用于降低酒中高級醇含量的蘋果酶及其制劑和制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于降低酒中高級醇含量的蘋果酶，是蘋果皮的提取物，采用下述方法制成：取蘋果的果皮部分，在果皮中加入冷凍有機(jī)溶劑在高速組織勻漿機(jī)中打漿，將果漿轉(zhuǎn)入燒杯中后繼續(xù)加入冷凍有機(jī)溶劑，用玻璃棒緩慢攪拌后用真空泵抽濾，濾渣再用冷凍的有機(jī)溶劑溶解，經(jīng)玻璃棒攪拌均勻后，再次抽濾；重復(fù)上述操作直至濾渣為無色為止，濾渣轉(zhuǎn)入真空干燥器至干，即得蘋果酶粗酶粉。本發(fā)明的蘋果酶對白酒、果酒等各種常見酒類中有機(jī)醇類，尤其是高級醇，如異丙醇、異丁醇、正丁醇、正己醇等高級醇起到顯著降解作用，同時促進(jìn)了芳香酯類物質(zhì)的合成，使酒的風(fēng)味有明顯改良，在提高酒類風(fēng)味和安全性以及解酒方面表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】用于降低酒中高級醇含量的蘋果酶及其制劑和制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蘋果酶及其在降低酒中高級醇含量方面的應(yīng)用，屬于生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]飲酒是導(dǎo)致人體出現(xiàn)部分疾病的主要原因之一，近年來人們對酒精飲料中乙醇及高級醇危害性的重視程度逐漸加深。由于大多數(shù)人缺乏乙醇轉(zhuǎn)化酶，飲酒過度導(dǎo)致的攝入過量乙醇可導(dǎo)致酒精中毒，嚴(yán)重危害人體健康。同時，對于酒類自身而言，過高濃度的高級醇會導(dǎo)致不良風(fēng)味，當(dāng)含量超過100mg/L時會使酒的口味和受歡迎程度明顯變差；此外過高的高級醇攝入量會對人體產(chǎn)生毒性，其中毒和麻醉作用是乙醇的十幾倍，可損害神經(jīng)系統(tǒng)，使人頭痛。因此選擇能夠合理控制酒精飲品中醇類含量的方法已是迫在眉睫。
[0003]目前研究多從優(yōu)良菌株的選育、釀酒原料的擇優(yōu)以及發(fā)酵工藝的改良三方面對酒中醇類物質(zhì)的生成進(jìn)行調(diào)控，以達(dá)到改善酒體品質(zhì)的目的，但優(yōu)選釀酒菌株的方法存在一定的缺陷:耗時過長或技術(shù)手段復(fù)雜。而單純改變釀酒原料對降低酒類中的高級醇含量效果并不明顯，目前尚沒有出現(xiàn)通過改變釀酒原料普遍降低酒類中各種高級醇的方法；更改發(fā)酵過程的各種理化參數(shù)雖然有助于控制高級醇的生成，微調(diào)酒類風(fēng)味，但在發(fā)酵過程中降低高級醇會同時降低與高級醇有關(guān)的酯類物質(zhì)含量，弱化了酒的風(fēng)味。
[0004]同時，上述的三種思路均只能在釀酒開始時應(yīng)用，對于已有的酒類成品中已經(jīng)生成的高級醇，不能通過改變工藝條件消除或者還原，因此需要采用其他措施進(jìn)行酒類風(fēng)味改善和優(yōu)化。針對這些問題，目前多采用物理化學(xué)方法對酒進(jìn)行改性處理，如高壓脈沖電場可以促進(jìn)酒中高級醇的氧化，使其轉(zhuǎn)化為醛或酸；大孔吸附樹脂吸附和納米膜過濾可分別去除酒中62.39%和44.2%的高級醇，但其特異性較差。
[0005]此外，市售的解酒藥可以在體內(nèi)環(huán)境下降低對乙醇、高級醇等物質(zhì)的吸收，或是通過加快人體對攝入的醇類物質(zhì)的分解代謝，降低血液中醇類濃度，但其長期服用會有一定副作用，影響肝臟、腎臟代謝從而產(chǎn)生不同程度的傷害；或受成本限制，價格較高、不易推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本申請發(fā)明人在多年的研究中，嘗試通過生物酶技術(shù)來降解酒類中的多種醇類物質(zhì)，在經(jīng)過大量艱苦的研究工作和對各種酶的篩選后，發(fā)明人欣喜的發(fā)現(xiàn)從蘋果皮中提取的蘋果酶對醇類物質(zhì)的降解具有顯著效果，在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上 申請人:完成了本發(fā)明。
