鑒定待測品種是否為瑞雜816的方法及其專用引物組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定待測品種是否為瑞雜816的方法及其專用引物組。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟：以待測棉花的基因組DNA為模板，分別采用CS62引物對、NAU1103引物對、NAU1186引物對、NAU1233引物對、NAU2026引物對、NAU2274引物對、CIR062引物對、NAU1071引物對、NAU1085引物對、NAU1102引物對、NAU1196引物對、NAU1255引物對、NAU1369引物對、NAU2173引物對和NAU2277引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足標(biāo)準(zhǔn)（1）至標(biāo)準(zhǔn)（15）中的13條以上，待測棉花為瑞雜816。本發(fā)明對于監(jiān)控瑞雜816的制種的質(zhì)量，保證銷售的瑞雜816種子的質(zhì)量，同時打擊假冒的瑞雜816種子，保護(hù)育種人的知識產(chǎn)權(quán)，保護(hù)品種權(quán)具有重大價值。
【專利說明】鑒定待測品種是否為瑞雜816的方法及其專用引物組
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鑒定待測品種是否為瑞雜816的方法及其專用引物組。
【背景技術(shù)】
[0002]棉花的雜種優(yōu)勢明顯，雜交棉品種已應(yīng)用多年，增產(chǎn)效果明顯，已得到大面積的推廣應(yīng)用。目前棉花的雜交制種仍以人工制種為主，不育系制種還沒有得到推廣，隨著用工成本的不斷上漲，雜交制種成本越來越高，種子質(zhì)量越來越差，市場上銷售的雜交棉種子做假嚴(yán)重，有F2替代Fi，有常規(guī)棉替代Fi，有母本摻雜等現(xiàn)象，使雜交種在推廣中達(dá)不到應(yīng)有的增產(chǎn)效果，影響雜交棉的推廣效果。常規(guī)的田間鑒定時間長，會影響當(dāng)年的種子銷售，而且在海南加代鑒定時由于受環(huán)境影響，鑒定效果也不很理想。
[0003]瑞雜816于2005-2006年參加黃河流域棉區(qū)的雜交棉區(qū)試，2006年同時參加了生產(chǎn)試驗(yàn)，綜合性狀優(yōu)良，豐產(chǎn)性好，纖維品質(zhì)優(yōu)良，抗病性好，2007年通過了國家審定，2009年被推薦為黃河流域雜交棉區(qū)試的對照品種，應(yīng)用至今。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種鑒定待測品種是否為瑞雜816的方法及其專用引物組。
[0005]本發(fā)明提供了一種鑒定或輔助鑒定待測棉花是否為瑞雜816的方法，包括如下步驟:
[0006]以待測棉花的基因組DNA為模板，分別采用CS62引物對、NAU1103引物對、NAU1186引物對、NAU1233引物對、NAU2026引物對、NAU2274引物對、CIR062引物對、NAU1071引物對、NAU1085引物對、NAU1102引物對、NAU1196引物對、NAU1255引物對、NAU1369引物對、NAU2173引物對和NAU2277引物對`進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足標(biāo)準(zhǔn)(1)至標(biāo)準(zhǔn)
(15)中的13條以上，待測棉花為瑞雜816或待測棉花為候選的瑞雜816 ；
[0007]所述CS62引物對由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1103引物對由序列表的序列3所不的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1186引物對由序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1233引物對由序列表的序列7所示的單鏈DNA分子和序列表的序列8所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2026引物對由序列表的序列9所不的單鏈DNA分子和序列表的序列10所不的單鏈DNA分子組成；所述NAU2274引物對由序列表的序列11所示的單鏈DNA分子和序列表的序列12所示的單鏈DNA分子組成；所述CIR062引物對由序列表的序列13所示的單鏈DNA分子和序列表的序列14所示的單鏈DNA分子組成；所示NAU1071引物對由序列表的序列15所示的單鏈DNA分子和序列表的序列16所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1085引物對由序列表的序列17所示的單鏈DNA分子和序列表的序列18所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1102引物對由序列表的序列19所示的單鏈DNA分子和序列表的序列20所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