光合細菌sc01及其快速培養方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及微生物的培養，具體的說是一種光合細菌SC01及其培養方法和應用。光合細菌為類球紅細菌(Rhodobacter?sphaeroides)，已于2013年9月25日在中國微生物保存中心保藏，保藏編號為CGMCC?No.8248。將所述光合細菌SC01作為添加劑用于養殖生物培養過程中，進而使增加養殖生物的攝食量增強，同時降低殘餌率。本發明所述的菌株具有篩選方法簡單易行，生產及儲運方便，使用效果明顯等特點。具有良好的應用前景。
【專利說明】光合細菌SC01及其快速培養方法和應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及微生物的培養，具體的說是一種光合細菌SCOl及其快速培養方法和應用。【背景技術】
[0002]我國的海水養殖業經過數十年的迅猛發展，在沿海經濟乃至國民經濟發展中起著舉足輕重的作用，海水養殖的品種包括魚、蝦、蟹、貝、海參等主要經濟品種。山東是我國海水養殖業大省，以海參養殖為例，2012年山東省海參養殖面積達80萬畝，年產7.1萬噸，占全國海參總產量的一半以上，年產值達160億元。且每年以20%的增長速度發展。
[0003]伴隨海水養殖業的迅猛發展，養殖過程中的病害以及養殖廢水的處理問題日益突出，成為制約行業健康可持續發展的瓶頸之一。特別是養殖廢水長期得不到有效處理而直接排海。由于養殖后的海水中，餌料殘留、養殖生物的糞便等導致的海水中氨氮、亞硝氮、磷酸鹽等營養成分豐富，隨意排海容易引起藻類等有害生物的滋生。當環境條件合適時，一些繁殖迅速的赤潮藻類的爆發，常常引起海水中含氧量的急劇下降，造成養殖海區的養殖生物大量死亡，同時，由于養殖廢水中含有抗生素、清潔劑、殺菌劑等有害物質，隨意排海有可能造成近岸甚至近海生物多樣性減少或消失，引起海底荒漠化等一系列嚴重生態問題。
[0004]因此，基于微生物技術開發一些能夠用于海水養殖的，既有利于養殖生物健康，有能夠進行養殖水質改良的微生態制劑，可以大大緩解上述問題的產生及發展。從而有利于降低養殖消耗，減少排海風險，增加農民收入，促進行業的長期穩定和可持續發展。[0005]光合細菌一類能夠以光作為能源、在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用自然界中的硫化物、氨等有機物作為供氫體兼碳源進行光合作用的微生物。光合細菌是地球上最早出現具有原始光能合成體系的原核生物。在長期的進化過程中，光合細菌形成了自己獨特的代謝系統，在新型藥物、功能酶類、以及環境治理方面具有潛在的科研和應用價值。
[0006]在水產養殖方面，人們已經開始利用光合細菌進行養殖水質的改善和病害控制方面的實踐，但缺乏系統的理論指導。對于菌種選擇、光合細菌的使用量，使用時機等方面目前尚沒有系統的理論指導，在生產及使用過程中仍存在較大的盲目性。

【發明內容】

[0007]本發明目的在于提供一種光合細菌SCOl及其快速培養方法和應用。
[0008]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0009]一種光合細菌SC01，光合細菌分類學命名為類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides),已于2013年9月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.8248，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
[0010]光合細菌SCOl的快速培養方法:
[0011]將光合細菌于快速培養基中，在28-30°C，150-300rpm，自然光照下至0D_到
0.8-1.0 ；
[0012]或，將光合細菌于快速培養基中室溫條件下靜置培養5-7d,并每間隔24h攪拌將培養液混勻，培養至0D_到0.8-1.0 ；[0013]所述快速培養基成分為=K2HPO40.25-0.5g/L，KH2PO40.25-0.5g/L，酵母膏1.5-3.0g/L，NaAc2.0-2.5g/L，NH4Cll.0—1.5g/L，pH值 6.8-7.4，用陳海水定容至 1000mL。
[0014]所述每間隔24h采用攪拌或反轉培養器具的方式將培養液混勻。
[0015]光合細菌SCOl的應用，將所述光合細菌SCOl作為添加劑用于養殖生物培養過程中，進而使增加養殖生物的攝食量增強，同時降低殘餌率。