[0007]為實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0008]一種用于降低酒中高級醇含量的蘋果酶，采用下述方法制成:取蘋果的果皮部分，在果皮中加入冷凍有機(jī)溶劑在高速組織勻漿機(jī)中打漿，將果漿轉(zhuǎn)入燒杯中后繼續(xù)加入冷凍有機(jī)溶劑，用玻璃棒緩慢攪拌后用真空泵抽濾，濾渣再用冷凍的有機(jī)溶劑溶解，經(jīng)玻璃棒攪拌均勻后，再次抽濾；重復(fù)上述操作直至濾渣為無色為止，濾渣轉(zhuǎn)入真空干燥器至干，即得蘋果酶粗酶粉。
[0009]上述所述的蘋果，包括目前已有的各種蘋果品種，包括但不限于成熟的紅富士、嘎啦、紅星、黃元帥、喬納金等， 申請人:對不同蘋果品種中提取的蘋果酶的降解性能進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)從富士蘋果中提取的蘋果酶具有最為理想的活性，因此優(yōu)選蘋果的品種為富士。
[0010]相應(yīng)的，本發(fā)明公開了蘋果酶的制備方法，即取蘋果的果皮部分，在果皮中加入冷凍有機(jī)溶劑在高速組織勻漿機(jī)中打漿，將果漿轉(zhuǎn)入燒杯中后繼續(xù)加入冷凍有機(jī)溶劑，用玻璃棒緩慢攪拌后用真空泵抽濾，濾渣再用冷凍的有機(jī)溶劑溶解，經(jīng)玻璃棒攪拌均勻后，再次抽濾；重復(fù)上述操作直至濾渣為無色為止，濾渣轉(zhuǎn)入真空干燥器至干，即得蘋果酶粗酶粉。
[0011]與上述類似，優(yōu)選的蘋果品種為富士。
[0012]在上述方法中，所用的有機(jī)溶劑為常見的不被本發(fā)明蘋果酶降解的有機(jī)溶劑，如芳香烴類、醚類和酮類有機(jī)溶劑，優(yōu)選的，考慮到成本和有機(jī)毒性的綜合需要，所述有機(jī)溶劑為丙酮，冷凍溫度為-30°C。
[0013]本發(fā)明的制備方法，進(jìn)一步的還包括將蘋果酶粗酶粉制成蘋果酶酶液，具體包括:將蘋果酶粗酶粉I溶解于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，緩慢攪拌然后過濾，取濾液離心，離心所得上清液中加入(NH4)2SO4提高其飽和度，然后靜置、高速離心，將所得沉淀溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，所得即為蘋果酶酶液。
[0014]通過上述方式，能夠?qū)⑻O果酶成分進(jìn)行富集。
[0015]其中，上述所用的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液濃度優(yōu)選為為0.1M，pH4.6。
·[0016]進(jìn)一步的，本發(fā)明還公開了一種用于降低酒中高級醇含量的蘋果酶制劑，是將蘋果酶粗酶粉或權(quán)利要求4的蘋果酶酶液固定在載體上，所述載體為海藻酸鈉或殼聚糖。
[0017]通過將蘋果酶固定化，能更好的保證蘋果酶的有效量和活性，提高其降解效果。
[0018]在對不同載體固定化研究過程中， 申請人:發(fā)現(xiàn)采用海藻酸鈉對蘋果酶進(jìn)行固定化能最好的發(fā)揮其活性，因此本發(fā)明的蘋果酶制劑優(yōu)選為海藻酸鈉固定化蘋果酶。
[0019]相應(yīng)的，本發(fā)明提供了上述海藻酸鈉固定化蘋果酶的制備方法，將海藻酸鈉溶液與蘋果酶粗酶粉或蘋果酶酶液混合，混合液均勻滴入CaC12溶液中，得到的凝膠小球固定后用蒸餾水洗凈，即得固定化蘋果酶酶粉或固定化蘋果酶酶液。
[0020] 申請人:對海藻酸鈉溶液、氯化鈣溶液等的濃度、固化時間進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在下述濃度范圍下海藻酸鈉濃度10-100g/L、氯化鈣溶液濃度l_50g/L、固化時間0.1-5小時下固化的蘋果酶具有較好的活性，優(yōu)選的海藻酸鈉濃度25-45g/L、氯化鈣溶液濃度5-25g/L、固化時間0.5-3.5小時，最優(yōu)選海藻酸鈉的濃度為40g/L，氯化鈣的濃度為20g/L，固定化時間為2h。
