采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法
【專利摘要】本發明屬于微生物發酵，特別是指一種采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法。包括孢子懸液的制備、固體罐發酵、曲盤培養等工藝步驟，本發明解決了現有技術存在的發酵周期長、染菌率高等技術問題，具有發酵周期短、染菌率低、生產效率高等優點。
【專利說明】采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物發酵，特別是指一種采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法。
【背景技術】
[0002]乳糖酶(Lactase)是一類催化特殊類型的糖苷鍵——β _半乳糖苷類化合物中β-半乳糖苷鍵發生水解斷裂的酶。乳糖酶能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的轉移作用，在乳糖分子的半乳糖一側連接1-4個半乳糖，生成低聚半乳糖。米曲霉(Aspergillus oryzae)產生的乳糖酶是高溫乳糖酶,最適溫度較高,一般在50°C以上,應用于生產中可有效防止雜菌污染，而且較耐熱、耐酸，穩定性較高，不需要活化劑和穩定劑，并且反應速度快、時間短，酶的用量少。
[0003]根據發酵過程培養基質的不同，發酵方式分為固態發酵和液態發酵。固態發酵比較粗放，一般不需要嚴格的無菌培養。固態發酵的基質濃度高，所以發酵產量一般比液態發酵要高，而且后處理工藝簡單，三廢少。
[0004]米曲霉乳糖酶是胞外酶，既可以采用固態發酵，也可以采用液體深層發酵，固態發酵發酵成本低，分離提取方便，生產效率高。但與液態發酵相比，固態發酵的周期一般較長，難以實現純種培養，而且是在沒有或者幾乎沒有游離水的條件下進行發酵，其傳質傳熱效率非常低。固態發酵受很多因素的限制，各項參數不易監測，而且很難保證每批次發酵條件一致，再現性差，是比液態發酵更為復雜的發酵過程。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種發酵周期短、染菌率低的采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法。`
[0006]本發明的整體技術構思是:
[0007]采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0008]A、孢子懸液的制備
[0009]將米曲霉菌株經培養后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0010]B、固體罐發酵
[0011]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發酵培養基進行發酵，固體發酵培養基包括如下單位重量份的組分組成:
[0012]麩皮I ;水 0.8-1.1 ;乳糖 0.05-0.15 ； (NH4)2SO40.005-0.015 ；MgS040.00 2-0.008 ；KH2PO40.005-0.01，聚丙二醇 0.0008-0.0012 ；
[0013]發酵溫度為28-32 °C，濕度為45-75%，壓力為0.03-0.05MPa,空氣流量為1.0-2.0mVmin,每間隔4_8小時間歇攪拌5_15分鐘，攪拌轉速15-30轉/分；培養24-36小時；
[0014]C、曲盤培養[0015]當步驟B中基質菌絲體覆蓋率達到90%以上，出料轉至曲盤培養；曲盤培養至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時結束培養；
[0016]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0017]本發明的具體技術解決方案還有:
[0018]孢子懸液的制備應屬于常規技術范疇，其中較為優選的技術方案是:所述的步驟A包括如下工藝步驟:
[0019]Al、將米曲霉菌株轉接入查氏培養基上，在溫度為28 - 32°C條件下培養3_5天；
[0020]A2、將步驟Al中培養的菌株轉接麩曲培養基，在溫度為28 — 32°C條件下培養3_5天;
[0021]A3、用無菌水洗滌步驟A2制備的菌絲體，然后用脫脂棉過濾，濾液轉入滅菌后的種子罐中，加入無菌水調整孢子濃度，制成孢子懸液。
[0022]為保證固體發酵罐過程的順利進行，接種過程優選的技術方案如下，所述的步驟B中的接種步驟中工藝條件如下:
[0023]開啟攪拌，轉速為15-30轉/分，將步驟A中制備的孢子懸液按照孢子懸液:麩皮的質量比為1%_8%的接種量接種至滅菌后的固體發酵培養基中，繼續攪拌5-15分鐘。
[0024]曲盤培養中優選的培養條件是:步驟C中曲盤培養的溫度為28_32°C，濕度為45-75%，麩曲厚度l_4cm，培養時間為48-60小時。
[0025]步驟Al中培養優選采用霉菌培養箱。
[0026]步驟A2中麩曲培養基采用麩皮:水的質量比=1:0.8-1.1配制。
[0027]本發明所取得的實質性特點和顯著技術進步在于:
[0028]本發明前期采用了固體罐發酵，生產條件可根據需要調控，菌體生長速度快，發酵周期短，并且由于是原位滅菌，有效控制了雜菌污染，染菌率控制在1%以內，提高了生產效率，采用本發明所生產的乳糖酶酶活最高可達320U/g。
【具體實施方式】
[0029]以下結合實施例對本發明做進一步描述，但不作為對本發明的限定，本發明的保護范圍以權利要求記載的內容為準，任何依據說明書做出的等效技術手段替換，均不脫離本發明的保護范疇。
[0030]實施例1
[0031]采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0032]A、孢子懸液的制備
[0033]將米曲霉菌株經培養后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0034]B、固體罐發酵
