生物催化動態(tài)動力學(xué)拆分制備r-鄰氯扁桃酸甲酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，公開了一種生物催化動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-鄰氯扁桃酸甲酯的方法，在pH7-8的條件下，聯(lián)用重組消旋酶以及重組酯酶或者聯(lián)用可以分別表達重組消旋酶以及重組酯酶的基因工程菌，以外消旋鄰氯扁桃酸甲酯為底物進行轉(zhuǎn)化，其中，重組消旋酶為重組扁桃酸消旋酶，重組酯酶為重組BioH酯酶。本發(fā)明的優(yōu)點在于，通過聯(lián)用重組消旋酶以及重組酯酶或者含有上述酶的基因工程菌，達到制備目的，工藝簡便，轉(zhuǎn)化效率高，并克服了雙酶系統(tǒng)所帶來的不穩(wěn)定的問題，具有較好的應(yīng)用價值。
【專利說明】生物催化動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-鄰氯扁桃酸甲酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制備R-鄰氯扁桃酸甲酯的生物工程技術(shù)，特別涉及一種生物催化動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-鄰氯扁桃酸甲酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氯吡格雷(Clopidogrel)，化學(xué)名S-α - (2_氯苯基)_6，7_ 二氯噻吩并[3，2_c]吡啶-5(4H)_乙酸甲酯，一種血小板凝集抑制劑，有法國賽諾菲-安萬特公司于1986年研究開發(fā)成功，臨床用其硫酸鹽，商品名Plavix (波立維)，主要用于治療動脈粥樣硬化等心腦血管疾病。2009年該藥品全球銷售額達100億美元，僅次于降血脂藥物阿伐他汀，稱為全球藥品市場排名第二的暢銷藥物。R-鄰氯扁桃酸甲酯是合成氯吡格雷的重要手性物質(zhì)，其經(jīng)磺酸酯化和親核取代合成氯吡格雷的方法，反應(yīng)產(chǎn)率高，產(chǎn)物基本無消旋化。因此，研究R-鄰氯扁桃酸甲酯的手性合成具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]目前為止，R-鄰氯扁桃酸甲酯的合成路線主要包括以下:
[0004](I):從外消旋鄰氯扁桃酸酯化物出發(fā)，酶促水解拆分法獲得單一構(gòu)型的鄰氯扁桃酸甲酯。現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)報道了商品酶CALA可以在水相中水解拆分鄰氯扁桃酸甲酯，但CALA的對映體選擇性差，只有在底物幾乎全部被轉(zhuǎn)化后，底物ee值為99%。Lee等人報道CALA非水相拆分鄰氯扁桃酸甲酯制備光學(xué)純R-鄰氯扁桃酸甲酯(ees>99%)，產(chǎn)物得率41%，E=34.7。該類方法的理論收率僅50%，一定程度上造成了資源的浪費和環(huán)境的污染。
[0005](2)腈水解 酶催化鄰氯扁桃腈水解反應(yīng)，Xu等人利用來自Labrenzia aggregate的腈水解酶為催化劑水解得到R-鄰氯扁桃腈，ee值達96.5%。同時，S-鄰氯扁桃腈能自發(fā)形成外消旋體，繼續(xù)被腈水解酶水解產(chǎn)生R-鄰氯扁桃腈，從而使理論產(chǎn)率達到100%，但是劇毒氫氰酸的使用加大了反應(yīng)危險性。
[0006](3)利用羥腈化酶催化鄰氯苯甲醛與氫氰酸不對稱合成R-鄰氯扁桃腈，再經(jīng)酸水解生成R-鄰氯扁桃酸。如van Langen等人利用商品化的輕腈化酶合成R-鄰氯扁桃腈，產(chǎn)率得率98%，ee值90%。Glieder等人將羥腈化酶交聯(lián)固定化后，酶催化劑可重復(fù)使用10個批次以上。該方法雖然產(chǎn)率高，酶對映體選擇性較好，但同樣劇毒氫氰酸的使用加大了操作難度。
[0007](4)直接不對稱還原鄰氯苯甲酰甲酸甲酯得到R-鄰氯扁桃酸甲酯，該方法理論上可以實現(xiàn)100%的產(chǎn)率。但是由于還原酶催化不對稱還原反應(yīng)通常需要在輔酶存在下才能進行，通過還原酶和輔酶再生酶共表達才有可能解決輔酶再生問題。以共表達重組還原酶和葡萄糖脫氫酶的基因工程菌濕菌體或凍干酶粉為催化劑，不需要添加輔酶就可以制備R-鄰氯扁桃酸甲酯，但不添加輔酶時的催化效果僅為添加lmmol/L輔酶時的50%左右，同時雙酶系統(tǒng)的不穩(wěn)定也增加了工業(yè)化難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中通過還原鄰氯苯甲酰甲酸甲酯得到R-鄰氯扁桃酸甲酯的方法在缺乏輔酶的情況下，無法達到理想產(chǎn)率的缺點，提供了一種無需輔酶的即可實現(xiàn)制備R-鄰氯扁桃酸甲酯的方法。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案:
[0010]生物催化動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-鄰氯扁桃酸甲酯的方法，在PH7-8的條件下，聯(lián)用重組消旋酶以及重組酯酶或者聯(lián)用可以分別表達重組消旋酶以及重組酯酶的基因工程菌，以外消旋鄰氯扁桃酸甲酯為底物進行轉(zhuǎn)化，其中，重組消旋酶為重組扁桃酸消旋酶，重組酯酶為重組BioH酯酶。可選地，上述轉(zhuǎn)化亦可以在聯(lián)用的重組消旋酶以及重組酯酶或者含有上述聯(lián)用的重組消旋酶以及重組酯酶的基因工程菌的共同存在下使用。
[0011]可選地，上述技術(shù)方案所記載的重組扁桃酸消旋酶來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida),重組扁桃酸消旋酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示,或者，也可以在保持該消旋酶的催化活性的前提下，通過變更(所述變更可以包括插入、缺失或者替換)如序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的至少一個氨基酸得到的新的變異氨基酸序列。
[0012]可選地，上述技術(shù)方案中所使用的重組BioH酯酶源自大腸桿菌(Escherichiacoli),重組BioH酯酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示,或者也可以在保持該酯酶的催化活性的前提下，通過變更(所述變更可以包括插入、缺失或者替換)如序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列中的至少一個氨基酸得到的新的變異氨基酸序列。
[0013]作為優(yōu)選，所述外消旋鄰氯扁桃酸甲酯的濃度為10-50mmol/L。
[0014]作為優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在Tris-HCl緩沖溶液中進行反應(yīng)，進一步地，Tris-HCl緩沖溶液的濃度為50-100mmol/L為較佳。
[0015]可選地，上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在20_40°C的溫和條件下反應(yīng)。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)的反應(yīng)溫度為20-30°C，反應(yīng)時間控制在`3-4小時為宜，反應(yīng)結(jié)束后，即可由反應(yīng)溶液中提取R-鄰氯扁桃酸甲酯。
[0016]可選地，如果直接使用通過將基因工程菌培養(yǎng)后得到的酶液，每IOml反應(yīng)體系中添加所述扁桃酸消旋酶酶液的量為0.1-1ml，添加所述BioH酯酶酶液的量為0.l_2ml，上述酶液可以包括分離后得到的酶以及含酶菌體。進一步的優(yōu)選值為，聯(lián)用重組消旋酶以及重組酯酶的添加比例為1:1-4，以1:2為佳，如果聯(lián)用可以分別表達重組消旋酶以及重組酯酶的基因工程菌，其添加比例為1:1-4，以1:2為佳。
[0017]重組載體，含有編碼扁桃酸消旋酶的堿基序列或者含有編碼BioH酯酶的堿基序列；其中，
[0018]所述編碼扁桃酸消旋酶的堿基序列為編碼如序列表中SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的堿基序列；
[0019]所述編碼BioH酯酶的堿基序列為編碼如序列表中SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的堿基序列。
[0020]可選地，所述重組載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如市售的質(zhì)粒，粘粒，噬菌體等均可，優(yōu)選為質(zhì)粒pET30a。
[0021]可選地，將如序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第22_26位氨基酸進行替換得到替換后的氨基酸序列，所述編碼扁桃酸消旋酶的氨基序列為編碼替換后的氨基酸序列的堿基序列；將如序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第123-207位氨基酸進行替換得到替換后的氨基酸序列，所述編碼BioH酯酶的堿基序列為編碼替換后的氨基酸序列的堿基序列。優(yōu)選地，將如序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第26位Val替換為Ile或者Leu，或者將第22位的Val替換為Ile或者Leu ;優(yōu)選地，將如序列表中SEQID NO: 2所示的氨基酸序列的第123位的Leu替換為Ala或者Val，或者將第181位的Leu替換為Ala或者Val,或者將第207位的Leu替換為Val或者Phe。上述替換均可得到目標重組扁桃酸消旋酶和重組BioH酯酶。可以采用突變技術(shù)，將編碼重組扁桃酸消旋酶的堿基序列上的與上述特定位置的氨基酸相對應(yīng)的堿基進行點突變，從而獲得可以編碼重組扁桃酸消旋酶的突變后的堿基序列，或者將編碼重組BioH酯酶的堿基序列上的與上述特定位置的氨基酸相對應(yīng)的堿基進行點突變，從而獲得可以編碼重組BioH酯酶的突變后的堿基序列。
[0022]基因工程菌，包含上述的重組載體。
