一種基于trail受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統，是由含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞（A549-pDR5-luc和H157-pDR5-luc）、細胞培養裂解試劑，熒光素酶檢測底物構成。利用本發明提供的抗腫瘤藥物篩選系統，通過測定被篩選化合物作用于A549-pDR5-luc和H157-pDR5-luc細胞中熒光素酶報告基因表達的升高，來篩選促進DR5表達的化合物，實現抗腫瘤藥物的篩選。本發明系統具有實驗周期短，檢測過程快，靈敏度高，應用范圍廣的特點，為高通量的抗腫瘤藥物的篩選提供了新的方法。
【專利說明】一種基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗腫瘤藥物篩選系統，尤其涉及一種基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統。
【背景技術】
[0002]癌癥目前已成為人類最主要的致死疾病之一，嚴重威脅著人們的壽命。我國城鄉居民惡性腫瘤死亡率已屬于世界較高水平，而且呈持續的增長趨勢。中國每年癌癥新發病例為220萬，因癌癥死亡人數為160萬人。其中，肺癌和乳腺癌在過去的30年分別上升了465%和96%。惡性腫瘤已成為我國城市居民的第一位死亡原因，農村居民的第二位死亡原因。因此，我們對于腫瘤預防和治療的研究已刻不容緩。
[0003]化學療法是目前治療癌癥的重要手段之一，尋找安全有效地化療藥物就顯得尤其重要。近年來，分子靶向藥物因其治療作用的高特異性和可以大幅度減低患者發生副作用的風險而成為抗腫瘤研究的熱點。隨著我們對腫瘤細胞中TRAIL受體信號通路的研究不斷深入，發現此通路中的死亡受體DR5是很有潛力的腫瘤治療的新靶標。
[0004]多種腫瘤預防及化療藥物均明顯激活TRAIL受體信號通路，抑制此通路將顯著降低藥物誘導腫瘤細胞凋亡的效率。很多抗腫瘤藥物上調TRAIL受體信號通路中DR5的表達，例如，本實驗室發現蛋白酶體抑制劑硼替佐米(英文名PS-341)就是通過上調DR5的表達，而激活受體介導的凋亡信號通路。本實驗室的工作還證明很多種進入臨床實驗的化療藥物誘導腫瘤細胞凋亡也都需要激活死亡受體信號通路，TRAIL受體信號通路能否被激活也直接影響著腫瘤化療的效果。
[0005]隨著生物技術的發展，以及對人類疾病的分子機制認識的加深，一種以特定藥物靶點為基礎的篩選方法，也就是基于靶點藥物的研究方法已經取代了傳統的非特異性的方法。其中，利用工程改造的細胞進行靶向藥物篩選是最具有吸引力的一種方法。這種體外檢測方法需要弄清楚特定的靶分子所引發的特定細胞行為工程，而且還需要建立一種易于檢測產物量的方法，比如用靈敏度較高的熒光素酶(Luciferase)或綠色熒光蛋白GFP作為報告基因等。
[0006]基于細胞的篩選方法與體外篩選方法相比有很多顯著的優點。第一，不需要純化靶蛋白，這就大大節省了成本和時間。第二，在細胞中，靶蛋白的構象、活性以及生物學功能更能接近于生理學狀態。因此，經過篩選得到的先導化合物具有更高的可靠性。經檢索，目前并沒有基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統的報道。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于提供一種基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統。
[0008]為了達到上述目的，本發明是通過以下技術方案來實現:
[0009]本發明所述的一種基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統是由含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞、細胞培養裂解試劑，熒光素酶檢測底物構成。[0010]上述含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞優選含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的非小細胞肺癌細胞A549，命名為:A549-pDR5-luc ;或是含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的非小細胞肺癌細胞H157，命名為:H157-pDR5-luc ;所述細胞培養裂解試劑為promega公司的熒光素酶檢測系統中的細胞培養裂解試劑，主要是對細胞進行裂解；熒光素酶檢測底物為promega公司的熒光素酶檢測系統中的熒光素酶檢測底物，其在熒光素酶作用下被氧化，并發出生物熒光。