[0021]對本發(fā)明的蘋果酶降解能力研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的蘋果酶對降解酒類飲品中的多種成分具有良好的效果，這些成分不僅包括簡單的乙醇，尤其對正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正己醇等高級醇也具有顯著的降解效果，同時對部分酒類飲品中的乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯等酯類化合物也具有一定的合成能力從而改善其風(fēng)味，因此本發(fā)明還公開了蘋果酶在降解酒中醇類物質(zhì)的應(yīng)用，其中所述醇類包括但不限于乙醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正己醇。[0022]通過上述改進(jìn)，本發(fā)明的蘋果酶對乙醇以及各種高級醇起到了特異性的降解作用，同時促進(jìn)了芳香酯類物質(zhì)的合成，使酒的風(fēng)味有明顯改良，在提高酒類風(fēng)味和安全性以及解酒方面表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1、2、3、4、5分別為各種制劑類型的富士蘋果酶、嘎啦蘋果酶、喬納金蘋果酶、黃元帥蘋果酶、紅星蘋果酶對同一酒飲中各種醇類成分的降解效果圖示，附圖1-5中a、b、C、d、e分別表示海藻酸鈉固體化蘋果酶粗酶粉、蘋果酶粗酶粉、蘋果酶酶液、殼聚糖固體化蘋果酶液、海藻酸鈉固定化蘋果酶液。
[0024]圖6為酒用量對海藻酸鈉固定化蘋果酶降解效果的影響圖。
[0025]圖7、8、9、10分別為蘋果酶酶粉用量、海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、固化時間變化對固定化蘋果酶降解效果的影響圖。
[0026]圖11為采用海藻酸鈉固定化蘋果酶反應(yīng)次數(shù)對酒中乙醇降解率的變化圖。【具體實施方式】
[0027]分別采用不同的蘋果品種作為原料提取蘋果酶，并分析其活性。在下述實施里中使用的蘋果分別選自成熟的紅富士、嘎啦、紅星、黃元帥、喬納金蘋果，選用的樣本均無傷痕、無病害、品質(zhì)良好，均為市售。
[0028]為分析蘋果酶對酒中成分降解的效果，選用了多種酒類，包括市售的45°西鳳酒，50°太白酒，56° 二鍋頭，10°獼猴桃酒，上述酒均為質(zhì)檢合格未拆封產(chǎn)品。
[0029]下述實施例中使用的化學(xué)原料包括丙酮、50%戊二醛、檸檬酸、檸檬酸鈉、無水氯化鈣(購于天津市博迪化工有限公司，AR);硫酸銨(天津市縱橫興工貿(mào)有限公司化工試劑分公司，AR);透析袋8000-14000;食用級海藻酸鈉(青島明月海藻集團(tuán)有限公司)；殼聚糖(西安沃爾森生物技術(shù)有限公司)。
`[0030]下述實施例中使用的儀器包括MDF-3286S冰箱(SANYO日本三洋)，ST-303組織勻漿機(jī)(廣東美斯特電器)，SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，DZF真空干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)，F(xiàn)-101電動攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)，GL-20G-1I型高速冷凍離心機(jī)(海安亭科學(xué)儀器廠)，20ml注射器(平頂山市圣光醫(yī)用制品有限公司)，XMTD恒溫水浴器(北京科偉永興儀器有限公司)，GC9800(FP)氣相色譜儀(上海科創(chuàng)色譜儀器有限公司)，TRACE ISQ氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)。
[0031]1.分別采用下述方法制備粗酶粉、酶液及其制劑
[0032]一:蘋果酶粗酶粉的制備