[0016]本發明光合細菌從大菱鲆育苗廠分離獲得。該光合細菌革蘭氏染色為陰性，無芽孢，無莢膜。在LB平板上，菌落成紅色，圓形，中間凸起，光滑濕潤。對獲得的菌株進行16SrDNA序列測定，采用細菌通用引物27F和1492R進行PCR擴增，取PCR產物2~5 μ I進行lwt%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測.用瓊脂糖凝膠純化試劑盒(購自大連寶生物公司)切膠回收1.5kb大小的PCR產物進行測序分析。菌株的16SrDNA序列測序結果登錄GenBank,并用BLAST與GenBank中的16SrDNA序列進行同源性比較，將得到的相似菌株的16SrDNA,利用MEGA4.0軟件，構建系統發育樹，分析各分離菌株的進化地位。經鑒定:是一種為類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)。于2013年9月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.8248。該菌株16SrDNA的GenBank登陸號為:KF791043。
[0017]本發明所具有的優點:
[0018]本發明所采用的光合細菌對大菱鲆等主要海水養殖經濟動物育苗及養殖具有良好的應用前景。可用于改善因殘餌、糞便等導致的水質惡化問題，降低殘餌率，提高單位時間內養殖動物的重量。同時本發明所述的菌株具有篩選方法簡單易行，生產及儲運方便，使用效果明顯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發明實施例提供的光合細菌SCOl生長曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0020]圍繞本發明所述的菌株及【具體實施方式】做詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0021]實施例1光合細菌的篩選
[0022]1)采樣及處理:分別取大菱鲆育苗廠廠區排水溝底層海水、池壁附著物、池底污泥、育苗及養殖池底層海水、附著物、池壁及池底殘留的污泥Sg，加入100ml的滅菌海水，置于300ml的無菌三角瓶中，充分震蕩15min,去除雜草、巖石等大顆粒物質,制備成樣品懸池液。
[0023]2)富集培養:取樣品懸濁液5mL，加入含有50mL的無菌富集培養基(KH2PO40.5g/L，酵母膏 1.5g/L,胰蛋白胨 0.05g, CaCl0.05g, NaAcl.0g/L, NH4Cl0.2g/L, MnSO40.05g,MgSO40.025g, FeSO40.002g, pH值7.2，用蒸餾水定容至1000mL)的150ml三角瓶中，加入IOml石蠟油，封口膜封口。28°C，20001ux光照培養。每48h觀察培養液顏色變化。此富集培養過程持續至30天。
[0024]3)分離培養:當富集培養液明顯呈現紅色，取2ml，加入50ml的液體分離培養基(K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，酵母膏 1.5g/L，NaAcl.0g/L, NH4Cl0.2g/L，谷氨酸 0.005g，pH 值7.4，用蒸餾水定容至1000mL), 28°C，20001ux光照，300rpm振蕩培養3d，此時培養液經肉眼觀察變成深紅色，取IOOul該培養液涂布在固體分離培養基平板(K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，酵母膏 1.5g/L，NaAcl.0g/L, NH4Cl0.2g/L，谷氨酸 0.005g，瓊脂粉 10g，pH 值 7.4，用蒸餾水定容至1000mL。)上，28°C，20001ux光照，倒置培養7d，選擇紅色菌落，重復在上述固體培養基上劃線分離，至得到菌落形態一致的純培養物，命名為SCOl并保存。經生理生化及16s rDNA分析，確定SCOl為類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)。于2013年9月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.8248。
[0025]實施例2光合細菌SCOl的培養