[0011]上述的基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統在篩選抗腫瘤藥物中的應用。
[0012]本發明提供的抗腫瘤藥物篩選系統利用TRAIL受體信號通路作為新的抗腫瘤藥物篩選的靶標，根據TRAIL受體信號通路中標志蛋白DR5的表達情況來預測藥物殺傷腫瘤細胞的效果，以期建立快速高效的抗腫瘤藥物篩選系統。在應用過程中，是通過測定被篩選化合物作用于A549-pDR5-luc或H157-pDR5-luc細胞中熒光素酶報告基因表達的升高，來篩選促進TRAIL受體DR5表達的化合物，即抗腫瘤藥物，因此本發明可以高效的對化合物進行篩選，確定它們是否有抗腫瘤作用。
[0013]本發明所述的基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統在篩選抗腫瘤藥物中的應用具體步驟是:
[0014]I)選擇所構建的A549-pDR5-luc或H157-pDR5_luc細胞以6X IO4個/孔細胞接種于含5%血清的RPM1640培養基的24孔板中，在37°C，5%C02，飽和濕度的培養箱中培養24—48h ；
[0015]2)選取待篩選的化合物，根據其特性先溶解為ImM — IOmM濃度的溶液，然后將溶解好的化合物按終濃度是O — 40 μ M的梯度濃度加入到步驟I)培養的細胞中，同時每種濃度設置3個平行孔，然后處理6 — 12h ；
[0016]3)待處理結束時，棄掉各孔中的細胞培養基，再用PBS清洗一次細胞，然后每孔中加入200— 250 μ L細胞裂解液，使裂解緩沖液完全覆蓋細胞，并在4°C靜置，裂解處理30—40min ；
[0017]4)充分吹打裂解后的細胞，將所有的細胞碎片和液體轉移至離心管中，在4°C的離心機中，13000±500rpm 下離心 2—5min ；
[0018]5)取15 μ L離心后樣品的上清液與10 μ L熒光素酶檢測底物共放入熒光光度計試管中混勻并使其反應；
[0019]6)將反應后的試管放入熒光光度計中進行檢測，記錄數據并求取平均值，根據檢測的數值判斷該待篩選的化合物是否有抗腫瘤活性；當待篩選的化合物藥物處理組的檢測數值減去對照組的檢測數值大于5000時，說明該待篩選的化合物能明顯誘導DR5啟動子的活化，預示該化合物為潛在的抗腫瘤化合物。所述對照組的檢測數值對于A549-pDR5-luc細胞，空白對照組數值一般為4000±500 ;對`于H157-pDR5-luc細胞，空白對照組數值一般為 8000 ±500。
[0020]其中:上述待篩選的化合物是合成化合物、天然產物、有機小分子、無機小分子、月旨類、糖類中的一種或幾種。
[0021]上述待篩選的化合物進一步優選從天然植物中提取的化合物2’-羥基，4’，5’- 二甲氧基查爾酮(DHMC)或豆蘧明(Cardamonin)。[0022]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
[0023]1.本發明系統是一種基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統，目前已證明多種腫瘤預防及化療藥物均明顯激活TRAIL受體信號通路，激活此通路將顯著上調藥物誘導腫瘤細胞凋亡的效率，因此以TRAIL受體作為靶標，基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統，具有很高的可靠性和適應性。
[0024]2.本發明系統不需要純化靶蛋白，這就大大節省了成本和時間，具有極高的新穎性和實用性。另外在細胞中的靶蛋白的構象、活性以及生物學功能更能接近于生理學狀態，因此，經過篩選得到的先導化合物也具有很高的可靠性。
[0025]3.本發明系統是利用熒光素酶作為報告基因，用熒光光度計Luminometer檢測熒光素酶報告基因的活性，反映細胞中DR5的活化情況，進而反映該藥物的抗腫瘤作用，因此
更直接，靈敏度較高。
[0026]4.本發明系統可應用于篩選各種化合物，包括合成化合物、天然產物、有機小分子、無機小分子、脂、糖類等等，也可以用于檢測多種藥物聯合的作用，應用范圍廣，具有極大的靈活性。
[0027]5.本發明系統實驗周期短，檢測過程快速。
[0028]6.本發明系統同時也適合于高通量的抗腫瘤藥物的篩選，可以將細胞接種在96孔板，然后用帶有自動注射器的 多孔板發光儀器來檢測熒光素酶報告基因的活性，高效快速。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是DR5啟動子的PCR結果。