[0033]稱取200g蘋果(4°C預(yù)冷2d)的果皮部分(厚度0.4-0.5mm)，采用丙酮粉提取法提取粗酶:在上述果皮中加入50mL冷凍丙酮(_30°C )，在高速組織勻漿機(jī)中打漿，將果漿轉(zhuǎn)入燒杯中，加入IOOmL冷凍丙酮，用玻璃棒緩慢攪拌lmin，用真空泵抽濾，濾渣再用IOOmL冷凍丙酮溶解，經(jīng)玻璃棒攪拌均勻后，再次抽濾。如此反復(fù)，直至濾渣為無色為止，濾渣轉(zhuǎn)入真空干燥器至干，即為所得粗酶粉。
[0034]二:蘋果酶酶液的制備[0035]以實施例1的粗酶粉為基礎(chǔ)，稱Ig粗酶粉溶解于20mL，pH4.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(0.1M，4°C預(yù)冷12h)中，在4°C下用電子恒速攪拌器緩慢攪拌30min，再用四層干凈紗布過濾，取濾液在4°C下4000rpm離心30min，上清液中加入(NH4) 2S04,使飽和度達(dá)到70%，4°C靜置過夜，1000Orpm離心30min，沉淀溶于pH4.6,0.lmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，所得即為蘋果酶酶液。
[0036]三:海藻酸鈉固定化蘋果酶制劑的制備
[0037]將10mL40g/L海藻酸鈉溶液與0.125g酶粉或2.5mL酶液混合，混合液經(jīng)注射器以20滴/min的速度均勻滴入20g/L CaCl2溶液中，得到的凝膠小球在4°C下固定Ih后用蒸餾水洗凈，分別制成固定化酶粉和固定化酶液。
[0038]四:殼聚糖固定化蘋果酶液制劑的制備
[0039]將0.565g殼聚糖與3.75mL50%戊二醛充分混合，于室溫下靜置3h使殼聚糖充分活化。用蒸餾水多次清洗殼聚糖粉，去除多余戊二醛。加入2.5mL酶液反應(yīng)lh，再次用蒸餾水進(jìn)行清洗，直至洗液不具酶活后，即得殼聚糖固定化酶。
[0040]2.為研究本發(fā)明蘋果酶的效果， 申請人:進(jìn)行了下述實驗:
[0041]2.1不同蘋果酶制劑對太白酒中主要醇類物質(zhì)的降解作用
[0042]取20mL太白酒，分別加入0.125g酶粉、2.5mL酶液、相同含量的固定化酶粉和酶液，在37°C條件下水浴反應(yīng)時間lh。空白組加入等量滅活的游離酶粉和固定化酶粉以及
2.5mL檸檬酸緩沖液和等量固定化緩沖液。反應(yīng)結(jié)束后，立即冰浴終止反應(yīng)。
[0043]2.2海藻酸鈉固定化富士酶工藝參數(shù)的優(yōu)化
[0044]不同酒用量對固定化酶降解效果的影響:將0.3g酶粉與10mL40g/L海藻酸鈉溶液充分混合，滴于20g/LCaCl2溶液中，固定時間為2h。制備好的固定化酶分別與20mL、40mL、60mL太白酒在37°C條件下水浴反應(yīng)lh。反應(yīng)停止后檢測酒中醇類物質(zhì)的變化量。
[0045]不同酶用量對固定化酶降解效果的影響:將質(zhì)量濃度梯度為0.lg、0.3g、0.5g、
0.8g的酶粉分別進(jìn)行固定化，與10ml40g/L海藻酸鈉溶液充分混合，滴于20g/LCaCl2溶液中，固定時間為2h。制備好的固定化酶與20mL太白酒在37°C條件下水浴反應(yīng)lh。反應(yīng)停止后檢測酒中醇類物質(zhì)的變化量。
[0046]不同海藻酸鈉濃度對固定化酶降解效果的影響:采用IOmL質(zhì)量濃度分別為25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L的海藻酸鈉溶液與0.3g酶粉充分混合，滴于20g/LCaCl2溶液中，固定時間為2h。制備好的固定化酶與20mL太白酒在37°C條件下水浴反應(yīng)lh。反應(yīng)停止后檢測酒中醇類物質(zhì)的變化量。
[0047]不同氯化鈣濃度對固定化酶降解效果的影響:將0.3g酶粉與10mL40g/L海藻酸鈉溶液充分混合，以20滴/min的速度均勻滴入不同質(zhì)量濃度的氯化鈣溶液中(5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L)，固定時間為2h。制備好的固定化酶與20mL太白酒在37°C條件下水浴反應(yīng)lh。反應(yīng)停止后檢測酒中醇類物質(zhì)的變化量。
