體外腭器官三維培養方法
【專利摘要】本發明公開一種體外腭器官三維培養方法，是取胚胎腭發育前期或發育期眶下緣至口角部的全部組織，包埋在水凝膠支架中；添加培養液進行三維培養。可提供近似體內的三維生長環境，避免使用昂貴材料和工藝，具有操作簡單、成本低等優點，此外，通過改變水凝膠支架的組成可調控腭板組織的生物學特性，適合胚胎發育不同時期的正常及異常腭板組織培養，可用于腭裂形成機制研究及促腭板形成藥物的篩選。
【專利說明】體外腭器官三維培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞、分子生物學等領域，尤其是一種可實現腭板組織長期高活性的體外腭器官三維培養方法。
【背景技術】
[0002]唇腭裂是新生兒中較為常見的發育畸形，而腭裂的動物又難于在出生后存活，為了研究腭板的發育過程以及腭板融合的機理，腭板組織的體外培養是十分必要的。目前，腭板組織體外培養方法只有靜態培養和動態培養兩種:靜態培養方法是將腭板放置于多孔膜上，并添加培養基進行靜態培養；動態培養方法是在培養液流動狀態下進行懸浮培養。但是，無論是哪種培養方法，目前腭板在體外的最長的培養時間僅為80小時。

【發明內容】

[0003]本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種可實現腭板組織長期高活性的體外腭器官三維培養方法。
[0004]本發明的技術解決方案是:一種體外腭器官三維培養方法，是取胚胎腭發育前期或發育期眶下緣至口角部的全部組織，包埋在水凝膠支架中；添加培養液進行三維培養。
[0005]所述胚胎是嚙齒類、卵生類、魚類、哺乳類動物的胚胎。
[0006]所述胚胎是藥物誘導腭裂動物、基因敲除腭裂動物或自發性腭裂動物的胚胎。
[0007]所述胚胎組織的發育時間為4~8天。
[0008]所述水凝膠支架為Matrigel基質膠支架、膠原水凝膠支架、透明透明質酸/膠原復合水凝膠支架或海藻酸鹽水凝膠支架。
[0009]所述Matrigel基質膠是稀釋倍數等于I的被稀釋Matrigel基質膠。
[0010]所述膠原水凝膠為I型、II型膠原的至少一種，分子量為3(T1000kDa，濃度為10mg/ml。
[0011]所述透明透明質酸/膠原復合水凝膠是氧化透明質酸與膠原反應形成的復合水凝膠。
[0012]所述海藻酸鹽水凝膠支架包括塊狀以及直徑為0.1~δαιι的微球，由海藻酸鈉溶液與鈣、鋇、鋅二價陽離子溶液固化所形成；濃度為0.3-4% (w/v);鈣、鋇、鋅二價陽離子溶液濃度為5~200mM ;固化時間5-40min。
[0013]所述海藻酸鹽水凝膠是海藻酸鈉與精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾海藻酸鈉的混合物。
[0014]本發明利用水凝膠作為腭板組織(上顎、鼻中隔下部與周圍組織)培養的三維支架，可提供近似體內的三維生長環境，避免使用昂貴材料和工藝，具有操作簡單、成本低等優點，此外，通過改變水凝膠支架的組成可調控腭板組織的生物學特性，適合胚胎發育不同時期的正常及異常腭板組織培養，可用于腭裂形成機制研究及促腭板形成藥物的篩選。【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發明實施例1培養正常小鼠腭板組織的樣本明場及HE染色照片。
[0016]圖2為本發明實施例1稀釋1倍及2倍Matrigel基質膠三維培養正常小鼠腭板組織中維持組織結構、發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數統計圖。
[0017]圖3為本發明實施例1稀釋1倍及2倍Matrigel基質膠三維培養正常小鼠腭板組織中雙側腭板間縫隙面積的統計圖。
[0018]圖4為本發明實施例1稀釋1倍及2倍Matrigel基質膠三維培養正常小鼠腭板組織中凋亡細胞比例的統計圖。
[0019]圖5為本發明實施例2中5mg/ml及10mg/ml膠原水凝膠三維培養自發性腭裂小鼠腭板組織中維持組織結構、發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數統計圖。
[0020]圖6為本發明實施例2中5mg/ml及10mg/ml膠原水凝膠三維培養自發性腭裂小鼠腭板組織中雙側腭板間縫隙面積的統計圖。
[0021]圖7為本發明實施例2中5mg/ml及10mg/ml膠原水凝膠三維培養自發性腭裂小鼠腭板組織中凋亡細胞比例的統計圖。
