L11 mt蛋白作為甲基轉移酶的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種來源于冰島硫化葉菌的L11?MT蛋白在作為甲基轉移酶中的應用。本發明所提供的應用具體為L11?MT蛋白（序列1）在作為甲基轉移酶中的應用；所述甲基轉移酶能對如下底物蛋白中的至少一種進行甲基化修飾：Sul7d蛋白、Cren7蛋白、RPL11蛋白、Rrp4蛋白、Csl4蛋白和Rrp42蛋白。本發明中作為甲基轉移酶的蛋白具有良好的熱穩定性，能夠催化甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉移到多種底物蛋白，具有廣泛的實用性。另外，本發明的發明人對酶促反應的溫度、pH、反應時間、酶和底物的摩爾比、反應體系中的離子種類及濃度等進行了優化，得到了一系列優化反應條件，這為將所述L11?MT蛋白的甲基轉移酶活性更好的應用于科研及工業生產奠定了堅實的基礎。
【專利說明】L11 MT蛋白作為甲基轉移酶的應用
【技術領域】[0001]本發明涉及一種來源于冰島硫化葉菌的Lll MT蛋白在作為甲基轉移酶中的應用。【背景技術】[0002]蛋白的翻譯后修飾目前已報道的就超過200多種，其中研究較多的是磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化、糖基化、脂基化等，尤其以真核生物中組蛋白的修飾為主要內容的表觀遺傳學最為引人關注。組蛋白N端尾部是修飾集中發生的區域，經常被乙酰轉移酶、甲基轉移酶、激酶及泛素連接酶等識別做上相應的記號，成為“組蛋白密碼”參與其它蛋白的募集，進而調節染色體的高級形態、染色體復制分離和基因表達。多種修飾在不同組蛋白的不同的位點產生的密碼組合變化非常之多，從而可能實現更為精細的調控。其中，組蛋白甲基化修飾早在1964年即有報道，但直到近幾年組蛋白甲基轉移酶及去甲基化酶的發現才正式揭開了表觀遺傳研究的一大重要方向。[0003]組蛋白甲基化通常只發生在賴氨酸和精氨酸。催化組蛋白甲基化的酶可分為賴氨酸甲基轉移酶(KMT)和精氨酸甲基轉移酶(RMT)兩大家族。KMT大多數含有SET結構域。SET家族賴氨酸甲基轉移酶負責催化已知的大多數組蛋白甲基化，如H3K4和H3K36甲基化參與基因轉錄激活，而H3K9、H3K27和H4K20的甲基化則參與異染色質的形成，抑制基因轉錄。Zhang、Struhl和Gottschling等多個課題組在2002年幾乎同時發現了一類新的不含SET結構域的甲基轉移酶，即Dotl家族，可以催化H3K79位的甲基化。與其它甲基化通常發生在N端尾巴不同，K79位于組蛋白H3的核心部位，但晶體結構顯示K79暴露于核小體的表面。[0004]DotlCDisruptor Of Telomeric silencing)在釀酒酵母中篩選影響端粒沉默因子時首次發現，隨后發現Dotl同源蛋白普遍存在于人和其它哺乳動物。Dotl蛋白家族含有4個保守的基序(motif)，這些基序對依賴于SAM的甲基轉移酶活性是至關重要的，基序I中的一個甘氨酸突變或幾個氨基酸突變會造成其甲基轉移酶活性大部分喪失。許瑞明課題組解析的人DotlL蛋白活性中心的結構與功能分析表明雖然其三維結構類似于典型的RMT，但催化機制則接近于含SET結構域的KMT。Dotl能專一地催化組蛋白H3K79的甲基化，包括單甲基化、二甲基化和三甲基化。酵母、果蠅和小鼠中敲除Dotl后，導致組蛋白H3K79完全不能甲基化。H3K79的甲基化可以阻止Sir2/3去乙酰化復合體對染色質的結合從而抑制異染色質的形成，而Sir2/3復合體如果先結合到未發生H3K79的區域，則可以阻止Dotl產生H3K79甲基化，兩者處于這樣一種動態平衡，維持常染色質和異染色質兩種狀態。H3K79甲基化是常染色質或轉錄激活的標志，在釀酒酵母中90%的H3K79被甲基化，這與釀酒酵母常染色質約占90%—致；其余10%包括端粒、rDNA重復區、HML/HMR為異染色質區。Dotl參與許多生物學過程，譬如減數分裂檢驗點(checkpoint)和DNA損傷修復途徑等。哺乳動物和人DotlL蛋白在胚胎發育、造血功能、心臟機能、白血病發生等方面都發揮著重要作用，并且有可能成為白血病治療干預的靶子。[0005]相對于真核生物，原核生物中蛋白翻譯后修飾的研究較少。硫化葉菌(Sulfolobus)屬于泉古菌門，是最早被發現的嗜酸嗜熱微生物。硫化葉菌經過多年的研究積累，特別是近幾年已初步建成遺傳轉化與操作體系，目前已成為極端嗜熱古菌最常用的模式生物之一。古菌雖然屬于原核生物，其基因組的形態大小都與細菌相近，但其染色體的包裝、復制與遺傳信息的傳遞加工都具有真核生物的“簡單原型”。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種來源于冰島硫化葉菌(Sulfolobus islandicus)的蛋白質的新用途。該蛋白質的氨基酸序列如序列表中序列I所示，將其命名為Lll MT蛋白。
