818接種于發酵培養基，30°C、130rpm下培養4d~5d，制得降粘酶組合物；所述發酵培養基是如下二者之一: 發酵培養基一(g/L):風干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4 ? 7H200.15、CaCl20.3、FeSO4 ? 7H200.0005、ZnSO4 ? 7H200.0014、MnSO4 ? H2O0.0016、C0Cl2 ? 6H200.0016、Tween-803.3，pH5.0 ； 發酵培養基二(g/L):風干玉米芯4.4、木聚糖10.7、L-山梨醇4.9、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4 ? 7H200.15、CaCl20.3、FeSO4 ? 7H200.0005、ZnSO4 ? 7H200.0014、MnSO4 ? H2O0.0016、C0Cl2 ? 6H200.0016、Tween-803.3，pH3.48。
6.根據權利要求5所述的降粘酶組合物，其特征在于:所得降粘酶組合物經離心，取上清液經0.22 y m過濾器過濾提純。
7.一種利用權利要求5或6所述的降粘酶組合物實施的甘薯塊莖發酵降粘的方法，其特征在于:30°C條件下向甘薯塊莖漿中添加反應酶液，50°C、180rpm條件下反應2h ;所述反應酶液是降粘酶組合物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于:所述甘薯塊莖漿的制備方法是: 步驟S1、甘薯塊莖原料洗凈、打漿制得甘薯塊莖原漿； 步驟S2、按照90~150KNU/kg淀粉在甘薯塊莖原漿中添加a -淀粉酶，80°C~90°C反應至碘反應為紅棕色，冷卻至室溫后按甘薯塊莖原漿料水重量比3:1加水；115°C條件下滅菌20min，制得甘薯塊莖漿。
9.根據權利要求7所述的甘薯塊莖發酵降粘的方法在甘薯燃料乙醇發酵中的應用。
【文檔編號】C12R1/785GK103614299SQ201310492417
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月20日 優先權日:2013年10月20日
【發明者】趙海, 靳艷玲, 方揚, 黃玉紅 申請人:中國科學院成都生物研究所