一種預測強直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種預測強直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒，屬于醫學生物【技術領域】。通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試者的TNXB基因SNP位點的基因型，預測受試者對強直性脊柱炎的易感性。本發明的優點是：首次闡述了TNXB基因多態性位點與強直性脊柱炎的相關性，提供了一種預測強直性脊柱炎易感性的方法，該方法可用于強直性脊柱炎的預防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發。
【專利說明】一種預測強直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種預測強直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒，更具體的說是通過測定與AS相關基因TNXB的多態性預測受試者對于強直性脊柱炎的易感性，該方法可用于疾病的輔助診斷、治療和新藥開發，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)是一種自身免疫性疾病，多發于16-40歲的青壯年，男女患病比例約為4~10:1。病變常首先發生于骶髂關節，少數重癥患者表現為整個脊柱強直。此外，部分患者伴有不同程度的髖關節、眼、肺、心血管、腎等脊柱外病變。AS在白種人群中的發病率約為1%~3%，我國AS患病率約為0.2-0.6%，其中60%以上的患者伴有髖關節受累，致使20%以上AS患者殘疾，炎癥主要累及關節囊、肌腱和韌帶的骨附著點，導致局部關節粘連強直，活動受限。臨床上至今尚缺乏可明顯緩解和控制疾病發展的藥物。AS屬多基因疾病，具有明顯的遺傳傾向，雖然通常認為遺傳與免疫因素在AS發病中起主導作用，但確切的病因與發病機制仍不清楚。
[0003]目前進行AS遺傳病因研究，多采用SNP作為基因組標志的關聯分析方法，是有效的，已得到證明。SNP是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，在人群中的頻率需>1%，SNPs是雙等位基因標記，這種單堿基變化中有70.1%為同型堿基之間的轉換:如G/A或T/C，29.1%為發生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C (胞嘧啶)是人類基因組中最易發生變化的位點，因為大多數是甲基化胞嘧啶，能夠自發脫氨基轉換為T (胸腺嘧啶)，SNP包含了已知多態性的80-90%，是最常見的遺傳變異。
[0004]由于生存的選擇壓力導致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區的數量是編碼區的4倍，總數可達3百萬個。SNP以其密度高(平均每Ikb就有I個)、代表性強(位于基因內`部的SNP可能直接影響蛋白質結構或表達水平)、遺傳穩定性好(同微衛星多態性比較而言)、易于自動化分析(因SNP在人群中多為雙等位基因標記，可簡單以“+ / 一或1/0”直接分型)等特點成為很好的遺傳標志。
[0005]1973年，Brewerton等首先發現了與AS強相關的人類白細胞抗原_B27(HLA_B27 )。隨著研究的進展，與AS相關的其他易感基因如腫瘤壞死因子-α (TNF-α )、白介素-1(IL-1)陸續被識別。
[0006]TNXB (Tenascin ΧΒ，肌健蛋白XB)基因位于6q2L 3，全長57053bp，含有42個外顯子，其編碼產物是一種蛋白質，該基因定位于人類白細胞抗原III區域，與免疫反應及自身性免疫疾病發生發展等密切相關。
[0007]目前尚無任何關于TNXB基因與AS相關聯的研究結果。

【發明內容】

[0008]本發明的主要目的是提供一種預測強直性脊柱炎易感性的方法。
[0009]本發明的第二個目的是提供一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑盒，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。
[0010]為實現上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0011]檢測強直性脊柱炎易感性的核酸序列，為序列表SEQ ID N0.1所示堿基序列。其+316位即是rsl41190850變異位點，以字母“R”標示出。該核酸序列為TNXB基因全長序列。圖1為TNXB基因結構及其多態性變異位點的示意圖，附圖中包含有5個外顯子，rsl41190850位點標在TNXB基因圖中第3外顯子區的相應位置。
[0012]一種檢測強制性脊柱炎易感性的方法，檢測受試者TNXB基因第3外顯子區rsl41190850位點的基因型，基因型為AA時，受試者的易感性最低；攜帶G等位基因時，受試者的易感性升高。
[0013]一組檢測強直性脊柱炎易感性的引物，引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ IDN0.2和序列表SEQ ID N0.3所示。可以特異性地擴增出包含有SEQ ID N0.1所示序列中+316 位置(rsl41190850)的產物。
[0014]本發明提供了一種檢測強直性脊柱炎易感性的診斷試劑盒，其中含有本發明特異性擴增TNXB基因rsl41190850的引物對和用于PCR擴增檢測的試劑盒的常規組件、試劑、緩沖液等，本領域技術人員熟知這些常規組件和檢測方法。本發明試劑盒中的全部組分、含量如下:
[0015]一種檢測強直性脊柱炎易感基因的試劑盒，由以下試劑組成:
[0016](I) 10 μ LlOXPCR 緩沖液；
[0017](2 ) 2 μ LlOmMdNTP 混合液；
`[0018](3) 2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ;
