具有氨氮降解能力的菌合劑及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有氨氮降解能力的菌合劑，它是由枯草芽孢桿菌CCTCC?M2013490與類球紅細菌CCTCC?M2013491按細菌數1：1的混合物。上述具有氨氮降解能力的菌合劑在降解水體中氨氮的應用以及在治理水產養殖水體中的應用。本發明的一種具有氨氮降解能力的菌合劑，可迅速有效的降低水體中的硝酸鹽、亞硝酸鹽含量，可以改善由于污染造成的水質渾濁問題，水質由渾變清，具有很強的凈化水質功能，具有較強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促進飼料中營養素降解，使水產類動物對飼料的吸收利用更加充分。
【專利說明】具有氨氮降解能力的菌合劑及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物【技術領域】，具體涉及一種具有氨氮降解能力的菌合劑及其應用。
【背景技術】
[0002]隨著我國經濟的發展和人們生活水平的提高，由于工業污水排放、畜禽業養殖污水排放、水產養殖污水排放、生活污水排放等引起的水體氨氮污染有加重的趨勢，不僅會引起水體中藻類及其它微生物大量繁殖，形成富營養化污染，嚴重時會引起水中溶解氧的大量消耗，導致水生動物大量死亡，造成生態破壞和一定程度的經濟損失。在氨的致死、半致死濃度下，氨可引起養殖動物的腎、脾、甲狀腺和血液組織的變化；亞硝酸鹽對養殖動物有很強的毒性，嚴重影響養殖動物的生長、發育。水體中存在的氨氮對養殖的水產品具有一定的毒性，影響了水產品的品質，限制了水產養殖的可持續發展，特別是隨著高密度工廠化養殖技術的推廣，氨氮污染治理的需求日益突出。
[0003]國內外大量研究表明，硝化細菌、光合細菌、芽孢桿菌及諾卡氏菌等均對養殖水體中的氨氮具有較強的去除能力，且光合細菌和硝化細菌已在實踐中取得良好效果[4]。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供具有氨氮降解能力的菌合劑。
[0005] 本發明還要解決的技術問題是提供上述菌合劑的應用。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
[0007]一種具有氨氮降解能力的菌合劑，它是由枯草芽孢桿菌CCTCC No:M2013490與類球紅細菌CCTCC No:M2013491按細菌數1:1的混合物。
[0008]本發明所述的枯草芽孢桿菌是發明人于2012年8月從江蘇省南京市排污口淤泥中分離出來的菌株，經過形態學觀察、生理生化實驗和PCR鑒定，確認為枯草芽孢桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，現已保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國.武漢.武漢大學，郵編430072，保藏編號:CCTCC No:M2013490,保藏日期:2013年10月23日。
[0009]本發明所述的類球紅細菌是發明人于2012年8月從江蘇省南京市污水處理廠活性污泥中分離出來的菌株，經過形態學觀察、生理生化實驗和PCR鑒定，確認為類球紅細菌，其分類命名為類球紅細菌(Rhodobacter Sphaeroides),現已保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國.武漢.武漢大學，郵編430072，保藏編號=CCTCC No:M2013491，保藏日期:2013年10月23日。
[0010]類球紅細菌是一種光合細菌，它與枯草芽孢桿菌均能分解水體有機物、控制水體氮含量，起到凈化水質的作用，并且無污染、高效率，是比較理想的凈化水質的生物制劑。然而在將其應用之前，需要進行一系列的實驗來確定其最佳的使用濃度，目的是為了用最低的投資成本來達到最好的凈化效果。[0011]上述具有氨氮降解能力的菌合劑在降解水體中氨氮的應用。
[0012]上述具有氨氮降解能力的菌合劑在治理水產養殖水體中的應用。
[0013]有益效果:本發明的一種具有氨氮降解能力的菌合劑，可迅速有效的降低水體中的硝酸鹽、亞硝酸鹽含量，可以改善由于污染造成的水質渾濁問題，水質由渾變清，具有很強的凈化水質功能，具有較強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促進飼料中營養素降解，使水產類動物對飼料的吸收利用更加充分。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1水樣中氨氮的質量濃度的標準曲線。
[0015]圖2類球紅細菌氨氮降解的濃度曲線圖。
[0016]圖3枯草芽孢桿菌氨氮降解的濃度曲線圖。
[0017]圖4最佳組合比例氨氮降解的濃度曲線圖。
【具體實施方式】
[0018]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0019]實施例1:
[0020]I材料與儀器
`[0021]1.1菌株來源
[0022]本實驗所需的材料是從污水處理廠活性污泥中篩選分離得到一株類球紅細菌CCTCC No:M2013491，配合常用細菌——枯草芽孢桿菌CCTCC No:M2013490，制備成類球紅細菌合劑。實驗采用的類球紅細菌菌株，保存在LB固體培養基斜面上，保藏于4°C冰箱。