[0022]圖8為本發明實施例3低含量及高含量氧化透明質酸HA三維培養藥物誘導腭裂小鼠腭板組織中維持組織結構、發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數統計圖。
[0023]圖9為本發明實施例3低含量及高含量氧化透明質酸HA三維培養藥物誘導腭裂小鼠腭板組織中雙側腭板間縫隙面積的統計圖。
[0024]圖10為本發明實施例3低含量及高含量氧化透明質酸HA三維培養藥物誘導腭裂小鼠腭板組織中凋亡細胞比例的統計圖。
[0025]圖11為本發明實施例4未修飾ALG以及RGD修飾ALG三維培養維甲酸(RA)處理小鼠腭板組織中維持組織結構、發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數統計圖。
[0026]圖12為本發明實施例4未修飾ALG以及RGD修飾ALG三維培養維甲酸(RA)處理小鼠腭板組織中雙側腭板間縫隙面積的統計圖。
[0027]圖13為為本發明實施例4未修飾ALG以及RGD修飾ALG三維培養維甲酸(RA)處理小鼠腭板組織中凋亡細胞比例的統計圖。
【具體實施方式】
[0028]實施例1:Matrigel基質膠體外三維培養腭板組織
分離正常小鼠胚胎腭發育期(胚胎期第5天)的面中三分之一組織(取眶下緣至口角部的全部組織，包括上顎、鼻中隔下部與周圍組織，簡稱腭器官)之后分別與無血清DMEM稀釋I倍、2倍的Matrigel基質膠混合，每組10個樣本，放置在培養箱中固化成膠。I小時后，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養液進行培養。以未包埋的小鼠腭板組織作為實驗對照組(10個樣本)。各組均體外培養6天，每兩天更換新鮮培養液。6天后，觀察各組的腭板組織，統計具有正常腭板組織結構，發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數，測量并統計雙側腭板間縫隙面積。另外，將腭板組織置于4%多聚甲醛中固定后制備組織切片，進行TUNEL以及HE染色，統計凋亡細胞密度。
[0029]三維培養正常小鼠腭板組織的樣本明場以及HE染色照片(培養6天，Bar 200 μ m)如圖1所示:圖1A為對照組明場照片；圖1B為對照組HE染色照片；圖1C為稀釋1倍Matrigel基質膠組明場照片；圖1D為稀釋I倍Matrigel基質膠組HE染色照片。
[0030]三維培養正常小鼠腭板組織中維持組織結構、發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數統計圖如圖2所示。
[0031]三維培養正常小鼠腭板組織中雙側腭板間縫隙面積的統計圖如圖3所示。
[0032]三維培養正常小鼠腭板組織中凋亡細胞比例的統計圖如圖4所示。
[0033]實驗結果顯示，與無支架包埋的正常小鼠腭板組織對照組相比，Matrigel基質膠培養組發生了雙側腭板融合(圖1與2)，促進了雙側腭板擴展(圖2)，明顯減小了雙側腭板間縫隙面積(圖3)，顯著降低了凋亡細胞密度(圖4)。另外，還發現稀釋I倍的Matrigel基質膠與稀釋2倍相比，發生融合的樣本數進一步提高，間縫隙面積進一步降低，凋亡細胞密度明顯下降。上述實驗結果說明，利用Matrigel基質膠可實現腭板組織的長期高活性體外培養，并且降低Matrigel基質膠的稀釋倍數能進一步促進腭板組織擴展、融合和提高細胞活性。
[0034]實施例2:膠原水凝膠體外三維培養腭板組織
分離自發性腭裂小鼠胚胎腭發育期(胚胎期第6天)的面中三分之一組織(取眶下緣至口角部的全部組織，包括上顎、鼻中隔下部與周圍組織，簡稱腭器官)，之后分別與濃度為5mg/ml以及10mg/ml的鼠II型膠原(分子量500kDa)溶液混合,每組10個樣本，置培養箱中固化40min，形成直徑2cm，厚度Icm的圓柱形水凝膠，并添加含有10%胎牛血清的DMEM培養液進行培養。以未包埋的自發性腭裂小鼠腭板組織作為實驗對照組(10個樣本)。各組均體外培養6天，每兩天更換新鮮培養液。6天后，觀察各組的腭板組織，統計具有正常腭板組織結構，發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數，測量并統計雙側腭板間縫隙面積。另外，將腭板組織置于4% 多聚甲醛中固定后制備組織切片，進行TUNEL以及HE染色，統計凋亡細胞密度。
