一種具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的構建的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的構建，屬于酶工程領域。通過把釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、煙曲霉纖維素內切酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列按順序合成，在兩端加上限制性內切酶位點，通過酶切構建到pPIC9K質粒中，再將該質粒轉化到酵母中得到具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株。其生產纖維素內切酶的回收率達到86%，發酵后內切酶的酶活達到8.5U/g濕酵母。本發明實現了纖維素內切酶生產和同步濃縮回收的一步完成，降低了能源消耗，降低了成本，具有較強的實用性。
【專利說明】一種具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的構建
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于酶工程領域，具體涉及一種具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的構建。
【背景技術】
[0003]纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產生的纖維素達到100億噸左右，利用纖維素生產生物能源，是緩解能源危機，實現人類可持續發展的關鍵。
[0004]纖維素利用的關鍵是把纖維素降解為可發酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需要外切酶、內切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中內切酶降解長片段的纖維素成為二聚體，是纖維素降解的關鍵步驟。用纖維素酶降解纖維素具有綠色、條件溫和、轉化率高的特點，但是纖維素較高的生產成本成為纖維素酶降解纖維素的瓶頸。
[0005]液體發酵具有發酵體積大，易實現自動化控制等特點，被廣泛用來生產纖維素內切酶等。但是液體發酵生產的酶類產品濃度低，生產的纖維素內切酶等都游離在發酵醪液中，為得到高濃度的纖維素內切酶或內切酶的固體粉末，需要對發酵醪液進行濃縮。為純化濃縮纖維素內切酶往往需要通過真空蒸發或噴霧干燥等工藝來濃縮。在纖維素蒸發濃縮或噴霧干燥的過程中，纖維素內切酶的活性喪失一部分，而且濃縮工藝大幅度提高了纖維素酶的生產成本。在蒸發或噴霧干燥的過程中，消耗大量的能源如電或燃氣等。因此濃縮成本，成為降低液體發酵生產纖維素內切酶生產成本的必然選擇。

【發明內容】

[0006]本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株。
[0007]本發明的另一目的在于提供用于構建上述酵母菌株的DNA片段。
[0008]本發明的再一目的在于提供用于構建上述酵母菌株的質粒。
[0009]本發明的目的還在于提供上述酵母菌株的構建方法。
[0010]本發明的目的通過下述技術方案實現:
用于構建具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、煙曲霉纖維素內切酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列；上述序列分別如SEQ ID N0.1~5所示。
[0011]優選的，所述的用于構建具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID N0.6所示。
[0012]用于構建具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的質粒為包含上述DNA片段的真核表達質粒。所述的真核表達質粒優選為PPIC9K質粒。
[0013]所述的用于構建具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的質粒優選通過包含如下步驟的方法制備得到:合成兩端有限制性內切酶識別位點含有上述DNA片段的序列,通過限制性內切酶連接到真核表達質粒上。所述的真核表達質粒pPIC9K質粒時，限制性內切酶優選為Bgl II和FspA I。
[0014]一種具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株，含有上述質粒。所述的酵母菌株優選為酵母菌株SMDl 168。
[0015]所述的具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的構建方法，包括如下步驟:制備酵母電轉化感受態細胞，將上述質粒通過電轉化轉進酵母中得到。
[0016]本發明相對于現有技術具有如下優點和效果:
本發明的酵母菌株能在生產纖維素內切酶的同時，把纖維素內切酶吸收在菌株自身表面，通過簡單過濾，就能達到濃縮纖維素內切酶的目的。
[0017]本發明大大簡化了纖維素內切酶的濃縮工藝，降低了能源消耗，大幅度降低了成本，因此該發明具有較強的實用性。
[0018]本發明把煙曲霉纖維內切酶基因在酵母內表達,并實現了煙曲霉內切酶生產和同步濃縮回收的一步完成，因而具有較高的創新型。
[0019]本發明酵母菌株生產纖維素內切酶的回收率達到86%，發酵后內切酶的酶活達到
8.5 U/g濕酵母。
【具體實施方式】
[0020]下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0021]實施例1
(l)pPIC9K質粒的提取