1196引物對由序列表的序列21所示的單鏈DNA分子和序列表的序列22所示的單鏈DNA分子組成；所示NAU1255引物對由序列表的序列23所示的單鏈DNA分子和序列表的序列24所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1369引物對由序列表的序列25所示的單鏈DNA分子和序列表的序列26所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2173引物對由序列表的序列27所示的單鏈DNA分子和序列表的序列28所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2277引物對由序列表的序列29所不的單鏈DNA分子和序列表的序列30所不的單鏈DNA分子組成；
[0008]標(biāo)準(zhǔn)(1):采用CS62引物對時，滿足如下帶型:在489bp和404bp之間具有2條帶、在404bp和353bp之間具有2條帶、在242bp和190bp之間具有3條帶；
[0009]標(biāo)準(zhǔn)(2):采用NAU1103引物對時，滿足如下帶型:在353bp和242bp之間具有4條帶、在242bp和190bp之間具有1條帶、在190bp和147bp之間具有2條帶；
[0010]標(biāo)準(zhǔn)(3):采用NAU1186引物對時，滿足如下帶型:在404bp和353bp之間具有3條帶、在353bp和242bp之間具有2條帶、在190bp和147bp之間具有3條帶；
[0011]標(biāo)準(zhǔn)(4):采用NAU1233引物對時，滿足如下帶型:大于501bp具有1條帶，在501bp和489bp之間具有1條帶、在489bp和404bp之間具有2條帶、在353bp和242bp之間具有2條帶；
[0012]標(biāo)準(zhǔn)(5):采用NAU2026引物對時，滿足如下帶型:在489bp和353bp之間具有5條帶、在353bp和242bp之間具有1條帶、在242bp和190bp之間具有2條帶、在190bp和147bp之間具有1條帶；
[0013]標(biāo)準(zhǔn)(6):采用NAU2274引物對時，滿足如下帶型:在190bp和147bp之間具有3條帶、在147bp和llObp之間具有5條帶；
[0014]標(biāo)準(zhǔn)(7):采用CIR062引物對時，滿足如下帶型:在404bp和353bp之間具有2條帶、在242bp和190bp之間具`有3條帶；
[0015]標(biāo)準(zhǔn)(8):采用NAU1071引物對時，滿足如下帶型:在353bp和242bp之間具有2條帶、在190bp和147bp之間具有2條帶；
[0016]標(biāo)準(zhǔn)(9):采用NAU1085引物對時，滿足如下帶型:在489bp和404bp之間具有1條帶、在353bp和242bp之間具有2條帶；
[0017]標(biāo)準(zhǔn)(10):采用NAU1102引物對時，滿足如下帶型:大于501bp具有2條帶、在242bp和190bp之間具有2條帶；
[0018]標(biāo)準(zhǔn)(11):采用NAU1196引物對時，滿足如下帶型:在489bp和404bp之間具有2條帶、在242bp和190bp之間具有2條帶；
[0019]標(biāo)準(zhǔn)(12):采用NAU1255引物對時，滿足如下帶型:在404bp和353bp之間具有1條帶、在242bp和190bp之間具有2條帶；
[0020]標(biāo)準(zhǔn)(13):采用NAU1369引物對時，滿足如下帶型:在489bp和404bp之間具有2條帶、在242bp和190bp之間具有1條帶；
[0021]標(biāo)準(zhǔn)(14):采用NAU2173引物對時，滿足如下帶型:在242bp和190bp之間具有1條帶；
[0022]標(biāo)準(zhǔn)(15):采用NAU2277引物對時，滿足如下帶型:在242bp和190bp之間具有1條帶、在147bp和llObp之間具有1條帶。
[0023]上述帶型具體均為主帶帶型。
[0024]所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序具體可為:94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s、56°C退火45s、72°C延伸 45s, 30 個循環(huán)；94°C變性 lmin、56°C退火 45s、72°C延伸 2min。
[0025]用于鑒定或輔助鑒定待測棉花是否為瑞雜816的引物組，由所述CS62引物對、所述NAU1103引物對、所述NAU1186引物對、所述NAU1233引物對、所述NAU2026引物對、所述NAU2274引物對、所述CIR062引物對、所述NAU1071引物對、所述NAU1085引物對、所述NAU1102引物對、所述NAU1196引物對、所述NAU1255引物對、所述NAU1369引物對、所述NAU2173引物對和所述NAU2277引物對組成。
[0026]本發(fā)明還保護(hù)所述引物組在制備用于鑒定或輔助鑒定待測棉花是否為瑞雜816的試劑盒中的應(yīng)用。
[0027]本發(fā)明還保護(hù)一種用于鑒定或輔助鑒定待測棉花是否為瑞雜816的試劑盒，含有所述引物組。