[0030]圖2 是 H157 細胞中轉染質粒 pGL3-Basic 或 pGL3-pDR5，然后用 O，IOOnmo 1/LPS-341處理8h后，用熒光光度計檢測細胞中熒光素酶報告基因活性。
[0031]圖3是DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的PCR結果。
[0032]圖4是DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因連在pGM_T載體上的酶切驗證結果。
[0033]圖5是DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因連在慢病毒載體上的酶切驗證結果。
[0034]圖6 是 0，IOOnmoI/L PS-341 作用于 A549_pDR5_luc 和 H157-pDR5_luc 細胞 8h 后，用熒光光度計檢測細胞中熒光素酶報告基因的活性。
[0035]圖7 是用不同濃度的 DHMC，Cardamonin 處理 A549_pDR5_luc 和 H157-pDR5_luc 細胞8h后，用熒光光度計檢測細胞中熒光素酶報告基因的活性。
【具體實施方式】
[0036]下面結合附圖和實施對本發明做詳細描述，但所述內容是對本發明的解釋而不是限定。
[0037]實施例1
[0038]本發明所述基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統由含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞、細胞培養裂解試劑，熒光素酶檢測底物構成，所述的細胞主要是通過分子克隆技術和慢病毒表達系統構建而成。
[0039]上述基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統構建及應用步驟是:
[0040]1)DR5啟動子基因的克隆
[0041]以A549細胞的cDNA為模板，根據invitrogen公司PCR試劑盒說明書，利用PCR技術克隆DR5啟動子基因(如圖1)。然后在T4DNA連接酶的作用下與pGM-T載體在16°C連接16h后，按照分子克隆實驗指南制備大腸桿菌DH5a感受態細胞，將I μ L的連接產物加入到
10μ L感受態細胞中，混勻，冰浴30min，42°C熱激90s，加入500 μ L的無氨芐青霉素抗性的LB液體培養基，37°C振搖lh，然后均勻的涂布在含氨芐青霉素的LB固體培養基上，37°C培養過夜；之后挑取單克隆劃線，利用菌落PCR、酶切等技術初步鑒定陽性克隆，送測序公司測序，得到的測序結果如SEQ.N0.1所示，測序結果與基因庫(NCBI)中比對，序列一致性為100%，含有正確序列的質粒被命名為T-pDR5。
[0042]2) DR5啟動子基因與熒光素酶報告基因的融合
[0043]利用限制性內切酶將T-pDR5中的DR5啟動子基因酶切下來，產物用1.0%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收DR5啟動子基因并純化。經過酶切且膠回收純化的DR5啟動子基因與載體pGL3-Basic片段在T4DNA連接酶的作用下在16°C連接16h后，按上述步驟轉化大腸桿菌DH5 α ;然后利用菌落PCR，酶切等技術進行初步鑒定，挑選陽性克隆，命名為pGL3-pDR5。然后根據Roche公司的X-tremeGENE HP DNA轉染試劑的說明書轉染H157細胞,對pGL3-pDR5質粒進一步驗證:
[0044]第一天:胰酶消化并計數H157細胞，并將它們接種在24孔板中，使其在第二天轉染時密度在30— 60%之間，在37°C，5%C02,飽和濕度的培養箱中培養過夜；
·[0045]第二天:在0.5mL離心管中加入200μ L無血清Opt1-MEMsI培養基，然后依次加入I μ g 質粒 pGL3-Basic 或 pGL3_pDR5 與 2 μ L X-tremeGENE HP DNA 轉染試劑，混勻；靜置 15分鐘；在靜置期間，去掉H157細胞中舊的培養基，并換上600 μ L含5%血清的RPM1-1640培養基；15分鐘后，將復合物逐滴加入到Η157細胞中，4一8h后將舊的培養基換成2mL含5%血清的RPM1-1640培養基。
[0046]第三天:轉染24h后，在培養基中分別加入0，100nmol/L的PS-341，每組處理設三個平行，處理8h。