[0035]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發酵培養基進行發酵，固體發酵培養基包括如下單位重量份的組分組成:
[0036]麩皮I ;水 0.8 ;乳糖 0.05 ； (NH4) 2S040.005 ；MgS040.002 ；KH2PO40.005，聚丙二醇0.0008 ；
[0037]發酵溫度為28°C，濕度為45%，壓力為0.03MPa，空氣流量為1.0-2.0m3/min，每間隔4小時間歇攪拌5分鐘，攪拌轉速15轉/分；培養24-36小時；[0038]C、曲盤培養
[0039]當步驟B中基質菌絲體覆蓋率達到90%以上，出料轉至曲盤培養；曲盤培養至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時結束培養；
[0040]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0041]所述的步驟A包括如下工藝步驟:
[0042]Al、將米曲霉菌株轉接入查氏培養基上，在溫度為28 - 32°C條件下培養3_5天；
[0043]A2、將步驟Al中培養的菌株轉接麩曲培養基，在溫度為28 — 32°C條件下培養3_5天;
[0044]A3、用無菌水洗滌步驟A2制備的菌絲體，然后用脫脂棉過濾，濾液轉入滅菌后的種子罐中，加入無菌水調整孢子濃度，制成孢子懸液。
[0045]所述的步驟B中的接種步驟中工藝條件如下:
[0046]開啟攪拌，轉速為15轉/分，將步驟A中制備的孢`子懸液按照孢子懸液:麩皮的質量比為1%_8%的接種量接種至滅菌后的固體發酵培養基中，繼續攪拌5分鐘。
[0047]曲盤培養中優選的培養條件是:步驟C中曲盤培養的溫度為28_32°C，濕度為45-75%，麩曲厚度l_4cm，培養時間為48-60小時。
[0048]步驟Al中培養優選采用霉菌培養箱。
[0049]步驟A2中麩曲培養基采用麩皮:水的質量比=1:0.8配制。
[0050]所制備的米曲霉乳糖酶酶活為265U/g。
[0051]實施例2
[0052]采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0053]A、孢子懸液的制備
[0054]將米曲霉菌株經培養后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0055]B、固體罐發酵
[0056]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發酵培養基進行發酵，固體發酵培養基包括如下單位重量份的組分組成:
[0057]麩皮I ;水 1.1 ;乳糖 0.15 ； (NH4)2SO40.015 ；MgS040.008 ；KH2PO40.01，聚丙二醇
0.0012 ；
[0058]發酵溫度為32°C，濕度為75%，壓力為0.05MPa，空氣流量為1.0-2.0m3/min，每間隔8小時間歇攪拌15分鐘，攪拌轉速30轉/分；培養24-36小時；
[0059]C、曲盤培養
[0060]當步驟B中基質菌絲體覆蓋率達到90%以上，出料轉至曲盤培養；曲盤培養至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時結束培養；
[0061]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0062]步驟A2中麩曲培養基采用麩皮:水的質量比=1:1.1配制。
[0063]其余內容同實施例1。
[0064]所制備的米曲霉乳糖酶酶活為286U/g。
[0065]實施例3
[0066]采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0067]A、孢子懸液的制備[0068]將米曲霉菌株經培養后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0069]B、固體罐發酵
[0070]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發酵培養基進行發酵，固體發酵培養基包括如下單位重量份的組分組成:
[0071]麩皮I ;水 I ;乳糖 0.1 ; (NH4) 2S040.01 ；MgS040.00 5 ；KH2PO40.0075，聚丙二醇0.001 ；
[0072]發酵溫度為30°C，濕度為50%，壓力為0.035MPa，空氣流量為1.0-2.0m3/min，每間隔6小時間歇攪拌10分鐘，攪拌轉速20轉/分；培養24-36小時；
[0073]C、曲盤培養
[0074]當步驟B中基質菌絲體覆蓋率達到90%以上，出料轉至曲盤培養；曲盤培養至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時結束培養；
[0075]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0076]步驟A2中麩曲培養基采用麩皮:水的質量比=1:1配制。
[0077]其余內容同實施例1。
[0078]所制備的米曲霉乳糖酶酶活為320U/g。
[0079]實施例4
[0080]采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0081]A、孢子懸液的制備
[0082]將米曲霉菌株經培養后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0083]B、固體罐發酵
[0084]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發酵培養基進行發酵，固體發酵培養基包括如下單位重量份的組分組成:
[0085]麩皮I ;水 I ;乳糖 0.12 ; (NH4) 2S040.01 ；MgS040.006 ；KH2PO40.008，聚丙二醇
0.001 ；
[0086]發酵溫度為28-32 °C，濕度為45_75%，壓力為0.03-0.05MPa,空氣流量為