[0007]本發明所提供的新用途具體為在Lll MT蛋白在作為甲基轉移酶中的應用，或LllMT蛋白在制備具有甲基轉移酶功能的產品中的應用。
[0008]進一步，在本發明中，所述LI I MT蛋白在作為甲基轉移酶中的應用，具體體現在所述Lll MT蛋白具有將甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉移到底物蛋白上的功能。
[0009]在上述應用中，所述甲基轉移酶能對如下底物蛋白中的至少一種進行甲基化修飾:Sul7d蛋白、Cren7蛋白、RPLll蛋白、Rrp4蛋白、Csl4蛋白和Rrp42蛋白。
[0010]進一步,所述Sul7d蛋白的氨基酸序列具體如序列表中序列3所示；所述Cren7蛋白的氨基酸序列具體如序列表中序列5所示；所述RPLll蛋白的氨基酸序列具體如序列表中序列7所不；所述Rrp4蛋白的氣基酸序列具體如序列表中序列9所不；所述Rrp42蛋白的氨基酸序列具體如序列表中序列11所示。
[0011]在本發明中，所述Lll MT蛋白的編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中序列2。
[0012]在本發明中，所述Sul7d蛋白的編碼基因的核苷酸酸序列具體如序列表中序列4所不；所述Cren7蛋白的編`碼基因的核昔酸序列具體如序列表中序列6所不；所述RPLl I蛋白的編碼基因的核苷酸序列具體如序列表中序列8所示；所述Rrp4蛋白的編碼基因的核苷酸序列具體如序列表中序列10所示；所述Rrp42蛋白的編碼基因的核苷酸序列具體如序列表中序列12所示。
[0013]在所述應用中，所述Lll MT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應溫度可為 30-80。。，如 30-37。。，如 37-70。。，如 40-65°C，再如 45_6(TC，進一步如 50-60°C，具體如3(TC、37°C、4(TC、45t:、5(rC、6(rC、65t:、7(rC*8(rC。
[0014]在所述應用中，所述Lll MT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應pH可為
6.0 以上，如 6.0-9.0，再如 7.0-9.0，進一步如 8.0-9.0，具體如 7.0,8.0 或 9.0。
[0015]在所述應用中，所述Lll MT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應時間可為30_180min,如 60_120min,具體如 30min、60min、120min 或 180min。
[0016]在本發明中，當所述底物蛋白為所述Cren7蛋白時,所述反應時間以30min為宜；當所述底物蛋白為所述RPLll蛋白時，所述反應時間以120min為宜。
[0017]在所述應用中，所述Lll MT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應體系中，所述Lll MT蛋白和所述底物蛋白的摩爾比為1: (0.5-7)，如1: (1.5-7)，再如1: (3-7),具體如 1:0.5、1:1.5、1:3、1:4.5、1:6 或 1:7。
[0018]在所述應用中，對所述底物蛋白進行甲基化修飾采用的甲基供體具體可為3H標記的S-腺苷甲硫氨酸(簡寫為3H-SAM)。進一步，所述甲基供體H3-SAM中3H的含量為15Ci/mmol ο[0019]在所述應用中，所述Lll MT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應體系中，采用的IOX反應緩沖液的pH為7.0-9.0 (如8.0)，溶劑為水，溶質及濃度如下:Tris-HCl100mmol/L, DTT 10mmol/L。
[0020]進一步，在本發明的一個實施例中，在所述Lll MT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應體系中，所述Lll MT蛋白的終濃度為4 μ mol/L，所述底物蛋白的終濃度為12 μ mol/L，所述甲基供體3H-SAM的終濃度為1.2 μ mol/L (H3-SAM中3H的含量為15Ci/mmol)。