[0035]三維培養自發性腭裂小鼠腭板組織中維持組織結構、發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數統計圖如圖5所示。
[0036]三維培養自發性腭裂小鼠腭板組織中雙側腭板間縫隙面積的統計圖如圖6所示。
[0037]三維培養自發性腭裂小鼠腭板組織中凋亡細胞比例的統計圖如圖7所示。
[0038]實驗結果顯示，與無支架包埋自發性腭裂小鼠腭板組織對照組相比，膠原水凝膠培養較好地保持了腭板組織的結構，促進了雙側腭板擴展(圖5)，雙側腭板間縫隙面積明顯減小(圖6)，凋亡細胞密度明顯降低(圖7)。另外還發現，10mg/ml的膠原凝膠與5mg/ml相比，腭板組織結構維持、雙側腭板擴展得到了進一步提高，雙側腭板間縫隙面積進一步降低，凋亡細胞密度明顯下降。這些實驗結果說明，利用膠原水凝膠可實現腭板組織的長期高活性體外培養，并且提高膠原濃度能促進自發性腭裂小鼠腭板組織的結構維持、雙側腭板的擴展及細胞活性的提高。
[0039]實施例3:氧化透明質酸/膠原復合水凝膠支架體外三維培養腭板組織
將牛透明質酸鈉(分子量1100 kDa)配制成10 mg /ml的水溶液，按透明質酸鈉/高碘酸鈉體積比4:1加入20mM高碘酸鈉溶液，25°C避光條件下攪拌反應5h，然后透析，最后進行冷凍干燥，獲得氧化透明質酸。
[0040]配制0.9% (w/v)膠原溶液，并將此膠原溶液、DMEM培養基及NaOH-NaHCO3-1fepes緩沖液按照7:2:1 (v/v)比例混合，再將0.6% (w/v)氧化透明質酸水溶液按照10:1以及30:1 (v/v)(溶液:氧化透明質酸水溶液)混合，緩慢攪拌，將混合液置于4°C冰箱靜置24h0
[0041]分離藥物誘導腭裂小鼠胚胎腭發育期(胚胎期第5天)的面中三分之一組織(取眶下緣至口角部的全部組織，包括上顎、鼻中隔下部與周圍組織，簡稱腭器官)，之后分別與上述兩種混合液按1:1、1:3比例混合，分別為低含量及高含量氧化透明質酸HA，每組10個樣本，置培養箱中固化20min，并添加含有10%胎牛血清的DMEM培養液進行培養。以未包埋的基因敲除腭裂小鼠腭板組織作為實驗對照組(10個樣本)。各組均體外培養6天，每兩天更換新鮮培養液。培養6天后，觀察各組的腭板組織，統計具有正常腭板組織結構，發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數，測量并統計雙側腭板間縫隙面積。另外，將腭板組織置于4%多聚甲醛中固定后制備組織切片，進行TUNEL以及HE染色，統計凋亡細胞密度。
[0042]三維培養藥物誘導腭裂小鼠腭板組織中維持組織結構、發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數統計圖如圖8所示。
[0043]三維培養藥物誘導腭裂小鼠腭板組織中雙側腭板間縫隙面積的統計圖如圖9所
[0044]三維培養藥物誘導腭裂小鼠腭板組織中凋亡細胞比例的統計圖如圖10所示。
[0045]結果顯示，與無支架包埋的基因敲除腭裂小鼠腭板組織對照組相比，氧化透明質酸/膠原復合水凝膠支架較好地保持了腭板組織的結構，促進了雙側腭板擴展(圖8)，雙側腭板間縫隙面積明顯減小(圖9)，凋亡細胞密度明顯降低(圖10)。另外還發現，含有較高濃度氧化透明質酸的水凝膠進一步維持了腭板組織結構，促進了雙側腭板擴展，縮小了雙側腭板間縫隙面積，下調了凋亡細胞的密度。這些實驗結果說明，利用透明質酸水凝膠支架可實現腭板組織的長期高活性體外培養，并且改變透明質酸的濃度能調控腭板組織的相關生物學特性。
[0046]實施例4:海藻酸鈣水凝膠支架體外三維培養腭板組織
首先，制備精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾的海藻酸鈉。將海藻酸鈉(分子量500kDa，古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比2)溶解于含有0.5M NaCl的0.1M 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液中(pH值6.5)，得到1%(W/V)海藻酸鈉溶液。再加入1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和RGD多肽，室溫攪拌反應24小時。EDC和海藻酸鈉摩爾比為1:20，EDC和sulfo-NHS摩爾比為2:1, RGD多肽和海藻酸鈉質量比為1:1000。然后進行透析并冷凍干燥，從而得到RGD修飾的海藻酸鈉。