[0019](4) IyL Fl弓丨物，為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，濃度為IOpmol/μ L ;
[0020](5) IyL Rl引物，為SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，濃度為IOpmol/μ L ；
[0021](6) 8 μ LlOXLC-Green Plus 飽和熒光染料；
[0022](7)2μ L寡核苷酸內參，由4種內參引物各0.5μ L組成，濃度為lOpmol/μ L，其中低溫寡核苷酸內參上游引物F為SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，低溫寡核苷酸內參下游引物R為SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參上游引物F為SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參下游引物R為SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；
[0023](8) 64 μ L 純水。
[0024]使用方法如下:
[0025](I) PCR擴增:通過PCR擴增TNXB基因的第3外顯子區部分片段，制備混合液:10 X PCR 反應緩沖液 I μ L, 10mM/LdNTP0.2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，10pM/L 上游引物
0.1“1^，10?厘/1下游引物0.1 μ L，I X LC-Green Plus飽和熒光染料0.8 μ L，寡核苷酸內參
0.2yL (高、低溫寡核苷酸內參上、下游引物各0.05 μ L)(序列見表1)，基因組DNAl μ L，加純水至10 μ L。PCR反應條件為95°C預變性5min，95°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸5s,總共45個循環，72°C總延伸2min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復性處理:95°C 30s, 25°C 2min,94°C 30s, 24°C 4min。PCR 前于每一體系中加入 20 μ L 的石蠟油，以防止液體揮發。
[0026](2)基因型判定:將PCR產物移入HRM專用96孔板內，在Light Scanner TMHR-196上進行HRM分析,用Light Scanner Call IT軟件對采集后的曲線進行分析,根據熔解曲線的差異判定基因型。
[0027]TNXB基因第3外顯子區rsl41190850多態性位點在制備診斷或治療強直性脊柱炎的試劑或藥物中的用途。
[0028]本發明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA，樣品來源無限制，如:體液(血液、腹水及尿液等)、組織細胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。調整基因組DNA的濃度，使其盡可能的一致。以基因組DNA為模板，可擴增出含TNXB基因突變位點的核酸片段，以獲取測定的大量樣本。這種通過擴增含TNXB基因變異點的DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測定材料。
[0029]在進行基因輔助診斷時，本發明優先適用于測定根據TNXB基因的突變類型存在的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應于用于測定TNXB基因突變類型的方法。按采用的測定方法來選擇適當的特定試劑，如DNA片段和/或用于PCR擴增步驟的引物。
[0030]本發明的優點是:本發明首次闡明了 TNXB基因多態性位點與AS的相關性，提供了一種預測AS易感性的方法，該方法可用于AS的預防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發。
[0031]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步敘述，以便公眾對
【發明內容】
有更深入的了解，并非對本發明的限制，凡依照本發明公開內容所做的任何本領域的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為TNXB基因結構及其多態性變異位點的示意圖
[0033]圖2為TNXB基因變異位點經HRM方法的基因分型圖
[0034]圖3為TNXB基因變異位點的`測序圖
【具體實施方式】
[0035]用于下列實施例中表示試劑的英文縮寫如下:
[0036]10XPCR 緩沖液:10mM Tris-HCI (pH=8.3), 500mM 氯化鉀(KCl)，IOmM 氯化鎂(MgCl2)70.01%(W/V)白明膠
[0037]dNTP:脫氧核苷三磷酸
[0038]EDTA:乙二胺四乙酸二鈉
[0039]TE: IOmM Tris-HCl (pH=7.5)，ImM EDTA (pH=8.0)
[0040]實施例1:血液樣本收集和基因組DNA的提取:
[0041]一.病例入選:
[0042]按紐約1984年的修訂診斷標準入選病例,共選取來自吉林地區無血緣關系的AS患者136例(年齡:14-44歲，平均24歲)，同地區的健康對照志愿者148例(年齡:39-72歲，平均46歲)。所有受檢者均為漢族且簽署書面知情同意書，這項研究得到衛生部北京醫院，衛生部老年醫學研究所倫理審核委員會的認可，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》:人體醫學研究的倫理原則。
[0043]二.根據下列方法，制備人基因組DNA。[0044]1.在已標號的1.5mLEP管中加1000 μ L紅細胞裂解液，后加入400 μ LEDTA抗凝血(抗凝血加入前顛倒混勻3-5次)，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；