[0021]在本發明中，所述Lll MT蛋白是按照如下方法制備得到的:將含有所述Lll MT蛋白的編碼基因(序列2)的DNA片段“AG+序列2”插入到pGEX_4T_l載體的多克隆位點Sal I和Eag I之間后表達得到的含有GST標簽的融合蛋白，切除GST標簽后得到所述Lll MT蛋白。所述Sul7d蛋白是按照如下方法制備得到的:將含有所述Sul7d蛋白編碼基因(序列4)的DNA片段“CC+序列4”插入到pET-28a-(+)載體的多克隆位點Nco I和Xho I之間后表達得到所述Sul7d蛋白。所述RPLll蛋白是按照如下方法制備得到的:將所述RPLll蛋白編碼基因(序列8)插入到pET-28a-(+)載體的多克隆位點Nde I和Xho I之間后表達得到所述RPLll蛋白。所述Cren7蛋白是按照如下方法制備得到的:將所述Cren7蛋白編碼基因(序列6的第4-180位)插入到pET-30a-(+)載體的多克隆位點Nde I和Xho I之間后表達得到所述Cren7蛋白。所述Rrp4蛋白是按照如下方法制備得到的:將所述Rrp4蛋白編碼基因(序列10的第4-741位)插入到pET-30a-(+)載體的多克隆位點Nde I和Xho I之間后表達得到所述Rrp4蛋白。所述Rrp42蛋白是按照如下方法制備得到的:將所述Rrp42蛋白編碼基因(序列12的第4-825位)插入到pET30a-(+)載體的多克隆位點Nde I和XhoI之間后表達得到所述Rrp42蛋白。所述Csl4蛋白是按照如下方法制備得到的:將所述Csl4蛋白編碼基因(序列14的第4-567位)插入到pET_30a-(+)載體的多克隆位點Nde I和Xho I之間后表達得到所述Csl4蛋白。
[0022]本發明中作為甲基轉移酶的蛋白質Lll MT來源于極端嗜熱古菌冰島硫化葉菌(Sulfolobus islandicus),具有良好的熱穩定性，實驗證明Lll MT蛋白對于蛋白質底物具有較為廣譜的催化活性，能夠催化甲基從S-腺苷甲硫氨酸`轉移到多種底物蛋白，具有廣泛的實用性。另外，本發明的發明人對酶促反應的溫度、pH、反應時間、酶和底物的摩爾比、反應體系中的離子種類及濃度等進行了優化，得到了一系列優化反應條件，這為將所述LllMT蛋白的甲基轉移酶活性更好的應用于科研及工業生產奠定了堅實的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為純化前后Lll MT蛋白(切除GST標簽和未切除GST標簽)的SDS-PAGE電泳結果。
[0024]圖2為純化后Lll MT-6His蛋白、G38R蛋白、Sul7d蛋白、RPLll蛋白、Cren7蛋白的SDS-PAGE電泳結果。
[0025]圖3為為Lll MT蛋白對不同底物蛋白的催化作用。其中，A為考馬斯亮藍染色結果；B為放射性自顯影結果。
[0026]圖4為溫度對Lll MT蛋白甲基轉移酶酶活性的影響(以Sul7d為底物)。其中，A為放射性自顯影結果；B為考馬斯亮藍染色結果。[0027]圖5為pH對Lll MT蛋白甲基轉移酶酶活性的影響(以Cren7為底物)。其中，A為考馬斯亮藍染色結果出為液閃計數結果，縱坐標CPM表示測定放射性同位素的每分鐘的計數次數，表示射線的放射強度。
[0028]圖6為反應時間對Lll MT蛋白甲基轉移酶酶活性的影響(以Cren7和RpLll為底物)。圖為A放射性自顯影結果，圖B為液閃計數結果，縱坐標CPM表示測定放射性同位素的每分鐘的計數次數，表示射線的放射強度。
[0029]圖7為LI I MT蛋白和底物蛋白的摩爾比對Lll MT蛋白甲基轉移酶酶活性的影響(以RpLll為底物)。其中，A為Lll MT蛋白結果(上:放射性自顯影；下:考馬斯亮藍染色)；B為以G38R突變蛋白替代Lll MT蛋白的結果(上:放射性自顯影；下:考馬斯亮藍染色)；C為Lll MT蛋白及G38R突變蛋白的液閃計數結果。
[0030]圖8為離子種類及其濃度對Lll MT蛋白甲基轉移酶酶活性的影響(以RpLll為底物)。其中，A為考馬斯亮藍染色結果；B為液閃計數結果，縱坐標CPM表示測定放射性同位素的每分鐘的計數次數，表示射線的放射強度。
【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033]冰島硫化葉菌(Sulfolobusislandicus) Reyl5A:記載于“Guo L, Briigger K, LiuC，et al.Genome analyses of Icelandic strains of Sulfolobus islandicus, modelorganisms for genetic and virus-host interaction studies.J Bacteriol，2011Apr;I93(7):1672-80.” 一文。