1.0-2.0mVmin,每間隔4_8小時間歇攪拌5_15分鐘，攪拌轉速15-30轉/分；培養24-36小時；
[0087]C、曲盤培養
[0088]當步驟B中基質菌絲體覆蓋率達到90%以上，出料轉至曲盤培養；曲盤培養至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時結束培養；
[0089]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0090]孢子懸液的制備應屬于常規技術范疇，其中較為優選的技術方案是:所述的步驟A包括如下工藝步驟:
[0091]Al、將米曲霉菌株轉接入查氏培養基上，在溫度為28 - 32°C條件下培養3_5天；
[0092]A2、將步驟Al中培養的菌株轉接麩曲培養基，在溫度為28 — 32°C條件下培養3_5天;
[0093]A3、用無菌水洗滌步驟A2制備的菌絲體，然后用脫脂棉過濾，濾液轉入滅菌后的種子罐中，加入無菌水調整孢子濃度，制成孢子懸液。
[0094]步驟A2中麩曲培養基采用麩皮:水的質量比=1:0.8配制。其余內容同實施例1。[0095]所制備的米曲霉乳糖酶酶活為304U/g。
[0096]實施例5
[0097]采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0098]A、孢子懸液的制備
[0099]將米曲霉菌株經培養后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0100]B、固體罐發酵
[0101]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發酵培養基進行發酵，固體發酵培養基包括如下單位重量份的組分組成:
[0102]麩皮I ;水 1.1 ;乳糖 0.15 ； (NH4)2SO40.01 ；MgS040.0026 ;ΚΗ2Ρ040.008，聚丙二醇0.001 ；
[0103]發酵溫度為30°C，濕度為60%，壓力為0.05MPa，空氣流量為1.0-2.0m3/min，每間隔6小時間歇攪拌10分鐘，攪拌轉速25轉/分；培養24-36小時；
[0104]C、曲盤培養
[0105]當步驟B中基質菌絲體覆蓋率達到90%以上，出料轉至曲盤培養；曲盤培養至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時結束培養；
[0106]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0107]步驟A2中麩曲培養基采用麩皮:水的質量比=1:1.1配制。
[0108]其余內容同實施例1。
[0109]所制備的米曲霉乳糖酶酶活為312U/g。
【權利要求】
1.采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，其特征在于包括如下工藝步驟: A、孢子懸液的制備 將米曲霉菌株經培養后制成濃度為I 一 5X107cfu/mL的孢子懸液； B、固體罐發酵 將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發酵培養基進行發酵，固體發酵培養基包括如下單位重量份的組分組成:
麩皮1 ;水 0.8-1.1 ;乳糖 0.05-0.15 ； (NH4) 2S040.00 5-0.0 1 5 ；MgS040.00 2-0.008 ；KH2PO40.005-0.01，聚丙二醇 0.0008-0.0012 ； 發酵溫度為28-32°C，濕度為45-75%，壓力為0.03-0.05MPa,空氣流量為1.0-2.0m3/分，每間隔4-8小時間歇攪拌5-15分鐘，攪拌轉速15-30轉/分；培養24-36小時； C、曲盤培養 當步驟B中基質菌絲體覆蓋率達到90%以上，出料轉至曲盤培養；曲盤培養至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時結束培養； 所述的米曲霉菌株選用米曲霉ATCC66222。
2.根據權利要求1所述的采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，其特征在于所述的步驟A包括如下工藝步驟: Al、將米曲霉菌株轉接入查氏 培養基上，在溫度為28 - 32°C條件下培養3-5天； A2、將步驟Al中培養的菌株轉接麩曲培養基，在溫度為28 - 32°C條件下培養3_5天； A3、用無菌水洗滌步驟A2制備的菌絲體，然后用脫脂棉過濾，濾液轉入滅菌后的種子罐中，加入無菌水調整孢子濃度，制成孢子懸液。
3.根據權利要求1所述的采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，其特征在于所述的步驟B中的接種步驟中工藝條件如下: 開啟攪拌，轉速為15-30轉/分，將步驟A中制備的孢子懸液按照孢子懸液:麩皮的質量比為1%_8%的接種量接種至滅菌后的固體發酵培養基中，繼續攪拌5-15分鐘。
4.根據權利要求1所述的采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，其特征在于所述的步驟C中曲盤培養的溫度為28-32°C，濕度為45-75%，麩曲厚度l_4cm，培養時間為48-60小時。
5.根據權利要求2所述的采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵液的方法，其特征在于所述的步驟Al中培養采用霉菌培養箱。
6.根據權利要求2所述的采用固體罐發酵制備米曲霉乳糖酶發酵曲的方法，其特征在于所述的步驟A2中麩曲培養基采用麩皮:水的質量比=1:0.8-1.1配制。
【文檔編號】C12R1/69GK103555692SQ201310519860
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】趙從波, 章淑艷, 馬清河, 李賓, 王云鵬, 李軍, 韓韜, 羅同陽, 秦艷梅, 劉麗娜 申請人:河北省微生物研究所