[0028]本發(fā)明篩選并挖掘了 15個SSR引物對，可以用于鑒定待測種子是否為瑞雜816，圖譜清晰，速度快，且不受環(huán)境的影響，從而可以鑒定市售的號稱為瑞雜816的種子的真實(shí)性和純度，正確快速判斷種子能否應(yīng)用。本發(fā)明對于監(jiān)控瑞雜816的制種的質(zhì)量，判斷種子能否收購加工，保證銷售的瑞雜816種子的質(zhì)量，同時打擊假冒的瑞雜816種子，保護(hù)育種人的知識產(chǎn)權(quán)，保護(hù)品種權(quán)具有重大價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1至圖15為實(shí)施例1的結(jié)果圖譜(每個電泳圖中，上端為大分子量，下端為小分
子量)。
[0030]圖16至圖30為各個采 用引物對時的帶型放大圖(每個電泳圖中，上端為大分子量，下端為小分子量)。
【具體實(shí)施方式】
[0031]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0032]棉花品種“瑞雜816”:濟(jì)南鑫瑞種業(yè)科技有限公司。瑞雜816的父本:濟(jì)南鑫瑞種業(yè)科技有限公司。瑞雜816的母本:濟(jì)南鑫瑞種業(yè)科技有限公司。棉花品種“中植棉2號”:河南科林種業(yè)有限公司。棉花品種“魯棉研28號”:山東棉花研究中心。
[0033]實(shí)施例1、瑞雜816的DNA指紋圖譜的構(gòu)建
[0034]一、SSR引物對的篩選
[0035]經(jīng)過大量的棉花SSR引物篩選，發(fā)現(xiàn)15個SSR引物對(核苷酸序列見表1)可以用于制作瑞雜816的DNA指紋圖譜。
[0036]表115個引物對的核苷酸序列
[0037]
~|正向引物(5，一3’)|反向引物(5，一3’)
? CS62 引物對 GATGGCTACCTCCCTTTGTA (序列 1) CGTAAGGAAGCCTAGCAAAA (序列 2)
【權(quán)利要求】
1.一種鑒定或輔助鑒定待測棉花是否為瑞雜816的方法，包括如下步驟: 以待測棉花的基因組DNA為模板，分別采用CS62引物對、NAU1103引物對、NAU1186引物對、NAU1233引物對、NAU2026引物對、NAU2274引物對、CIR062引物對、NAU1071引物對、NAU1085引物對、NAU1102引物對、NAU1196引物對、NAU1255引物對、NAU1369引物對、NAU2173引物對和NAU2277引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足標(biāo)準(zhǔn)(1)至標(biāo)準(zhǔn)(15)中的13條以上，待測棉花為瑞雜816或待測棉花為候選的瑞雜816 ； 所述CS62引物對由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1103引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1186弓|物對由序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1233引物對由序列表的序列7所示的單鏈DNA分子和序列表的序列8所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2026引物對由序列表的序列9所示的單鏈DNA分子和序列表的序列10所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2274引物對由序列表的序列11所示的單鏈DNA分子和序列表的序列12所示的單鏈DNA分子組成；所述CIR062引物對由序列表的序列13所不的單鏈DNA分子和序列表的序列14所不的單鏈DNA分子組成；所示NAU1071引物對由序列表的序列15所示的單鏈DNA分子和序列表的序列16所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1085引物對由序列表的序列17所示的單鏈DNA分子和序列表的序列18所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1102引物對由序列表的序列19所示的單鏈DNA分子和序列表的序列20所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1196引物對由序列表的序列21所示的單鏈DNA分子和序列表的序列22所示的單鏈DNA分子組成；所示NAU1255引物對由序列表的序列23所示的單鏈DNA分子和序列表的序列24所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1369引物對由序列表的序列25所示的單鏈DNA分子和序列表的序列26所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2173引物對由序列表的序列27所示的單鏈DNA分子和序列表的序列28所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2277引物對由序列表的序列29所不的單鏈DNA分子和 