[0034]硫橫礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus) P2:記載于 “Peter Redder, RogerA.Garrett.Mutations and Rearrangements in the Genome of Sulfolobus solfataricusP2.Journal of Bacteriology, June2006，4198-4206.” 一文。
[0035]其他實驗材料獲得途徑如下表:
[0036]
【權利要求】
1.Lll MT蛋白在作為甲基轉移酶中的應用，或在制備具有甲基轉移酶功能的產品中的應用； 所述Lll MT蛋白由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述甲基轉移酶具有對如下底物蛋白中的至少一種進行甲基化修飾的功能:Sul7d蛋白、Cren7蛋白、RPLll蛋白、Rrp4蛋白、Csl4蛋白和Rrp42蛋白。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于:所述Sul7d蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述Cren7蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述RPLll蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示；所述Rrp4蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述Rrp42蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。
4.根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于:所述LllMT蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ;或/和 所述Sul7d蛋白的編碼基因的核昔酸酸序列如序列表中序列4所不；所述Cren7蛋白的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示；所述RPLll蛋白的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列8所不；所述Rrp4蛋白的編碼基因的核昔酸序列如序列表中序列10所;所述Rrp42蛋白的編碼基因的核昔酸序列如序列表中序列12所不。
5.根據權利要求1-4中任一所述的應用，其特征在于:所述應用中，所述LllMT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應溫度為30-80°C。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于:所述應用中，所述LllMT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應溫度為37-70°C。
7.根據權利要求1-6中任一所述的應用，其特征在于:所述應用中，所述LllMT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應PH為6以上。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述應用中，所述LllMT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應PH為7-9。
9.根據權利要求1-8中任一所述的應用，其特征在于:所述應用中，所述LllMT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應時間為30-180min。
10.根據權利要求1-8中任一所述的應用，其特征在于:所述應用中，所述LII MT蛋白對所述底物蛋白進行甲基化修飾的反應體系中，所述Lll MT蛋白和所述底物蛋白的摩爾比為 1:(0.5-7)。
【文檔編號】C12N15/54GK103555686SQ201310552458
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2013年11月8日
【發明者】曹勤紅, 樓慧強, 牛艷玲, 王思碩, 夏乙燧 申請人:中國農業大學