[0023]作為優(yōu)選，所述基因工程菌可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種微生物，只要能滿足能有效表達本發(fā)明的重組扁桃酸消旋酶和重組BioH酯酶即可，可選地，為大腸桿菌，優(yōu)選為重組大腸埃希氏菌(E.coli)BL21 (DE3)。可以使用現(xiàn)有的方法將含有上述編碼重組扁桃酸消旋酶或者編碼重組BioH酯酶的堿基序列的重組載體導(dǎo)入上述作為宿主細胞的基因工程菌即可。
[0024]上述的基因工程菌在生物催化動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-鄰氯扁桃酸甲酯的應(yīng)用。
[0025]用于培養(yǎng)上述的基因工程菌的方法，包括將權(quán)利要求8所述的基因工程菌接種至卡那霉素的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，當培養(yǎng)液的光密度OD6tltl達到0.5-0.7時(優(yōu)選為0.6)，加入濃度為0.1-lmmol/L (優(yōu)選為0.5mmol/L)的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)后，繼續(xù)誘導(dǎo)4-5小時，將發(fā)酵液離心后，即得上述基因工程菌的濕菌體。其中，卡那霉素的濃度為10-200 μ g/ml，優(yōu)選為50μ g/ml。進一步地，可以通過本領(lǐng)域的各種常規(guī)破碎方法，例如高壓勻漿，珠磨，凍融法等，優(yōu)選超聲破碎，將上述濕菌體破碎或者部分破碎，制成用于制備重組扁桃酸消旋酶或重 組BioH酯酶的酶液。
[0026]上述過程所使用的原料或者試劑除了特別說明之外，均為市售可得。
[0027]本發(fā)明由于采用了以上技術(shù)方案，具有顯著的技術(shù)效果:
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，以上技術(shù)方案的催化效率高，立體選擇性強，完全排除了輔酶的添加，并在不添加輔酶的情況下，仍然可以保持較高的催化效率。其次，克服了現(xiàn)有的使用雙酶系統(tǒng)所帶來的不穩(wěn)定的問題，聯(lián)用的重組消旋酶以及重組酯酶分別通過不同的工程菌各自表達，制備更為簡便，更有利于工業(yè)化的推廣應(yīng)用。最后，以上技術(shù)方案的生成成本低廉，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物的收率和光學(xué)純度均較高，反應(yīng)的環(huán)境友好，操作簡便，尤為適應(yīng)于工業(yè)化的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收的扁桃酸消旋酶基因目標條帶示意圖。
[0030]圖2為利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收的BioH酶酶基因目標條帶示意圖。
[0031]圖3為產(chǎn)物R-鄰氯扁桃酸甲酯的液相色譜譜圖。
[0032]圖4為中間產(chǎn)物外消旋鄰氯扁桃酸的液相色譜譜圖。[0033]圖5為生物催化動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-鄰氯扁桃酸甲酯的反應(yīng)流程示意圖。【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造商建議的條件。
[0035]實施例1、對扁桃酸消旋酶基因的克隆
[0036]根據(jù)NCBI中惡臭假單胞菌Pseudomonas putida的扁桃酸消旋酶基因序列(mdla)，設(shè)計上下游擴增引物及酶切位點EcoR I/Xho I (斜體部分為酶切位點及相應(yīng)的保護堿基)。設(shè)計引物如下:
[0037]引物1:GGAATTC ATGAGTGAAGTACTGATTACCG
[0038]引物2:CCGCTCGAG TTTACACCAGATATTTCCCGATTT
[0039]以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) (ATCC12633,購于美國標準菌種收藏所)的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR體系為IOXDNA polymerase buffer5 μ L,MgCl2(25mmol/L)4y L, dNTPs (lOmmol/L) I μ L,引物 I (10 μ mol/L) I μ L,引物 2(10ymol/L) I μ，基因組模板:約 IOng, Taq DNA polymerase (5U/ μ L) 0.5 μ L,加 ddH20 (即重蒸水)至總體積為50 μ 10
[0040]PCR擴增步驟為:(I)在95°C的條件下，預(yù)變性3min，(2)在95°C條件下，變性45s，
(3)56°C退火 90s，(4)72°C延伸 70s ;步驟(2)- (4)重復(fù) 35 次，(5)72°C繼續(xù)延伸 IOmin,冷卻至VC15PCR所獲得的各`扁桃酸消旋酶基因的擴增子，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收IlOObp左右的目標條帶(如圖1所示)，即得扁桃酸消