[0048]不同固定化時間對固定化酶降解效果的影響:將0.3g酶粉與10mL40g/L海藻酸鈉溶液充分混合，滴于2% CaCl2溶液中，固定時間分別為0.5h、l.25h、2h、2.75h、3.5h。制備好的固定化酶與20mL太白酒在37°C條件下水浴反應(yīng)lh。反應(yīng)停止后檢測酒中醇類物質(zhì)的
變化量。
[0049]根據(jù)Design Expert8.0對固定化酶主要工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用Box-Behnken中心組合模型進(jìn)行實驗設(shè)計,實驗因素和水平設(shè)計如下表1。制備固定化酶，然后與20mL太白酒在37°C條件下水浴反應(yīng)lh。反應(yīng)停止后檢測酒中醇類物質(zhì)的變化量。
[0050]表1響應(yīng)面實驗因素和水平設(shè)計表
【權(quán)利要求】
1.一種用于降低酒中高級醇含量的蘋果酶，其特征在于采用下述方法制成:取蘋果的果皮部分，在果皮中加入冷凍有機(jī)溶劑在高速組織勻漿機(jī)中打漿，將果漿轉(zhuǎn)入燒杯中后繼續(xù)加入冷凍有機(jī)溶劑，用玻璃棒緩慢攪拌后用真空泵抽濾，濾渣再用冷凍的有機(jī)溶劑溶解，經(jīng)玻璃棒攪拌均勻后，再次抽濾；重復(fù)上述操作直至濾渣為無色為止，濾渣轉(zhuǎn)入真空干燥器至干，即得蘋果酶粗酶粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果酶，其特征在于所述蘋果的品種為富士。
3.權(quán)利要求1所述蘋果酶的制備方法，其特征在于采用下述方法制成:取蘋果的果皮部分，在果皮中加入冷凍有機(jī)溶劑在高速組織勻漿機(jī)中打漿，將果漿轉(zhuǎn)入燒杯中后繼續(xù)加入冷凍有機(jī)溶劑，用玻璃棒緩慢攪拌后用真空泵抽濾，濾渣再用冷凍的有機(jī)溶劑溶解，經(jīng)玻璃棒攪拌均勻后，再次抽濾；重復(fù)上述操作直至濾渣為無色為止，濾渣轉(zhuǎn)入真空干燥器至干，即得蘋果酶粗酶粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑為丙酮，冷凍溫度為-30 0C ο
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于還進(jìn)一步包括將蘋果酶粗酶粉制成蘋果酶酶液，具體包括:將蘋果酶粗酶粉I溶解于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，緩慢攪拌然后過濾，取濾液離心，離心所得上清液中加入(NH4) 2S04提高其飽和度，然后靜置、高速離心，將所得沉淀溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，所得即為蘋果酶酶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液濃度為 0.1M, ρΗ4.6。
7.一種用于降低酒中高級醇含量的蘋果酶制劑，其特征在于將權(quán)利要求1的用于降低酒中高級醇含量的蘋果酶粗酶粉或權(quán)利要求4的蘋果酶酶液固定在載體上，所述載體為海藻酸鈉或殼聚糖。
8.權(quán)利要求7所述蘋果酶制劑的制備方法，其特征在于將海藻酸鈉溶液與蘋果酶粗酶粉或蘋果酶酶液混合，混合液均勻滴入CaCl2溶液中，得到的凝膠小球固定后用蒸餾水洗凈，即得固定化蘋果酶酶粉或固定化蘋果酶酶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述海藻酸鈉的濃度為40g/L，氯化鈣的濃度為20g/L，固定化時間為2h。
10.權(quán)利要求1所述蘋果酶在降解酒中醇類物質(zhì)的應(yīng)用，其中所述醇類包括乙醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、 異戊醇、正己醇。
【文檔編號】C12N9/00GK103627680SQ201310539121
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月1日
【發(fā)明者】師俊玲, 韓淇安, 朱靜 申請人:師俊玲, 韓淇安, 朱靜