[0047]8h處理后，棄掉舊的細胞培養基，并用PBS清洗一次，然后每孔加入200 μ L細胞培養裂解試劑(Promega，Cat.#E1531);將細胞在4°C靜置，裂解30min，然后充分吹打細胞，將裂解后的細胞碎片和液體轉移至0.5mL的離心管中，并在4°C的離心機中，13200rpm下離心2min ;然后取15 μ L的樣品的上清液與10 μ L熒光素酶檢測底物(Promega，Cat.#E1501)在熒光光度計試管中混勻，使其反應；將盛混合物的試管放入熒光光度計中進行檢測，記錄數據并取平均值。結果顯示如圖2所示，轉染了 pGL3-pDR5質粒的細胞相對于轉染pGL3-Basic的細胞中熒光素酶的活性提高了 3倍左右，具有非常明顯的差異，而且PS-341處理后，熒光素酶的活性明顯增加，這說明DR5啟動子基因已經成功與熒光素酶報告基因相融合，而所用于轉染的pGL3-pDR5質粒是正確的。
[0048]3)將DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因克隆到慢病毒表達載體上
[0049]以pGL3_pDR5為模板，根據invitrogen公司PCR試劑盒說明書，利用PCR技術克隆DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因(如圖3)。然后在T4DNA連接酶的作用下與PGM-T載體在16°C連接16h后，按上述步驟轉化大腸桿菌DH5 α ;然后利用菌落PCR，酶切(如圖4)等技術初步鑒定陽性克隆，送測序公司測序，測序結果與DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因進行比對，序列一致性為100%，正確序列的質粒被命名為T-pDR5-luc。
[0050]用限制性內切酶消化質粒，繼而酶切產物(DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因)用1.0%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因并純化。經過酶切且膠回收純化的目的片段與慢病毒表達載體片段在T4DNA連接酶的作用下在16°C連接16h后，按照分子克隆實驗指南制備大腸桿菌stabl3感受態細胞，將IyL的DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因與慢病毒表達載體的連接產物加入到10 μ L感受態細胞中，冰浴30min，42°C熱激90s，加入500 μ L的無氨芐青霉素抗性的LB液體培養基，37 °C振搖Ih，然后均勻的涂布在含氨芐青霉素的LB固體培養基上，28 °C培養過夜，然后挑取單克隆劃線，第二天利用菌落PCR或者提取質粒后酶切(如圖5)等技術，鑒定陽性克隆，并命名為 lent1-pDR5_luc。
[0051]4)制備含DR5啟動子與突光素酶報告基因的融合基因的病毒
[0052]使用Invitrogen公司ViraPower?慢病毒表達系統進行制備病毒:
[0053]第一天:
[0054]在離心管中配置如下溶液:
[0055]溶液A:將 9 μ g 的 ViraPower?Packaging Mix 和 3 μ g 的 lent1-pDR5_luc 質粒稀釋到1.5mL無血清的Opt1-MEMwI培養基中 ，混勻；
[0056]溶液B:將 36 μ L Lipofectamine?2000，稀釋到 1.5mL 無血清的 Opt1-MEM ? 培養基中，混勻；靜置5min ；
[0057]混合溶液A和溶液B，輕輕混勻，室溫靜置20min，使其形成DNA-Lipofectamine?2000 復合物；在 DNA-Lipofectamine?2000 復合物形成的 20min 內，膜酶消化293FT細胞，用含血清的DMEM培養基重懸細胞使其密度為1.2 X IO6個/mL (不要加抗生素);待20min后，將DNA-Lipofectamine?2000復合物加入到已含有5mL有血清的DMEM培養基的IOcm的培養皿中，混勻；然后加入5mL293FT的細胞懸液，混勻；在37°C，5%C02，飽和濕度的培養箱中培養過夜。
[0058]第二天:
[0059]去掉含有DNA-Lipofectamine?2000復合物的培養基，并換上IOmL不加抗生素的有血清DMEM培養基，在37°C，5%C02，飽和濕度的培養箱中培養過夜。
[0060]第三天或第四天:
[0061]在轉染后48h — 72h內收獲病毒，將培養基轉移至15mL無菌離心管中，4°C，3000rpm離心15min去除沉淀，建議用Millex-HV0.45 μ m的過濾器過濾含病毒的上清液。然后分裝到1.5mL的離心管中，如有需要則進行濃縮，儲存在_80°C。
[0062]5)含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞的制備
[0063]①感染細胞
[0064]第一天:胰酶消化并計數A549和H157細胞，然后將它們接種在6孔板中，使其在第二天感染時密度在30— 60%之間，在37°C，5%C02,飽和濕度的培養箱中培養過夜。