旋酶基因。
[0041]實施例2、重組質(zhì)粒pET30a_MR的制備
[0042]將實施例1回收的扁桃酸消旋酶基因目標條帶在37°C條件下用限制性內(nèi)切酶EcoR I/Xho I雙酶切12h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目標條帶。將目標片段在T4DNA連接酶的作用下，與同樣經(jīng)過EcoR I/Xho I雙酶切的質(zhì)粒pET30a，在4°C下連接過夜得到重組質(zhì)粒pET30a_MR。
[0043]實施例3、重組MR突變株的構(gòu)建
[0044]以實施例2得到的重組MR為模板，采用QuickChange方法，在22或者26位點進行定點突變，PCR擴增步驟為:(1)在98°C的條件下，預(yù)變性lmin，(2)在98°C條件下，變性30s，(3) 56°C退火 90s, (4) 72°C延伸 7min ;步驟(2) - (4)重復(fù) 20 次，(5) 72°C繼續(xù)延伸5min，冷卻至4°C。對得到的PCR產(chǎn)物進行清洗，并用Dpn I酶切，消除甲基化模板后，重新轉(zhuǎn)化至E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37°C下倒置培養(yǎng)過夜，挑取單克隆測序驗證，得到重組MR突變株。
[0045]實施例4、對酯酶BioH基因的克隆
[0046]根據(jù)NCBI中大腸桿菌K-12 (Escherichia coli K-12)的酯酶,設(shè)計上下游擴增引物及酶切位點Kpn I/Hind III (斜體部分為酶切位點及相應(yīng)的保護堿基)。設(shè)計引物如下:
[0047]引物1:GGGGTACCAGGATGAATAACATCTGGTG
[0048]引物2: CCCAAGCTTCACCTACACCCTCTGCTTC[0049]以大腸桿菌K-12 (Escherichia coli K-12) (ATCC29425，購于美國標準菌種收藏所)的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR體系為10XDNA polymerase buffer5 μ L,MgCl2(25mmol/L)4y L, dNTPs (IOmmoI/L) I μ L,引物 I (50 μ mol/L) I μ L，引物 2(50ymol/L) I μ，基因組模板:約 IOpmol, polymerase (5U/ μ L) 0.5 μ L,加 ddH20 至總體積為 50 μ I。
[0050]PCR 擴增步驟為:(1)95°C，預(yù)變性 3min，(2) 95°C，變性 45s，(3) 56°C退火 90s，(4)72。。延伸70s ;步驟(2)- (4)重復(fù)35次，(5)72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收750bp左右的目標條帶(如圖2所示)，即BioH酯酶基因。
[0051]實施例5、重組質(zhì)粒pET30a_BioH的制備
[0052]將實施例1回收的BioH酯酶基因目標條帶在37°C用限制性內(nèi)切酶Kpn I/HindIII雙酶切12h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目標條帶。將目標片段在T4DNA連接酶的作用下，與同樣經(jīng)過Kpn I/Hind III雙酶切的質(zhì)粒pET30a，在4°C下連接過夜得到重組質(zhì)粒pET30a-BioH。
[0053]實施例6、重組BioH突變株的構(gòu)建
[0054]以實施例2得到的重組BioH為模板，采用QuickChange方法，在123、181或者207位點進行定點突變，PCR擴增步驟為:(1)在98°C的條件下，預(yù)變性lmin，(2)在98°C條件下，變性 30s, (3)56°C退火 90s，(4)72°C延伸 7min ;步驟(2)- (4)重復(fù) 20 次，(5)72°C繼續(xù)延伸5min，冷卻至4°C，即得到PCR產(chǎn)物進行清洗，并用Dpn I酶切，消除甲基化模板后，重新轉(zhuǎn)化至E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37°C下倒置培養(yǎng)過夜，挑取單克隆測序驗證，得到重組BioH突變株。
[0055]實施例7、重組菌酶液的制備
[0056]分別將實施例3所得重組MR突變株或?qū)嵤├?所得重組BioH突變株接種至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C條件下振蕩過夜，按2%(V/V)的接種量接入裝有100ml LB的培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaC110g/L，調(diào)整pH至7.2)的500ml三角瓶中，37°C，200rpm的條件下?lián)u床過夜，當培養(yǎng)液的OD6tltl達到0.6時，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG為誘導(dǎo)劑，37°C，200rpm的條件誘導(dǎo)4_5h后，將培養(yǎng)液離心，收集細胞，并用PBS (NaC18g/L，KC10.2g/L，Na2HPO4.12H203.63g/L，KH2PO40.24g/L，pH7.4)洗滌細胞兩次，超聲破碎即可得到重組扁桃酸消旋酶酶液和重組BioH酯酶酶液。經(jīng)測定，待細胞完全破碎后，酶液中消旋酶酶濃度可達1.6-3.5mg/ml,酯酶BioH酶濃度可達0.6_2mg/ml。