I)接1%含PPIC9K質粒的大腸桿菌細胞于2 mL LB培養基。
[0022]2)37 °C振蕩培養 12 h。
[0023]3)取1.5 mL菌液于EP管，以4000 rpm離心3 min,棄上清液。
[0024]4)加 0.1 mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25 mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。
[0025]5)加入0.2 mL溶液II (0.2 mM NaOH, 1% SDS),輕輕翻轉混勻，置于冰浴5 min。
[0026]6)加入0.15 mL預冷溶液111(5 mol/L KAc, pH4.8),輕輕翻轉混勻,冰浴5 min。
[0027]7)以10000 rpm離心20 min，取上清液于另一新EP管中。
[0028]8)加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10 min。
[0029]9)再以 10000 rpm 離心 20 min,棄上清。
[0030]10)用70%乙醇0.5 mL洗滌一次,抽干所有液體。
[0031]11)待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE緩沖液中。
[0032](2)大腸桿菌DH5a感受態細胞的制備
I)將大腸桿菌DH5a置于LB或其它營養豐富的培養基上，在37 °C下過夜培養。
[0033]2)高溫滅菌大的離心瓶(250~500 mL)以備第二天搖瓶用。[0034]3)準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用。
[0035]4)轉移0.2~I mL過夜培養物至裝有20 mL LB (或其他營養豐富的培養基)的100 mL搖瓶。
[0036]5)37 1:下劇烈振蕩培養6小時。
[0037]6)監控0D600值(培養I小時后每半小時測定一次)。
[0038]7)當0D600值達到0.5~1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15分鐘。
[0039]8)細胞在4 V 5000g下離心15分鐘，棄上清液。
[0040]9)用滅菌的冰水重懸浮細胞，先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。
[0041]10)照上面步驟重復離心，小心棄去上清液。
[0042]11)照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞。
[0043]12)離心，棄上清液。
[0044]13)用20 mL滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞。
[0045]14)照上面步驟離心，小心棄去上清液(沉淀可能會很松散)。
[0046]15)用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2~3 mL。
[0047]16)將細胞按150 μ L等份裝入微量離心管，于-80 °C保存。
[0048](3)pPIC9K_END 質粒構建
I)用限制性內切酶Bgl I1、FspA I分別酶切pPIC9K。限制性內切酶Bgl I1、FspA I(TAkaRA)各 1.5 μ?，提取的 pPIC9K 質粒溶液 6 μ?, IOXK Buffer I μ? 加入到 100 μ? EP管中，在30 °C水浴鍋中酶切60 min。再通過瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的質粒pPIC9K。
[0049]2)序列合成
合成兩端具有Bgl II和FspA I識別序列的序列GGAGATCTTCTAGACC -釀酒酵母TDH31啟動子序列-釀酒酵母分泌信號肽編碼序列-煙曲霉纖維素內切酶編碼序列-釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸編碼序列-釀酒酵母TDH3終止子序列-GGTGCGCACCC-GGTGCGCACCC，各片段及全長片段如SEQ ID N0.1~6所示。
[0050]3)連接
合成的堿基序列 20 μ?，酶切的 PPIC9K 質粒 5 μ?, IOXbuffer 5 μ?, ddH20 ΙΟμ?, Τ4DNA連接酶(Takara) 5μ?加入100 μ? EP管中，16 °C連接過夜。
[0051]4)將上述連接產物電轉化到大腸桿菌DH5 α，電轉化具體方法如下:
4.1)在冰上解凍大腸桿菌DH5 α感受態細胞添加I~10 μ L連接產物，冰上放置約5分鐘。
[0052]4.2)轉移連接產物/細胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器中。
[0053]4.3)加載電轉儀 P1000，準備好 300 yLLB 或 2XYT。
[0054]4.4)對電穿孔容器進行脈沖(200歐姆，25 μ F，2.5千伏)，檢查時間常數，應該在3以上。
[0055]4.5)立即添加300 μ L的LB或2ΧΥΤ至電轉杯中。
[0056]4.6)37 °C下培養細胞40分鐘至I小時以復蘇。
[0057]4.7)復蘇后離心棄掉150 μ L上清，剩余150 μ L重懸菌體涂布到含有氨芐(100Kg/mL)的LB或2XYT培養 基的固體平板上，于37 °C培養過夜。[0058]5)挑去固體平板上生長的單克隆，通過培養，提取質粒，用Bgl II和FspA I對質粒進行酶切鑒定，鑒定正確的質粒再進一步測序，得到質粒PPIC9K-END。
[0059](4)酵母感受態細胞的制備