[0065]第二天:去掉A549和H157細胞中舊的培養基，加入ImL病毒懸液和ImL新的含5%血清的RPM1-1640培養基，并同時加入Polybrcneii，使其終濃度為6 μ g/mL,混勻；在37°C，5%C02,飽和濕度的培養箱中培養過夜。
[0066]第三天:去掉含病毒的培養基，換上2mL新鮮的含血清的RPM1-1640培養基，在370C，5%C02,飽和濕度的培養箱中培養過夜。
[0067]②篩選
[0068]第四天:加入合適濃度的Blasticidin進行篩選(一般為5—10 μ g/mL);每間隔3-4天，換上含有Blasticidin的新鮮的RPM1-1640培養基；
[0069]在經過10 —12天的篩選后，可見很多細胞集落，這些集落為Blasticidin抗性的，很有可能是含有DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞。
[0070]接下來可以用有限稀釋法對上述細胞進行進一步篩選:抗性集落消化下來后將其按每孔I個細胞種在96孔板中，在37°C，5%C02，飽和濕度的培養箱中培養；第二天尋找每孔中只有一個細胞的孔，等細胞長滿整個孔后，胰酶消化，傳至大孔培養，并凍存，細胞分別命名為 A549-pDR5-luc 和 H157-pDR5_luc。
[0071]6)含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞的鑒定
[0072]將篩選得到的A549-pDR5-luc和H157-pDR5_luc細胞分別接種在24孔板中，第二天用PS-341( lOOnmol/L)處理細胞，每組設3個平行。處理8h后，棄掉舊的細胞培養基，并用PBS清洗一次，然后每孔加入200 μ L細胞培養裂解試劑；將細胞在4°C靜置，裂解30min，然后充分吹打細胞，將裂解后的細胞碎片和液體轉移至0.5mL的離心管中，并在4°C的離心機中，13200rpm下離心2min ;然后取15 μ L的樣品的上清液與10 μ L熒光素酶檢測底物在熒光光度計試管中混勻，使其反應；將盛混合物的試管放入熒光光度計中進行檢測，記錄數據并求取平均值。經檢測，在重組細胞中，PS-341處理組較空白組的熒光素酶活性有明顯提高(如圖6)，說明DR5的啟動子活性增強，因此確定該細胞為含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞，即為基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選的細胞。
[0073]7)基于TRAIL受體信號通路對抗腫瘤藥物的篩選
[0074]上述篩選到的含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞與細胞培養裂解試劑，熒光素酶檢測底物共同構成本發明所述的系統。本系統在篩選抗腫瘤藥物應用時包括如下步驟:
[0075]①第一天，選擇所構建的A549-pDR5-luc或H157-pDR5_luc細胞以6 X IO4個/孔細胞接種于24孔板中，兩種細胞都是用含5%血清的RPM1640培養基培養，在37°C，5%C02，飽和濕度的培養箱中培養過夜；
[0076]②第二天，選取待篩選的化合物(待篩選的化合物可以是合成化合物、天然產物、有機小分子、無機小分子、脂、糖類等等)，根據化合物特性對其進行溶解(濃度一般為ImM—10mM)。然后將溶解好的化合物原則按終濃度是0、5、10、15、20、25、30、35、40μΜ的梯度濃度加入到步驟①中接種的細胞中，同時每種濃度設置3個平行孔，處理時間為6 — 12h ;隨時觀察細胞，如果發現細胞有大量死亡，可以降低該化合物的處理濃度。
[0077]本步驟待篩選的化合物以從天然植物中提取的化合物2’ -羥基，4’，5’ - 二甲氧基查爾酮(DHMC)和豆蘧明(Cardamonin)為例，它們的檢測濃度經試驗摸索都設定為0，10yM,20yM,^h?8ho
[0078]③待處理結束時，棄掉各孔中細胞培養基，用PBS清洗一次，然后每孔加入200 μ LlX細胞裂解液，并保證裂解緩沖液完全覆蓋細胞；
[0079]④將細胞在4°C靜置，裂解30min，然后充分吹打細胞，將裂解后的細胞碎片和液體轉移至0.5mL的離心管中，并在4°C的離心機中，13200rpm下離心2min ；
[0080]⑤然后取15 μ L的樣品的上清液與10 μ L熒光素酶檢測底物在熒光光度計試管中混勻，使其反應；
