通過(guò)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記預(yù)測(cè)田間褐飛虱繁殖力的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種通過(guò)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記預(yù)測(cè)田間褐飛虱繁殖力的方法,其步驟如下:(1)采集褐飛虱雌蟲,抽提單頭基因組DNA;(2)以上述DNA為模板,用引物分別擴(kuò)增含ACE-862、VGR-816和VG3087三個(gè)SNP的片段;(3)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,獲得每只雌蟲的三個(gè)SNP的基因型;(4)將上述獲得的SNP信息代入預(yù)測(cè)模型,算出單頭褐飛虱的繁殖力。利用本發(fā)明的方法,能夠快速準(zhǔn)確預(yù)測(cè)褐飛虱種群的繁殖力,節(jié)省人力物力,縮短實(shí)驗(yàn)周期。
【專利說(shuō)明】通過(guò)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記預(yù)測(cè)田間褐飛虱繁殖力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種預(yù)測(cè)田間褐飛虱繁殖力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國(guó)乃至全世界最重要的糧食作物,其產(chǎn)量直接關(guān)系到糧食安全。褐飛虱(Nilaparvata Iugens)是水稻的重要害蟲,適應(yīng)性強(qiáng),致害性變異大,其長(zhǎng)翅型具有長(zhǎng)距離的遷飛能力,已有報(bào)導(dǎo)歷史上曾多次暴發(fā)成災(zāi),造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,糧食安全也受到威脅(程遐年等,2003)。褐飛虱種群數(shù)量的預(yù)測(cè)包括長(zhǎng)中期預(yù)測(cè)和短期預(yù)測(cè)。長(zhǎng)中期預(yù)測(cè)主要是利用歷年田間蟲情數(shù)據(jù)、馬爾可夫鏈理論和氣象資料等進(jìn)行分析。種群數(shù)量的短期預(yù)測(cè)主要是根據(jù)遷入蟲量、存活率和增殖倍數(shù)等來(lái)進(jìn)行。然后,由于褐飛虱本身的遺傳差異也能影響繁殖力,這些預(yù)測(cè)模型存在著局限性。已有研究表明,個(gè)體之間的遺傳差異可導(dǎo)致其繁殖力有顯著區(qū)別,例如,抗吡蟲啉(殺蟲劑)的褐飛虱的種群增長(zhǎng)趨勢(shì)指數(shù)只有對(duì)殺蟲劑敏感的褐飛虱的約10%。短翅型雌蟲繁殖力比長(zhǎng)翅型要高。因此,如何有效地預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)褐飛虱,從而實(shí)現(xiàn)有效控制,有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]種群調(diào)節(jié)的機(jī)制是種群生態(tài)學(xué)的核心。主要有內(nèi)源性和外源性調(diào)節(jié)假說(shuō)。迄今對(duì)昆蟲種群動(dòng)態(tài)的研究主要集中在外源性調(diào)節(jié)因子的作用,如天敵、殺蟲劑、宿主植物和溫度等,對(duì)內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子對(duì)種群動(dòng)態(tài)的影響,尤其是昆蟲本身的遺傳調(diào)節(jié)的研究很少。
[0004]為了研究種群動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)和害蟲防控,首要的是研究昆蟲種群繁殖力調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。已經(jīng)有很多學(xué)者在通路和基因水平對(duì)昆蟲繁殖力進(jìn)行研究(Kirschbauml985;Thomaset al.2000;Fu et al.2010;Tan et al.2013)。另外,隨著研究的深入,分子標(biāo)記,包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、線粒體DNA(mtDNA)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、微衛(wèi)星和簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間(ISSR),也被用于昆蟲自然篩選、種群動(dòng)態(tài)和繁殖力方面的研究。作為新一代的分子標(biāo)記,單核苷酸多`態(tài)性(SNP)也在生態(tài)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。但是,至今還沒(méi)有通過(guò)SNP預(yù)測(cè)昆蟲種群繁殖力的研究報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)以上要解決的技術(shù)問(wèn)題,提供一種能夠有效預(yù)測(cè)田間褐飛虱繁殖力的方法。
[0006]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]—種通過(guò)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記預(yù)測(cè)田間褐飛虱繁殖力的方法,其步驟如下:
[0008](I)采集褐飛虱雌蟲,抽提單頭基因組DNA ;
[0009](2)以上述DNA為模板,用引物分別擴(kuò)增含ACE-862、VGR-816和VG3087三個(gè)SNP的片段;
[0010](3)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,獲得每只雌蟲的三個(gè)SNP的基因型;
[0011](4)將上述獲得的SNP信息代入以下預(yù)測(cè)模型,算出單頭褐飛虱的繁殖力,全部蟲子的平均繁殖力即為該種群的繁殖力:[0012]Y=212.735-93.585*ACE_862+36.087*VGR_816+48.276*VG3087