I)挑一環酵母菌(SMD1168)接種于5 mL YEPD培養基中，30 V 250~300 rpm培養過夜得到一級種子。
[0060]2)取I mL—級種子分別接種于兩瓶50 mL YEPD培養基中，30 V 250~300 rpm培養約 16 ~18 h (0D600 約 1.3 ~1.5)。
[0061]3)于4 °C離心收集菌體，用25 mL冰預冷無菌水洗滌一次后，細胞用10 mL冰預冷無菌水重懸，可換成較小的離心管。
[0062]4)加入I mL pH 7.5的10XTE緩沖液，搖晃均勻，再加入I mL IOXLiAc,旋轉搖勻，于30 1:輕輕搖動45 min。
[0063]5)再加入0.4 mL I mol/L DTT，并同時旋轉搖動，于30 °〇輕輕搖動15 min。
[0064]6)于4 °C離心，棄上清(用槍吸)，再用25 mL冰預冷無菌水洗滌。
[0065]7) 2.5 mL冰預冷的 I mol/L山梨醇洗滌，離心收集菌體，棄上清(用槍吸)。
[0066]8)每管用100 μ L I mol/L山梨醇溶解，分裝管中(80 μ L/管)，于_70°C冰箱保存。
[0067](5 ) pPIC9K-END質粒電轉化酵母
I)向酵母感受態細胞中加入約5~10 μ g (體積小于10 μ L)pPIC9K-END質粒，用槍吹吸均勻，轉移至預冷的電轉杯中，靜置5min。
[0068]2)擦干電轉杯，電擊，電擊參數:1.5 KV，25 yF，200歐姆。
[0069]3)立即加入I mL冰預冷的I mol/L山梨醇，轉移至離心管中，于30 °C靜置lh。
[0070]4)離心，棄上清，加入I mL YEPD后，于30 °C>200 rpm培養2 h。
[0071]5)離心得菌體后，吸除550 μ L上清液，然后取150 μ L涂100 Pg/mL氨芐YETO板于30 °C培養至長出轉化子。
[0072](6)酵母轉化子發酵
挑取的轉化子在YEPD培養基中30 °C培養24 h，以10%接種量(v/v)接種于發酵培養基(酵母浸膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，50 mM檸檬酸緩沖液，麩皮200 g/L，羥甲基纖維素20 g/L，I L/JO中。發酵在500 mL搖瓶中發酵，裝液量為20% (v/v)。在發酵培養基中培48 h。
[0073](7)纖維素內切酶的回收
發酵液在離心機中4000 r/m離心10 min，收集上清(上清中有游離的內切酶，用于內切酶回收率的計算)，按酵母沉淀濕重與蒸餾水質量比1:10的比例加入蒸餾水，用蒸餾水洗滌兩次，收集酵母沉淀，纖維素內切酶固定在酵母表面。
[0074]內切酶酶活測定:以羥甲基纖維素為底物，在50 °C進行酶降解反應。在25 mL試管中加入10 mL含有20 g/L pH 5.0的羥甲基纖維素檸檬酸緩沖液(羥甲基纖維素溶于pH
5.0的0.05 M檸檬酸緩沖液)，再加入離心后上清液20 mL或酵母沉淀0.1 g，在水浴鍋中50 °C保溫30 min，然后用沸水煮沸5 min。用DNS法測定還原糖的含量。
[0075]酶活定義為:每分鐘釋放出I Mmol還原糖所需要的酶量。
[0076]內切酶回收率(％)=酵母沉淀的酶活/ (上清液的酶活+酵母沉淀的酶活)X 100%。
[0077]經過測定內切酶的回收率達到86%，發酵后內切酶的酶活達到8.5 U/g濕酵母。內切酶較高的回收率，說明在發酵的時候，構建的酵母能很好的富集濃縮纖維素內切酶，實現了發酵和濃縮的一步完成。
[0078]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.用于構建具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，其特征在于:包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、煙曲霉纖維素內切酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列。
2.根據權利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的序列分別如SEQID N0.1~5所示。
3.根據權利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的DNA片段的序列如SEQIDN0.6所示。
4.用于構建具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株的質粒，其特征在于:為包含權利要求1-3任一項所述的DNA片段的真核表達質粒。
5.根據權利要求4所述的質粒,其特征在于:所述的真核表達質粒為pPIC9K質粒。
6.根據權利要求4所述的質粒，其特征在于:通過包含如下步驟的方法制備得到:合成兩端有限制性內切酶識別位點含有權利要求1-3任一項所述的DNA片段的序列，通過限制性內切酶連接到真核表達質粒上。
7.根據權利要求6所述的質粒,其特征在于:所述的真核表達質粒為pPIC9K質粒時，限制性內切酶為Bgl II和FspA I。
8.一種具有生產和回收纖維素內切酶雙重功能的酵母菌株，其特征在于:包含權利要求4-7任一項所述的質粒。
9.根據權利要求8所述的酵母菌株，其特征在于:所述的酵母菌株為酵母菌株SMDl168。
10.權利要求8或9所述的酵母菌株的構建方法，其特征在于包括如下步驟:制備酵母電轉化感受態細胞，將權利要求4-7任一項所述的質粒通過電轉化轉進酵母中得到。
【文檔編號】C12N15/81GK103555720SQ201310579729
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年11月19日
【發明者】薛棟升, 汪江波, 蔡鳳嬌, 曹敬華, 陳茂彬, 方尚玲, 鎮達 申請人:湖北工業大學