[0045]2.13000rpm離心30秒后，除去上清液；
[0046]3.在所得沉淀中加480 μ L核酸裂解液，彈擊管壁，充分混勻后加入20 μ L蛋白酶K (用裂核液稀釋20倍稀釋蛋白酶K)，顛倒混勻，65°C孵箱10分鐘，(期間不時上下混勻，確保無凝塊);
[0047]4.拿出后降至室溫，加300μ L蛋白沉淀液，充分顛倒混勻，靜置10分鐘，13000rpm離心2分鐘；
[0048]5.將上清液移至新EP管中，加入670 μ L預冷的異丙醇，充分顛倒混勻(10次以上)，可見線狀DNA逐漸形成小團塊，13000rpm離心2分鐘；
[0049]6.棄上清液并確保沉淀留在EP管中，加入670 μ L70%乙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心2分鐘；
[0050]7.棄上清，使管內乙醇揮發干凈；
[0051]8.加入TE溶液(400 μ L)，充分溶解，對提取的基因組DNA進行濃度和純度的分析，吸取部分DNA溶液作為工作液，濃度校正至20ng/ μ L，置于4°C備用，剩余基因組DNA置_20°C冰箱保存。
[0052]實施例2SNP的識別鑒定
[0053]本發明采用PCR-高`分辨率熔解曲線(HRM)分析法和PCR測序技術同時對TNXB基因的第3外顯子區的rsl41190850 (其等位位點為G/A)的基因型進行檢測。
[0054]一.PCR-HRM弓丨物的確定
[0055]從Genebank中查取rs 141190850附近的DNA喊基序列(Seq ID Ns I),引物設計在01igo7.0軟件下完成。目的片段定位在TNXB基因第3外顯子區，全長48bp，確定了正義鏈Fl與反義鏈Rl特異性引物序列如下:
[0056]Fl:5，-CGTGGGCTATGGCGGTGAG-3’ (SEQ ID N0.2)
[0057]Rl:5，-CTGGCTGGAGGCTCTTCCTG-3，(SEQ ID N0.3)
[0058]二.PCR反應體系及反應條件
[0059]通過PCR擴增TNXB基因第3外顯子區部分片段，PCR反應體系為:10XPCR反應緩沖液 I μ L, 10mM/LdNTP0.2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L, 10pM/L 上游引物 0.1 μ L, IOpM/L下游引物0.1 μ L，IOXLC-Green Plus飽和熒光染料0.8 μ L，寡核苷酸內參0.2 μ L (高、低溫寡核苷酸內參上、下游引物各0.05 μ L)(序列見表1)，基因組DNAl μ L，加去離子水至IOyL0 PCR時于每一體系中加入20 μ L石蠟油，防止液體揮發。PCR反應條件為95°C預變性5min，95°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸5s，總共45個循環，72°C總延伸2min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復性處理:95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s,24°C 4min。
[0060]表1:高、低溫寡核苷酸內參引物序列、退火溫度及產物片段長度
[0061]
【權利要求】
1.檢測強直性脊柱炎易感性的核酸序列，其特征在于:為序列表SEQID N0.1所示堿基序列。
2.一種檢測強制性脊柱炎易感性的方法，其特征在于:檢測受試者TNXB基因第I外顯子區rsl41190850位點的基因型，基因型為AA時，受試者的易感性最低；攜帶G等位基因時，受試者的易感性升高。
3.—組檢測強直性脊柱炎易感性的引物，其特征在于:引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID N0.2和序列表SEQ ID N0.3所示。
4.一種檢測強直性脊柱炎易感基因的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成: (1)10 μ LlOXPCR 緩沖液；
(2)2 μ LlOmMdNTP 混合液；
(3)2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ; (4)IyL Fl引物，為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，濃度為10pmol/yL; (5)IyL Rl引物，為SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，濃度為10pmol/yL; (6)8 μ LlOXLC-Green Plus 飽和熒光染料； (7)2 μ L寡核苷酸內參，由4種內參引物各0.5 μ L組成，濃度為IOpmol/μ L，其中低溫寡核苷酸內參上游引物F為SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，低溫寡核苷酸內參下游引物R為SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參上游引物F為SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸·內參下游引物R為SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；
(8)64 μ L 純水。
5.TNXB基因第I外顯子區rsl41190850多態性位點在制備診斷或治療強直性脊柱炎的試劑或藥物中的用途。
【文檔編號】C12N15/11GK103710448SQ201310713079
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】楊澤, 朱小泉, 楊帆, 孫亮, 史曉紅, 唐雷, 原慧萍, 張玉榮, 趙承孝, 趙帆, 王娜娜, 惠娟, 張政 申請人:衛生部北京醫院