[0047]將RGD修飾以及未修飾的海藻酸鈉粉末分別溶解于生理鹽水中，得到1.5%(ff/V)的海藻酸鈉溶液。
[0048]分離20個維甲酸(RA)處理小鼠胚胎腭發育期(胚胎期第5天)的面中三分之一組織(取眶下緣至口角部的全部組織，包括上顎、鼻中隔下部與周圍組織，簡稱腭器官)小鼠的腭板組織(胚胎期第6天)，之后分別與上述兩種海藻酸鈉溶液混合，每組10個樣本，再滴加到200 mmol.!/1 CaCl2溶液中，室溫鈣化30min，形成直徑2cm的海藻酸鈣凝膠微球。之后，使用含有10%胎牛血清的DMEM培養液洗滌3次，最后置于培養箱中進行靜態培養6天，每兩天更換培養液。以RA處理小鼠未包埋的腭板組織作為對照組(10個樣本)。培養6天后，觀察各組的腭板組織，統計具有正常腭板組織結構，發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數，測量并統計雙側腭板間縫隙面積。另外，將腭板組織置于4%多聚甲醛中固定后制備組織切片，進行TUNEL以及HE染色，統計凋亡細胞密度。
[0049]三維培養維甲酸(RA)處理小鼠腭板組織中維持組織結構、發生雙側腭板擴展以及融合的樣本數統計圖如圖11所示。
[0050]三維培養維甲酸(RA)處理小鼠腭板組織中雙側腭板間縫隙面積的統計圖如圖12所示。
[0051]三維培養維甲酸(RA)處理小鼠腭板組織中凋亡細胞比例的統計圖如圖13所示。
[0052]實驗結果顯示，與無支架包埋RA處理小鼠的腭板組織對照組相比，海藻酸鈣水凝膠支架較好地維持了腭板組織的正常結構，顯著促進了雙側腭板擴展(圖11)，減小了雙側腭板間縫隙面積(圖12)，降低了凋亡細胞密度(圖13)。另外，RGD修飾海藻酸鈣水凝膠與未改性支架相比，RA處理腭板組織的擴展明顯提高，雙側腭板間縫隙面積進一步降低，凋亡細胞密度明顯下降。這些實驗結果說明，利用海藻酸鈣水凝膠支架可實現腭板組織的長期高活性體外 培養，并且生物功能化修飾對于腭板組織的生物學行為具有重要的調控作用。
【權利要求】
1.一種體外腭器官三維培養方法，其特征在于:取胚胎腭發育前期或發育期眶下緣至口角部的全部組織，包埋在水凝膠支架中；添加培養液進行三維培養。
2.根據權利要求1所述體外腭器官三維培養方法，其特征在于:所述胚胎是嚙齒類、卵生類、魚類、哺乳類動物的胚胎。
3.根據權利要求2所述體外腭器官三維培養方法，其特征在于:所述胚胎是藥物誘導腭裂動物、基因敲除腭裂動物或自發性腭裂動物的胚胎。
4.根據權利要求1所述的體外腭器官三維培養方法，其特征在于:所述胚胎組織的發育時間為4-8天。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的體外腭器官三維培養方法，其特征在于:所述水凝膠支架為Matrigel基質膠支架、膠原水凝膠支架、透明質酸/膠原復合水凝膠支架或海藻酸鹽水凝膠支架。
6.根據權利要求5所述的體外腭器官三維培養方法，其特征在于:所述Matrigel基質膠是稀釋倍數等于I的被稀釋Matrigel基質膠。
7.根據權利要求5所述的體外腭器官三維培養方法，其特征在于:所述膠原水凝膠為I型、II型膠原的至少一種，分子量為3(T1000kDa，濃度為10 mg/ml。
8.根據權利要求5所述的體外腭器官三維培養方法，其特征在于:所述透明質酸/膠原復合水凝膠是氧化透明質酸與膠原反應形成的復合水凝膠。
9.根據權利要求5所述的體外腭器官三維培養方法，其特征在于:所述海藻酸鹽水凝膠支架包括塊狀以及直徑為0.1-5cm的微球，由海藻酸鈉溶液與鈣、鋇、鋅二價陽離子溶液固化所形成；濃度為0.3~4% (w/v);鈣、鋇、鋅二價陽離子溶液濃度為5~200mM ;固化時間5_40mino
10.根據權利要求9所述的體外腭器官三維培養方法，其特征在于:所述海藻酸鹽水凝膠是海藻酸鈉與精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾海藻酸鈉的混合物。
【文檔編號】C12N5/073GK103849594SQ201310657627
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】肖晶, 孫廣煒, 劉洋, 徐小溪, 李楠, 劉波, 叢蔚, 馬小軍 申請人:大連醫科大學