[0081]⑥將⑤反應后的試管放入熒光光度計中進行檢測，記錄數據并求取平均值，根據檢測的數值判斷該化合物是否有抗腫瘤活性。一般來說，當藥物處理組的檢測數值減去對照組(藥物濃度為零)的檢測數值大于5000時，說明該藥物能明顯誘導DR5啟動子的活化，即該藥物為潛在的抗腫瘤化合物。對于A549-pDR5-luc細胞，空白對照組數值一般為4000±500，當藥物處理組的數值大于9000時，我們認為該藥物為潛在的抗腫瘤化合物；對于H157-pDR5-luc細胞，空白對照組數值一般為8000±500，當藥物處理組的數值大于13000時，我們認為該藥物為潛在的抗腫瘤化合物。
[0082]本實施例檢測的DHMC, Cardamonin兩種化合物作用于A549_pDR5_luc和H157-pDR5-luc細胞時，熒光素酶的檢測結果如圖7所示，我們可以看到DHMC和Cardamonin處理明顯提高了突光素酶的活性(DHMC和Cardamonin處理組都較空白組數值增加了 5000以上)，說明DHMC和Cardamonin具有潛在的抗腫瘤活性。
[0083]進一步的，通過蛋白質免疫印跡等方法也驗證DHMC可以誘導DR5依賴的細胞凋亡，具有良好的抗腫瘤活性 。此結果也證明本發明所述抗腫瘤藥物篩選系統的可靠性和實用性。
【權利要求】
1.一種基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統，其特征在于:所述系統由含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞、細胞培養裂解試劑，熒光素酶檢測底物構成。
2.根據權利要求1所述的基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統，其特征在于:所述含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的細胞是含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的非小細胞肺癌細胞A549，命名為:A549-pDR5-luc ;或是含DR5啟動子與熒光素酶報告基因的融合基因的非小細胞肺癌細胞H157，命名為:H157-pDR5-luc ;所述細胞培養裂解試劑為promega公司的熒光素酶檢測系統中的細胞培養裂解試劑；所述熒光素酶檢測底物為promega公司的熒光素酶檢測系統中的熒光素酶檢測底物。
3.權利要求2所述的基于TRAIL受體信號通路的抗腫瘤藥物篩選系統在篩選抗腫瘤藥物中的應用，步驟是: 1)選擇所構建的A549-pDR5-luc或H157-pDR5_luc細胞以6XIO4個/孔細胞接種于含5%血清的RPM1640培養基的24孔板中，在37°C，5%C02，飽和濕度的培養箱中培養24—48h ； 2)選取待篩選的化合物，根據其特性先溶解為ImM— IOmM濃度的溶液，然后將溶解好的化合物按終濃度是O — 40 μ M的梯度濃度加入到步驟I)培養的細胞中，同時每種濃度設置3個平行孔,然后處理6— 12h ； 3)待處理結束時，棄掉各孔中的細胞培養基，再用PBS清洗一次細胞，然后每孔中加入200—250 μ L細胞裂解液，使裂解緩沖液完全覆蓋細胞，并在4°C靜置，裂解處理30—40min ； 4)充分吹打裂解后的細胞，將所有的細胞碎片和液體轉移至離心管中，在4°C的離心機中，13000 ±500rpm 下離心 2—5min ； 5)取15μ L離心后樣品的上清液與10 μ L熒光素酶檢測底物共放入熒光光度計試管中混勻并使其反應； 6)將反應后的試管放入熒光光度計中進行檢測，記錄數據并求取平均值，根據檢測的數值判斷該待篩選的化合物是否有抗腫瘤活性；當待篩選的化合物藥物處理組的檢測數值減去對照組的檢測數值大于5000時，說明該待篩選的化合物能明顯誘導DR5啟動子的活化，預示該化合物為潛在的抗腫瘤化合物。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于:所述待篩選的化合物是合成化合物、天然產物、有機小分子、無機小分子、脂類、糖類中的一種或幾種。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于:所述待篩選的化合物是從天然植物中提取的化合物2’ -羥基，4’，5’ -二甲氧基查爾酮(DHMC)或豆蘧明(Cardamonin)。
6.如權利要求3所述的應用，其特征在于:所述對照組的檢測數值對于A549-pDR5-luc細胞，空白對照組數值一般為4000±500 ;對于H157-pDR5-luc細胞，空白對照組數值一般為 8000 ±500。
【文檔編號】C12Q1/02GK103627779SQ201310634548
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】蘇玲, 劉相國, 徐林艷, 楊麗娜 申請人:山東大學