[0013]其中,因變量Y是單頭褐飛虱繁殖力,自變量ACE-862、VGR-816和VG3087分別是位于ACE、VgR和Vg基因上的SNP的加性、顯性或隱性效應(yīng)的賦值;ACE-862的三種基因型CC、CA和AA分別取值0、0、1 ;VgR-816的三種基因型AA、AG和GG分別取值0、1、2 ;VgR3087的兩種基因型GG和GA分別取值O、I。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的方法,所述步驟(2)中,所用的引物為:
[0015]ACE-862-F514:5’ -CGCTATCTGCTTTGTTGAATG-3’ ;
[0016]ACE-862-R985:5’ -CACCGAATGAACCACCCTC-3’ ;
[0017]VGR-816-F565:5’ -TCACCACAATTCTGCCTCC-3’ ;
[0018]VGR-816-R1173:5’ -CAGCCTGAAATTCGGAAAG-3,;
[0019]VG3087-F188:5’ -CGCTCACATCGACAAACTAT-3’ ;
[0020]VG3087-R774:5’ -TACAATGCCTCACAATCCC-3,。
[0021]本發(fā)明的有益效果:在常規(guī)的生物測(cè)定褐飛虱種群繁殖力的方法中,通常需要20-30天的時(shí)間,而且需要占用比較大的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地,消耗大量的人力物力,而且最后知道繁殖力后,第二代的褐飛虱已經(jīng)大量繁殖蔓延,給防治帶來(lái)很大困難。利用本發(fā)明的方法,從田間采集樣本后,通過(guò) 一天時(shí)間就可以獲得這些樣品的SNP信息,并快速算出褐飛虱種群的繁殖力,從而大大節(jié)省了人力物力,縮短實(shí)驗(yàn)周期,也為后續(xù)有效地褐飛虱防治,如指導(dǎo)農(nóng)藥的使用量,提供了現(xiàn)實(shí)的依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法作進(jìn)一步的詳述,以更好地理解本發(fā)明。
[0023]一、采集褐飛虱雌蟲,抽提單頭基因組DNA。
[0024]從田間采集30頭以上褐飛虱雌蟲(剛遷飛到田里),進(jìn)行單頭基因組DNA的抽提。抽提DNA以Genomic DNA Isolation Kit (OMEGA, USA)試劑盒為例。抽提步驟如下:
[0025]1.取蟲子在液氮中研磨充分,+500ul Buffer GTC/2-Me ;
[0026]2.劇烈渦旋15s (細(xì)胞裂解的越充分,釋放出來(lái)的核酸就越多),室溫靜置2_3min,最長(zhǎng)可以延長(zhǎng)到5min ;
[0027]3.13, OOOxg 離心 5min ;
[0028]4.轉(zhuǎn)移上清液至HiBind? DNA Column 中,13,OOOxg 離心 Imin ;
[0029]5.將步驟 4 中的HiBind? DNA Column 套在 2ml 收集管中,加 500ul Buffer HB 到柱子中,13, OOOxg離心Imin ;棄濾液;
[0030]6.加 700ul DNA Wash buffer (稀釋后)到柱子中,13,OOOxg 離心 lmin,棄濾液;
[0031]7.將柱子套回收集管,12,OOOxg離心2min,干燥柱子;
[0032]8.將柱子轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管,加50-100 μ I Elution Buffer (可以二次洗脫,一次加 20-30 μ I, Elution buffer 可以預(yù)熱至 55-65 度),室溫放置 2min, 13, OOOxg 離心 lmin。
[0033]二、PCR 擴(kuò)增
[0034]以上述的DNA為模板,用三對(duì)引物分別擴(kuò)增含三個(gè)SNP的片段,引物分別為
[0035]ACE-862-F514:5’ -CGCTATCTGCTTTGTTGAATG-3’ ;[0036]ACE-862-R985:5’ -CACCGAATGAACCACCCTC-3’ ;
[0037]VGR-816-F565:5, -TCACCACAATTCTGCCTCC-3,;
[0038]VGR-816-R1173:5’ -CAGCCTGAAATTCGGAAAG-3,;
[0039]VG3087-F188:5’ -CGCTCACATCGACAAACTAT-3,;
[0040]VG3087-R774:5’ -TACAATGCCTCACAATCCC-3,。
[0041]在0.2mlPCR離心管中加入下列試劑:
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種通過(guò)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記預(yù)測(cè)田間褐飛虱繁殖力的方法,其步驟如下: (1)采集褐飛虱雌蟲,抽提單頭基因組DNA; (2)以上述DNA為模板,用引物分別擴(kuò)增含ACE-862、VGR-816和VG3087三個(gè)SNP的片段; (3)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,獲得每只雌蟲的三個(gè)SNP的基因型; (4)將上述獲得的SNP信息代入以下預(yù)測(cè)模型,算出單頭褐飛虱的繁殖力,全部蟲子的平均繁殖力即為該種群的繁殖力:
Y=212.735-93.585*ACE_862+36.087*VGR-816+48.276*VG3087其中,因變量Y是單頭褐飛虱繁殖力,自變量ACE-862、VGR-816和VG3087分別是位于ACE、VgR和Vg基因上的SNP的加性、顯性或隱性效應(yīng)的賦值;ACE-862的三種基因型CC、CA和AA分別取值0、0、1 ;VgR-816的三種基因型AA、AG和GG分別取值0、1、2 ;VgR3087的兩種基因型GG和GA分別取值O、I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(2)中所用的引物為: ACE-862-F514:5’ -CGCTATCTGCTTTGTTGAATG-3’ ;
ACE-862-R985:5’ -CACCGAATGAACCACCCTC-3’ ;
VGR-816-F565:5’ -TCACCACAATTCTGCCTCC-3’ ;
VGR-816-R1173:5’ -CAGCCTGAAATTCGGAAAG-3’ ;
VG3087-F188:5’ -CGCTCACATCGACAAACTAT-3’ ;
VG3087-R774:5’ -TACAATGCCTCACAATCCC-3’。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602741SQ201310586677
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】張文慶, 孫仲享, 翟一凡, 張鑒清, 康奎, 邱潔琪, 沈嘉煒 申請(qǐng)人:中山大學(xué)