基于rna和dna雙外參實時定量pcr的表達校準值的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR策略的基因表達校準值的檢測方法，包括：選定外參基因；配制外參基因的RNA與DNA的預混合液；樣品中加入預混合液，收集樣品RNA和DNA；實時定量熒光PCR，檢測待測基因和內參基因RNA拷貝數、內參基因DNA拷貝數以及外參基因RNA和DNA拷貝數，計算得到內參基因的表觀表達水平后，再根據公式得到待測基因的表達校準值。本發明還公開了上述方法在PCR?array以及表達譜芯片檢測分析技術中的應用。本發明將基因的表觀表達水平概念和檢測方法與傳統表達檢測體系相結合，以更少的檢測反應、更低廉的成本實現更精確的基因表達水平檢測，修正由內參基因真實表達水平在不同樣本間不恒定所造成的檢測結果的不準確。
【專利說明】基于RNA和DNA雙外參實時定量PCR的表達校準值的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學及生物信息學領域，具體涉及一種改進的、基于RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR的基因表達校準值的檢測方法。
【背景技術】
[0002]自從1970年克里克提出分子生物學的中心法則以來，人們對于基因的轉錄表達和及其調控的機制進行了大量的研究。Northern雜交方法是最早用來測定基因轉錄水平的方法。后來,結合逆轉錄和聚合酶鏈式反應產生的RT-PCR(reverse transcription-PCR,即:逆轉錄-聚合酶鏈式反應)提供了一種靈敏而又簡便的半定量測定方法。近年來，實時定量聚合酶鏈式反應(簡稱為:qPCR)方法由于其靈敏、準確和重復性好，因此逐步成為基因表達的定量測定的主流方法。
[0003]上述方法為了減少由于RNA不穩定和逆轉錄的效率問題產生的誤差，通常將待測基因的轉錄水平表示為與一個參考值(內參基因RNA水平、細胞內總RNA水平)的相對表達量。內參通常為看家基因，如:β-actin、GAPDH以及rRNA等。然而，眾所周知，不同組織、或同一組織在不同條件下，細胞的總RNA量和/或內參的量并不恒定，因此，基于該前提所進行的基因轉錄水平檢測往往不夠精確。針對這一問題，我們曾經提出RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法[1](專利號:ZL200910049306.5)，檢測基因在某個時刻、某個細胞狀態下的RNA和DNA的比值，確定待測基因的表觀表達水平。
[0004]然而在“RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法”中，針對每個待測基因都需要同時檢測其RNA和DNA水平，因此檢測反應需要加倍，成本大大增加，限制了它的可推廣性。如何將“RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法”與傳統技術平臺進行整合和改良，以合理的成本獲得更加可靠的基因表達數據，是目前亟待解決的技術問題。

【發明內容】

[0005]為了解決上述技術問題，本發明提出的基于RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR策略的基因表達校準值的檢測方法，是在傳統基因表達檢測體系的基礎上，運用我們曾經提出的專利“ RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法” [1](專利號:ZL200910049306.5)，增加檢測原有體系中內參基因的轉錄產物拷貝數和基因拷貝數，以及外參基因的轉錄產物拷貝數和基因拷貝數，計算內參基因的表觀表達水平，進而對所有待測基因的表達值進行校準，從而得到所有待測基因的表達校準值。
[0006]本發明的目的之一是提供一種改進的、基于RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR策略的基因表達校準值的檢測方法，得到待測基因的表達校準值，包括步驟如下:
[0007]I)選定外參基因，制備外參基因的RNA與DNA，配制外參基因的RNA與DNA的預混合液；其中，所述外參基因的選定原則及預混液的配制原則與專利“RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法及其應用”(專利號:ZL200910049306.5)中的原則一致。[0008]2)將步驟I)制備的預混合液與待測樣品混合，分別抽提總RNA和總DNA ；
[0009]3)總RNA進行逆轉錄合成第一條cDNA鏈；
[0010]4)對cDNA組分和總DNA組分分別進行實時定量熒光PCR擴增。除測定待測基因和原有檢測體系中內參基因的RNA拷貝數外，進一步測定內參基因的DNA擴增產物的拷貝數、以及外參基因的RNA和DNA擴增產物的拷貝數，根據如下公式計算得到內參基因的表觀
表達水平:
[0011]
【權利要求】
1.基于RNA和DNA雙外參實時定量PCR的表達校準值的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)選定外參基因，配制外參基因的RNA與DNA的預混合液； 2)將步驟I)制備的預混合液與待測樣品混合，分別抽提總RNA和總DNA； 3)總RNA進行逆轉錄合成第一條cDNA鏈； 4)對cDNA組分和總DNA組分分別進行實時定量熒光PCR擴增，測定擴增后的待測基因的RNA擴增產物拷貝數、內參基因的RNA擴增產物拷貝數、內參基因的DNA擴增產物的拷貝數、以及外參基因的RNA和DNA擴增產物的拷貝數； 根據如下公式計算得到內參基因的表觀表達水平:
2.如權利要求1所述的檢測方法，應用于芯片檢測平臺，其特征在于，包括如下步驟: 1)選定外參基因，配制外參基因的RNA與DNA的預混合液； 2)將步驟I)制備的預混合液與待測樣品混合，分別抽提總RNA和總DNA； 3)總RNA進行逆轉錄合成第一條cDNA鏈； 4)對總RNA組分進行芯片表達譜實驗； 5)使用實時定量熒光PCR加測芯片檢測體系中內參基因的RNA和DNA擴增產物的拷貝數，以及新增外參基因的RNA和DNA擴增產物的拷貝數，按權利要求1中的公式計算得到內參基因的表觀表達水平，進一步得到表達譜檢測平臺產生的所有待測基因的表達校準值。
【文檔編號】C12Q1/68GK103571964SQ201310594531
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】陸長德, 李園園 申請人:上海生物信息技術研究中心