序列表的序列30所不的單鏈DNA分子組成； 標(biāo)準(zhǔn)(1):采用CS62引物對時，滿足如下帶型:在489bp和404bp之間具有2條帶、在404bp和353bp之間具有2條帶、在242bp和190bp之間具有3條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(2):采用NAU1103引物對時，滿足如下帶型:在353bp和242bp之間具有4條帶、在242bp和190bp之間具有1條帶、在190bp和147bp之間具有2條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(3):采用NAU1186引物對時，滿足如下帶型:在404bp和353bp之間具有3條帶、在353bp和242bp之間具有2條帶、在190bp和147bp之間具有3條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(4):采用NAU1233引物對時，滿足如下帶型:大于501bp具有1條帶，在501bp和489bp之間具有1條帶、在489bp和404bp之間具有2條帶、在353bp和242bp之間具有2條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(5):采用NAU2026引物對時，滿足如下帶型:在489bp和353bp之間具有5條帶、在353bp和242bp之間具有1條帶、在242bp和190bp之間具有2條帶、在190bp和147bp之間具有1條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(6):采用NAU2274引物對時，滿足如下帶型:在190bp和147bp之間具有3條帶、在147bp和llObp之間具有5條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(7):采用CIR062引物對時，滿足如下帶型:在404bp和353bp之間具有2條帶、在242bp和190bp之間具有3條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(8):采用NAU1071引物對時，滿足如下帶型:在353bp和242bp之間具有2條帶、在190bp和147bp之間具有2條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(9):采用NAU1085引物對時，滿足如下帶型:在489bp和404bp之間具有1條帶、在353bp和242bp之間具有2條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(10):采用NAU1102引物對時，滿足如下帶型:大于501bp具有2條帶、在242bp和190bp之間具有2條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(11):采用NAU1196引物對時，滿足如下帶型:在489bp和404bp之間具有2條帶、在242bp和190bp之間具有2條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(12):采用NAU1255引物對時，滿足如下帶型:在404bp和353bp之間具有1條帶、在242bp和190bp之間具有2條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(13):采用NAU1369引物對時，滿足如下帶型:在489bp和404bp之間具有2條帶、在242bp和190bp之間具有1條帶； 標(biāo)準(zhǔn)(14):采用NAU2173引物對時，滿足如下帶型:在242bp和190bp之間具有1條帶；標(biāo)準(zhǔn)(15):采用NAU2277引物對時，滿足如下帶型:在242bp和190bp之間具有1條帶、在147bp和llObp之間具有1條帶。
2.用于鑒定或輔助鑒定待測棉花是否為瑞雜816的引物組，由權(quán)利要求1中的所述CS62引物對、所述NAU1103引物對、所述NAU1186引物對、所述NAU1233引物對、所述NAU2026引物對、所述NAU2274引物對、所述CIR062引物對、所述NAU1071引物對、所述NAU1085引物對、所述NAU1102引物對、所述NAU1196引物對、所述NAU1255引物對、所述NAU1369引物對、所述NAU2173引物對和所述NAU2277引物對組成。
3.權(quán)利要求2所述引物組在制備用于鑒定或輔助鑒定待測棉花是否為瑞雜816的試劑盒中的應(yīng)用。
4.一種用于鑒定或輔助鑒定待測棉花是否為瑞雜816的試劑盒，含有權(quán)利要求2所述引物組。
【文檔編號】C12N15/11GK103555836SQ201310513600
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】付小瓊, 楊付新, 王秀玲, 陸許可, 葉武威 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所