[0057]實施例8、重組扁桃酸消旋酶和重組BioH酯酶酶液催化鄰氯扁桃酸甲酯制備R-鄰氯扁桃酸甲酯
[0058]反應(yīng)流程如圖5所示，具體為:(1)取0.1-1ml實施例7中所得到的扁桃酸消旋酶酶液，同時取0.l-2ml實施例7中所得到的BioH酯酶酶液(隨著反應(yīng)的進行，所用的酶量逐次均勻減少直至為0，但消旋酶酶液量和酯酶酶液量的比例為1:1-1: 4，優(yōu)選地，以1:2比例較佳)，加入到IOml pH7.0-8.0的Tris-Hcl緩沖液，底物外消旋鄰氯扁桃酸甲酯初始濃度為10-50mmol/L，在20-40°C，200rpm振蕩下反應(yīng)3-4h。(2)反應(yīng)結(jié)束后用乙酸乙酯萃取，萃取兩次，合并萃取液，減壓蒸餾除去乙酸乙酯即得到R-鄰氯扁桃酸甲酯，進行液相色譜的結(jié)果如圖3所示，峰值為R-鄰氯扁桃酸甲酯。(2)將萃取后的下層水相(含有外消旋的鄰氯扁桃酸，進行液相色譜的結(jié)果如圖4所示，峰值為外消旋的鄰氯扁桃酸)通過化學(xué)法重新酯化生成鄰氯扁桃酸甲酯。(3)重復(fù)上述(I)- (2)步驟5-10次后，R-鄰氯扁桃酸甲酯收率可聞達92%。
[0059]為了能夠充分地表征本實施例各種反應(yīng)物對于最后的R-鄰氯扁桃酸甲酯收率的影響，采用不同的實驗條件重復(fù)進行本實施例，所得結(jié)果如下表1所示:
[0060]表1:依據(jù)實施例6制備R-鄰氯扁桃酸甲酯
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種生物催化動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-鄰氯扁桃酸甲酯的方法，其特征在于，在PH7-8的條件下，聯(lián)用重組消旋酶以及重組酯酶或者聯(lián)用可以分別表達重組消旋酶以及重組酯酶的基因工程菌，以外消旋鄰氯扁桃酸甲酯為底物進行轉(zhuǎn)化，其中，重組消旋酶為重組扁桃酸消旋酶，重組酯酶為重組BioH酯酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述外消旋鄰氯扁桃酸甲酯的濃度為10-50mmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在Tris-HCl緩沖溶液中進行反應(yīng)。
4.一種重組載體，其特征在于，含有編碼扁桃酸消旋酶的堿基序列或者含有編碼BioH酯酶的堿基序列；其中， 所述編碼扁桃酸消旋酶的堿基序列為編碼如序列表中SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的堿基序列； 所述編碼BioH酯酶的堿基序列為編碼如序列表中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的堿基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為質(zhì)粒pET30a。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，將如序列表中SEQID N0:1所示的氨基酸序列的第22-26位氨基酸進行替換得到替換后的氨基酸序列，所述編碼扁桃酸消旋酶的氨基序列為編碼替換后的氨基酸序列的堿基序列；將如序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第123-207位氨基酸進行替換得到替換后的氨基酸序列，所述編碼BioH酯酶的堿基序列為編碼替換后的氨基酸序列的堿基序列。`
7.一種基因工程菌·，其特征在于，包含如權(quán)利要求4-6任一所述的重組載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7-8任一所述的基因工程菌在生物催化動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-鄰氯扁桃酸甲酯的應(yīng)用。
10.一種用于培養(yǎng)如權(quán)利要求8所述的基因工程菌的方法，其特征在于，將權(quán)利要求8所述的基因工程菌接種至卡那霉素的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，當培養(yǎng)液的光密度OD6tltl達到·0.5-0.7時，加入濃度為0.1-lmmol/L的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷后，繼續(xù)誘導(dǎo)4_5小時即可。
【文檔編號】C12N15/70GK103820521SQ201310624324
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】于洪巍, 顧佳黎, 胡建波 申請人:浙江大學(xué), 溫州大學(xué)