[0026]將上述實施例獲得的光合細菌進行快速培養，取50ul-80°C凍存的SCOl接種至IOml 快速培養基(K2HPO40.25g/L, KH2PO40.25g/L，酵母膏 3.0g/L, NaAc2.0g/L, NH4Cll.0g/L，pH值6.8，用陳海水(靜置沉淀14天后去除沉淀物)定容至1000mL。)中，28°C，300rpm，自然光照下培養120h至OD6tltl到1.0,以此作為種子液，按照5% (體積比)接種量將種子液接種于快速培養基中，28°C，150rpm，自然光照下培養120h。間隔2h取出培養液測定0D_。繪制SCOl的生長曲線(圖1)。
[0027]利用平板計數法計算單位體積內的菌落形成單位(CFU, colony-forming unit):待SCOl菌液OD600至1.0，取Im用無菌海水按照10_5稀釋，分別取200ul的稀釋液均勻涂布在三個固體快速培養基平板上(在快速培養基中添加1.0-1.2% (質量體積比)的瓊脂粉)，28°C，倒置培養120h。三個培養基平板上分別形成了 18、28、23個紅色菌落。按照公式:CFU/ml=生長菌落的數量/ (用以稀釋的菌液體積X稀釋倍數X涂布液的體積)。即每毫升OD6tltl為1.0的SCOl菌液中菌落的平均數量約為1.3X 107。
[0028]實施例3SC01對殘餌率的影響
[0029]取0D_至1.0的SCOl培養液5ml，添加至50L海水的暫養池中，每個養殖池中放入10條身體全長為6-8cm的健康大菱鲆。室內正常光照，養殖池每分鐘曝氣量為6.5L,養殖用常規復合顆粒餌料(顆粒餌料通常在海水中2h不會解體)的添加量按照每天每池顆粒餌料300粒(約10g)，分3次投加。每次投喂后2h，將養殖池中殘留餌料撈出，清點各養殖池中殘留餌料的數量，計算殘餌率。同時以未添加SCOl培養液的暫養池作為對照，進而觀察發現投加有光合細菌SCOl的養殖池，大菱鲆攝食欲望強烈，出現爭搶餌料的現象，未投加SCOl的養殖池，大菱鲆攝食欲不強，降落至池底的餌料較多。通過計算，投加SCOl的養殖池中殘餌率平均為48%，而未投加SCOl的養殖箱中，殘餌率為64%。
[0030]實施例4SC01對大菱鲆體重的影響
[0031]準備6個裝有50L海水的暫養池，設置3個樣品組和3個對照組，其中樣品組每個養殖池中添加0D_至0.8-1.0的SCOl培養液5ml，對照組加入5ml快速培養基，每個養殖池中放入10條平均體重為7g的健康大菱鲆，室內正常光照。養殖池每分鐘曝氣量為6.5L，每天飼料添加量按照每池8-lOg (顆粒餌料約300粒)，分3次投加。20天后計算體重。結果如表1所示，投加有光合細菌SCOl的養殖池，大菱鲆平均體重為9.90g，未投加SCOl的養殖池,大菱鲆平均體重為8.83g,經分析，投加SCOl組的大菱鲆的體重比不投加SCOl組的體重有明顯差異。說明SCOl可以有效提高單位時間內養殖生物的體重。
[0032]表1scOl添加前后實驗組與對照組中大菱鲆體重的變化
[0033]
【權利要求】
1.一種光合細菌SC01，其特征在于:光合細菌為類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)，已于2013年9月25日在中國微生物保存中心保藏，保藏編號為CGMCCN0.8248。
2.—種權利要求1所述的光合細菌SCOl的快速培養方法，其特征在于: 將光合細菌于快速培養基中，在28-30°C，150-300rpm，自然光照下至OD6tltl到0.8-1.0 ； 或，將光合細菌于快速培養基中室溫條件下靜置培養5-7d，并每間隔24h攪拌將培養液混勻，培養至OD600到0.8-1.0 ； 所述快速培養基成分為=K2HPO40.25-0.5g/L，KH2PO40.25-0.5g/L，酵母膏 1.5-3.0g/L,NaAc2.0-2.5g/L, NH4Cll.0—1.5g/L, pH 值 6.8-7.4，用陳海水定容至 1000mL0
3.按權利要求2所述的光合細菌SCOl的快速培養方法，其特征在于:所述每間隔24h采用攪拌或反轉培養器具的方式將培養液混勻。
4.一種權利要求1所述的光合細菌SCOl的應用，其特征在于:將所述光合細菌SCOl作為添加劑用于養殖生物 培養過程中，進而使增加養殖生物的攝食量增強，同時降低殘餌率。
【文檔編號】C12R1/01GK103740615SQ201310732029
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月26日 優先權日:2013年12月26日
【發明者】欒順香, 焦緒棟, 秦顯明 申請人:萊州市順昌水產有限公司