[0023]1.2培養基
[0024]1.2.1LB液體培養基
[0025]蛋白胨10g，酵母粉 lg, NaCLlOg，蒸餾水 1000mL, PH7.2-7.4，121°C滅菌 30 分鐘，4 °C保存備用。
[0026]L2.2LB固體培養基
[0027]蛋白胨10g，酵母粉 lg, NaCLlOg，蒸餾水 lOOOmL，瓊脂 0.42g，PH7.2-7.4，121。。滅菌30分鐘，4 °C保存備用。
[0028]1.2.3氨氮培養基[1](模擬水體)
[0029]葡萄糖5.0g, (NH4)2SO40.25g, NaCLl.0g，K2HP040.5g,MgSO4.7Η200.25g，水 1000mL,pH值7.0，其中氨氮含量約為50mg/L，再取5mL稀釋分裝于50mL細胞培養管中，121°C條件下滅菌15min,待用。
[0030]1.3清洗溶液:
[0031]氫氧化鉀100gjjC IOOmL,乙醇 900mL。
[0032]1.4氨氮測定所需試劑
[0033]蒸餾水、顯色劑(水楊酸-酒石酸鉀鈉溶液)、亞硝基鐵氰化鈉溶液，P =10g/L、次氯酸鈉。若水楊酸未全部溶解可加入數毫升的氫氧化鈉。[0034]1.5主要儀器、設備
[0035]YXQ-LS-755II立式壓力滅菌器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)
[0036]SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)
[0037]MVS-1漩渦混合器(北京東方開物科學器材有限公司)
[0038]立式恒溫振蕩箱IS-RDV3
[0039]可見分光光度計:10~30_比色皿
[0040]滴瓶:其滴管滴出液體積，20滴相當于ImL。
[0041]實驗室常用玻璃器皿:所有玻璃器皿均應用清洗溶液(2.3)仔細清洗,然后用水沖洗干凈。
[0042]2 方法
[0043]2.1菌株的活化
[0044]用接種環挑取類球紅細菌和枯草芽孢桿菌菌株分別接種到LB液體培養基中，35°C，120rpm，搖床培養18_20h后，4°C保存待用。
[0045]2.2活菌計數(傾注平板法)
[0046]用生理鹽水逐級稀釋，選取最后2個適宜的稀釋梯度進行平板傾注，每個梯度設3個平行，培養24h后進行活菌記數。
[0047]2.3菌株的接種[2]
[0048]2.3.1類球紅細菌:
[0049]將活化的類球紅細菌菌株按104_105CFU/ml的活菌量加至氨氮培養基中，35°C，120rpm,分別間隔 O，12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，120h 進行抽樣，最后取其平均值。
[0050]2.3.2枯草芽孢桿菌:
[0051]將活化的枯草芽孢桿菌菌株按104_105CFU/ml的活菌量加至氨氮培養基中，35°C，120印111，分別間隔0，1211，24卜"以此類推抽樣5天(方法同2.3.1)，最后取其平均值。2.3.3類球紅細菌合劑:
[0052]將活化的類球紅細菌和枯草芽孢桿菌菌株按5種不同的比例混合，兩種活菌數加起來在(104-105CFU/ml)之間，每組設兩個平行，加至氨氮培養基中，35°C，120rpm,分別間隔0，1211，24&..以此類推抽樣5天(方法同2.3.1)，最后取其平均值。
[0053]2.4合劑中組合比例的氨氮測定[3]
[0054]在堿性介質(pH=ll.7)和亞硝基鐵氰化鈉存在下，水中的氨、銨離子與水楊酸鹽和次氯酸離子反應生成藍色化合物，在697nm處用分光光度計測量吸光度。
[0055]將類球紅細菌和枯草芽孢桿菌按五種不同的比例混合:3: 1，2: 1，1: 1，1: 2，I: 3，最后根據結果選取一個最佳混合比例。每次抽樣后用水楊酸分光光度法[3]檢測氨氮的濃度。
[0056]2.5結果的計算(用曲線圖表示)
[0057]水樣中氨氮的質量濃度按下式計算:
[0058]P N= (As — Ab — a) XD / bXV
[0059]式中:P N——水樣中氨氮的質量濃度(以N計)mg/L ；
[0060]As——樣品的吸光度(波長為697nm處)；[0061]Ab——空白試驗的吸光度(蒸餾水作參比)；
[0062]a—校準曲線的截距；
[0063]b——校準曲線的斜率；
[0064]V——所取水樣的體積；
[0065]D——水樣的稀釋倍數。
[0066]表1水楊酸分光光度法:標準氨氮濃度在波長697納米處的值
【權利要求】
1.一種具有氨氮降解能力的菌合劑，其特征在于，它是由枯草芽孢桿菌CCTCC No:M2013490與類球紅細菌CCTCC No:M2013491按細菌數1:1的混合物。
2.權利要求1所述的具有氨氮降解能力的菌合劑在降解水體中氨氮的應用。
3.權利要求1所述的具有氨氮降解能力的菌`合劑在治理水產養殖水體中的應用。
【文檔編號】C12R1/125GK103710284SQ201310714344
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】張志成, 沈志遠, 戴鼎震 申請人:金陵科技學院